МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА
БИЧКОВА СОЛОМІЯ ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 612.014.42:612.31:591.431.2
Регуляція внутрішньоклітинних CA2+-транспортувальних систем
малоклітинних травних залоз
03.00.13 – фізіологія людини і тварин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2004
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі фізіології людини і тварин
Львівського національного університету імені Івана Франка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Клевець Мирон Юрійович,
Львівський національний університет
імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України,
завідувач кафедри фізіології людини і тварин
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Янчій Роман Іванович,
Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України,
провідний науковий співробітник відділу імунології та
цитотоксичних сироваток
кандидат біологічних наук
Рибальченко Тарас Володимирович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
науковий співробітник кафедри біохімії
Провідна установа: Національний медичний університет імені
О.О. Богомольця
Захист відбудеться “ 17 ” червня 2004 р. о 1300 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному
університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів,
вул. Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного
університету імені Івана Франка, аудиторія № 333.
З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Львівського
національного університету імені Івана Франка за адресою:
79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.
Автореферат розісланий “ 14 ” травня 2004 р.
Виконуючий обов’язки вченого секретаря
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук,
доцент В.В. МанькоЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. У відповідь на дію зовнішніх стимулів клітини
генерують Са2+-сигнали, які проявляються в коливному і тимчасовому
підвищенні концентрації Са2+ у певних ділянках цитозолю. Під час
ініціації Са2+-сигналів іони Са2+ вивільняються з внутрішньоклітинних
депо, а також надходять у клітину ззовні. Вважали, що ІФ3-чутливі
Са2+-канали є ключовими для вивільнення Са2+ у секреторних клітинах
(Berridge, Irvine, 1984), а наявність ріанодинчутливих Са2+-каналів
тривалий час заперечували. На сьогодні відомо, що до генерації
Са2+-сигналів залученні різні типи каналів вивільнення Са2+ (Petersen et
al., 1999). У секреторних клітинах вищих тварин були ідентифіковані усі
три ізоформи ІФ3-чутливих Са2+-каналів і три ізоформи ріанодинчутливих
Са2+-каналів (Lee et al., 1997; Leite et al. 1999; Zhang et al., 1999;
Fitzsimmons et al., 2000), а також доведено наявність ІФ3-індукованого
вивільнення Са2+ у секреторних клітинах безхребетних (Zimmermann, 1999;
2000). Однак взаємодія між каналами вивільнення Са2+ та іншими
внутрішньоклітинними Са2+-транспортувальними системами, зокрема
мітохондріальними, є не до кінця з’ясована. Відомо, що мітохондрії
перебувають у тісному взаємозв’язку з каналами вивільнення Са2+ з
внутрішньоклітинних депо і реагують на зміни концентрації Са2+ у
цитозолі в стані спокою (Collins et al., 2000; 2001).
Крім того, залишається невивченим регулювання внутрішньоклітинних
Са2+-транспортувальних систем ендогенними чинниками, які можуть
модулювати Са2+-сигнали і визначати подальшу відповідь клітин. Знання
про функціонування внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем
потрібні для розуміння цілісної картини послідовності кальцієвої
відповіді та для уявлення про механізми генерації Са2+-сигналу у
секреторних клітинах, що дасть теоретичне підґрунтя для фармакологічної
корекції патологій секреторних клітин. Тому наша увага була зосереджена
на регулюванні цАМФ-аденілатциклазною, цГМФ-гуанілатциклазною та
Са2+-кальмодуліновою системами ІФ3- та ріанодинчутливих Са2+-каналів, а
також на вивченні взаємодії між цими каналами та іншими
внутрішньоклітинними Са2+-транспортувальними системами.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
виконана в рамках держбюджетних тем БЛ-10Б “Кальцієвий гомеостаз і
енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під
впливом екстремальних факторів”, № держреєстрації 0100 O 001452 та
БЛ-114Б “Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування
секреторних клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872, а також за
часткової підтримки у межах грантів для молодих вчених
Західно-Українського центру біомедичних досліджень. Здобувачем проведено
ідентифікацію ІФ3- і ріанодинчутливих каналів вивільнення Са2+ з
внутрішньоклітинних депо та виявлено функціонування Са2+-уніпортера
мітохондрій за відсутності стимуляції клітини. Крім того, досліджено
регулювання каналів вивільнення Са2+ аденілатциклазою і цАМФ та роль
SH-груп у функціонуванні внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних
систем.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала в одержанні
функціонального підтвердження наявності ІФ3- та ріанодинчутливих
Са2+-каналів, а також Са2+-уніпортера мітохондрій у секреторних клітинах
слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. (комара-дергуна) та у
з’ясуванні особливостей регулювання внутрішньоклітинних
Са2+-транспортувальних систем. У відповідності до поставленої мети нам
необхідно було вирішити наступні завдання:
Підібрати умови для пермеабілізації секреторних клітин слинних залоз.
Ідентифікувати ІФ3- та ріанодинчутливі Са2+-канали у мембранах
внутрішньоклітинних кальцієвих депо секреторних клітин та Са2+-уніпортер
мітохондрій.
З’ясувати місце розташування мітохондрій для глибшого розуміння внеску
Са2+-уніпортера у підтримання гомеостазу Са2+ у клітинах слинних залоз.
Дослідити регулювання внутрішньоклітинних Са2+-каналів
цАМФ-аденілатциклазною, цГМФ-гуанілатциклазною та Са2+-кальмодуліновою
системами.
З’ясувати роль SH-груп у функціонуванні внутрішньоклітинних
Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз.
Встановити наявність взаємодії між ІФ3- та ріанодинчутливими
Са2+-каналами у цих клітинах.
Об’єкт досліджень – регулювання цитоплазматичної концентрації Са2+ у
екзокринних секреторних клітинах.
Предмет досліджень – функціонування Са2+-транспортувальних систем
мембран внутрішньоклітинних депо Са2+.
Методи досліджень – функціонування внутрішньоклітинних
Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки
комара-дергуна вивчали за допомогою визначення змін вмісту Са2+ в
тканині залоз із використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Для
цього використовували інтактні слинні залози та залози, попередньо
оброблені сапоніном з метою пермеабілізації клітин. Крім того,
застосовували методи електронної мікроскопії для локалізації мітохондрій
у клітинах, а також світлової мікроскопії для встановлення ступеня
пермеабілізації плазматичної мембрани сапоніном.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше ідентифіковано ІФ3-чутливі
Са2+-канали внутрішньоклітинних мембран секреторних клітин слинних залоз
личинки Chironomus plumosus L. Підтверджено функціонування
ріанодинчутливих Са2+-каналів та Са2+-уніпортера мітохондрій за
відсутності стимуляції клітин. Візуалізація мітохондрій виявила їх
переважне розташування у базальному полюсі клітини і відсутність
мітохондріального кільця у апікальній частині секреторних клітин, що
вказує на особливості функціонального вкладу мітохондрій у підтримання
Са2+ гомеостазу секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дегруна
у порівнянні з секреторними клітинами вищих тварин.
Вперше для цих клітин досліджено регулювання цАМФ-аденілатциклазною,
цГМФ-гуанілатциклазною та Са2+-кальмодуліновою системами
внутрішньоклітинних каналів вивільнення Са2+. Доведено, що під дією
екзогенного цАМФ вивільнення Са2+ ріанодинчутливими каналами
активується, а ІФ3-чутливими Са2+-каналами – пригнічується.
На основі визначення змін вмісту Са2+ у тканині під впливом
хлорпромазину за різних умов інкубації слинних залоз, оброблених
сапоніном, встановлено модифікуючу роль кальмодуліну на вивільнення Са2+
з внутрішньоклітинних депо. Нами показано, що вивільнення Са2+ з
ріанодинчутливого депо суттєво підсилюється кальмодуліном.
Встановлено, що SH-групи молекул внутрішньоклітинних
Са2+-транспортувальних систем відіграють важливу роль у підтриманні
кальцієвого гомеостазу секреторних клітин.
Вперше нами показано наявність чіткої взаємодії між ріанодин- та
ІФ3-чутливими Са2+-каналами у секреторних клітинах. Ми припускаємо, що
вивільнення Са2+ ріанодинчутливими каналами повністю залежить від стану
ІФ3-чутливих Са2+-каналів і навпаки. Це вказує на роль вивільненого Са2+
у реалізації негативної та позитивної зворотної дії на подальше його
вивільнення з депо.
Практичне значення роботи. Одержані результати розширюють уявлення про
внутрішньоклітинні Са2+-транспортувальні системи, зокрема, про канали
вивільнення Са2+ з депо і розкривають механізми їх взаємодії та
регуляції і, у цілому, поглиблюють розуміння механізмів генерування
Са2+-сигналів у секреторних клітинах. Отримані дані впроваджені у
навчальний процес кафедри фізіології людини і тварин та кафедри
біофізики і математичних методів у біології Львівського національного
університету імені Івана Франка. Одержані результати можуть бути
використані як теоретична основа для пояснення причин виникнення і
розвитку патологій травних залоз, пов’язаних з порушенням кальцієвого
гомеостазу, та розробки методів їхньої фармакологічної корекції, а тому
мають значення для медицини та ветеринарії.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконано весь обсяг
експериментальних досліджень, розроблено методику пермеабілізації
слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. сапоніном, проведено
статистичне опрацювання результатів, їх аналіз на основі опрацьованої
наукової літератури за темою дисертації.
Здобувач разом із науковим керівником та за участю доц. Манька В.В.
здійснювали планування досліджень, аналізували одержані результати,
формулювали основні висновки і готували публікації до друку.
У виконанні електронно-мікроскопічних досліджень брав участь с.н.с.
Кулачковський О.Р.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні
положення, які включені до дисертації, були представлені на: 1-му
Студенському міжнародному конгресі медичних наук (Бєлград, 2001 р.),
конференції до 100-річчя з дня народження заслуженого діяча науки
України професора Я.П.Склярова “Механізми фізіологічних функцій в
експерименті та клініці” (Львів, 2001 р.), на Всеукраїнській науковій
конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ, 2001 р.), на
Міжнародному симпозіумі “Внутрішньоклітинна сигналізація в рослинних та
тваринних системах (ISPAS)” (Київ, 2001 р.), на 6-ій Пущинській
школі-конференції молодих учених “Біологія – наука XXI віку” (Пущино,
2002 р.), на XVI з’їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця,
2002 р.), на 4-ій Парнасівській конференції “Молекулярні механізми
клітинної активації: біологічний сигнал та його молекули-мішені”
(Вроцлав, 2002 р.), на VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці,
2002 р.), на ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів,
2002 р.), на Міжнародній конференції, присвяченій пам’яті професора
Шостаковської І.В. (Львів, 2002 р.), на 5-му Слов’яно-Балтійському
науковому форумі “Санкт-Петербург – Гастро-2003” (Санкт-Петербург,
2003), на Спільній зустрічі Британського фармакологічного та
фізіологічного товариств у Манчестері, (Манчестер, 2003 р) та Зустрічі
фізіологічного товариства (Кембрідж, 2003 р.), а також на щорічних
звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного
університету імені Івана Франка (2000-2004 р.р.) та на міжкафедральному
семінарі біологічного факультету Львівського національного університету
імені Івана Франка у березні 2004 р.
Публікації. Результати дисертації опубліковані у 4 статтях фахових
видань та в 13 тезах доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація включає вступ, огляд
літератури, опис матеріалів і методів досліджень, результатів
досліджень, їхнього обговорення, висновків, списку використаних джерел
із 287 найменувань. Робота викладена на 159 сторінках (основна частина
117 сторінках), ілюстрована 38 рисунками і 5 таблицями.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для досліджень функціонування Са2+-транспортувальних систем
використовували слинні залози личинки комара-дергуна (Chironomus
plumosus Linnaeus, 1758.).
Залози препарували за допомогою мікрохірургічних інструментів під
мікроскопом. Базовий розчин для виділення та інкубації інтактних залоз
містив, ммоль/л: NaCl ( 136,9, KCl ( 5,36, CaCl2 ( 1,76, Na2HPO4 ( 0,35,
KH2PO4 ( 0,44, MgCl2 ( 0,95, глюкоза ( 5,55; рН 7,2. Для пермеабілізації
секреторних клітин відпрепаровані слинні залози попередньо інкубували
протягом 10 хв у базовому розчині, який містив сапонін у концентрації
0,1 мг/мл (рН 7,2). Робочу концентрацію сапоніну та час інкубації з ним
підібрали експериментально. Залози відмивали від сапоніну, інкубували
протягом 30 хв у водяній бані при температурі 25( С та помірному
струшуванні. Вихідний розчин для інкубації залоз після обробки їх
сапоніном містив (ммоль/л): NaCl ( 15,30, KCl ( 129,94, Na2HPO4 ( 0,35,
KH2PO4 ( 0,44, глюкоза ( 5,55; рН 7,0. Після інкубації вміст пробірок
протягом 5 хв центрифугували при 1600 g. Зливши супернатант, до осаду
додавали 1 мл бідистильованої води і гомогенізували за допомогою
скляного гомогенізатора. Отриманий гомогенат центрифугували протягом
10 хв. Про функціональний стан Са2+-транспортувальних систем судили за
зміною вмісту Са2+ у тканині залоз, виміряного за допомогою арсеназо ІІІ
з використанням стандартного набору реактивів фірми Simko Ltd (Львів). З
метою блокування ІФ3-чутливих Са2+-каналів до базового розчину додавали
гепарин (500 мкг/мл), для блокування Са2+-помпи ендоплазматичного
ретикулуму (ЕПР) – тапсигаргін (1 мкмоль/л) і еозин Y (5, 10 і 20
мкмоль/л), а також використовували IФ3 у концентрації 10 мкмоль/л,
ріанодин у концентраціях 5 і 500 нмоль/л, форсколін у концентрації
10 мкмоль/л, цАМФ та цГМФ у концентраціях 1, 10 і 100 мкмоль/л,
парахлормеркурійбензоат (ПХМБ) у концентрації 1, 5, і 10 мкмоль/л та
хлорпромазин у концентрації 100 мкмоль/л.
Для електронно-мікроскопічних досліджень двічі відмиті дистильованою
водою інтактні залози фіксували охолодженим до 0( С 1,5 % розчином
глутарового альдегіду на какодилатному буфері (рН=7,2) протягом 2 год,
постфіксацію проводили 1 % розчином OsO4 у какодилатному буфері протягом
2 год при 0( С. Фіксовані зразки промивали і витримували у 1,5 % водному
розчині уранілацетату 12 год, зневоднювали в зростаючих концентраціях
етанолу, окису пропілену та переносили в епоксидну смолу Epon-812.
Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6 і контрастували
солями свинцю за Рейнольдом. Перегляд і фотографування зразків
виконували на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ-100.
Статистичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного
пакета для персональних комп’ютерів Microsoft Excel. Достовірність змін
встановлювали за Стьюдентом.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
1. Функціональний стан мембран пермеабілізованих секреторних клітин
слинних залоз
Оскільки мета досліджень полягала в ідентифікації та з’ясуванні
властивостей внутрішньоклітинних Са2+-транспортувальних систем, виникла
потреба підібрати умови пермеабілізації секреторних клітин слинних залоз
личинки комара-дергуна. Як детергент використовували алкалоїд рослинного
походження – сапонін у концентраціях 0,001; 0,01 і 0,1 мг/мл. Для
встановлення ступеня пошкодження плазматичної мембрани (ПМ) сапоніном
проводили підрахунок зафарбованих клітин залоз 1 % розчином трипанового
синього. У залозах, оброблених сапоніном у концентрації 0,1 мг/мл
забарвленими були 90 % клітин. Фарбування клітин трипановим синім
свідчить про порушення цілісності ПМ. Проте не відомо, чи ушкоджена лише
ПМ, чи і мембрана ЕПР. Для того, щоб перевірити цілісність мембрани ЕПР,
ми тестували функціонування у ній Са2+-помпи за допомогою її блокаторів.
Виявилося, що під впливом еозину Y (20 мкмоль/л) вміст Са2+ у тканині
залоз, оброблених сапоніном, зменшувався на 20,27±6,92 % (Р@„°l
n
AE
E
o
8
????????8
¦
@„?thn
E
E
I
o
?????)??&?
O
b
f
o
@EI4
6
ph/-канали. Але якщо дія цАМФ на ріанодинчутливі Са2+-канали прямо чи
опосередковано підсилює мобілізацію депонованого Са2+, то на ІФ3-чутливі
Са2+-канали такий вплив цАМФ справляє протилежний ефект – вивільнення
Са2+ блокується.
Роль цГМФ-гуанілатциклазної системи. Додавання цГМФ у концентраціях 1,
10 і 100 мкмоль/л до середовища інкубації пермеабілізованих клітин
слинних залоз личинки комара-дергуна спричиняло збільшення вмісту Са2+,
яке не досягало першого рівня достовірності у жодному з випадків
(Р=0,62; P=0,96; P=0,80 відповідно, n=8). Тому ми почергово
застосовували цГМФ у присутності блокаторів тих Са2+-транспортувальних
систем, які могли б піддаватися регуляції цГМФ чи цГМФ-залежними
протеїнкіназами. Виявилося, що за наявності у середовищі інкубації
гепарину середньоарифметичні значення вмісту Са2+ в тканині залоз у
контролі і під дією цГМФ майже не відрізнялися (Р=0,98, n=8). Так само
не чинив цГМФ достовірної дії (Р=0,39, n=8) на вміст Са2+ в тканині
залоз у присутності ріанодину (500 нмоль/л). Лише за наявності
тапсигаргіну цГМФ статистично достовірно (Р=0,02, n=7) викликав
збільшення вмісту Са2+ в тканині залоз на 50,65±17,44 %.
Отже, за умов блокування Са2+-помпи ЕПР тапсигаргіном цГМФ пригнічує
канали вивільнення Са2+. Це може відбуватись через фосфорилювання
цГМФ-залежними протеїнкіназами цих каналів. Напевно, цГМФ також впливає
і на Са2+-помпу, пригнічуючи її. Оскільки помпа і канали здійснюють
транспортування Са2+ у протилежних напрямках, дія цГМФ не виявляється.
Але згідно даних літератури малоймовірним є блокування цГМФ Са2+-помпи
ЕПР. Тим не менше пригнічення неіндукованого вивільнення Са2+ цГМФ
виявилось лише тоді, коли Са2+-помпа була заблокована.
Значення SH-груп у функціонуванні внутрішньоклітинних
Cа2+-транспортувальних систем. У дослідженнях на інтактних слинних
залозах личинки комара-дергуна було показано, що важливу роль у
підтриманні гомеостазу Са2+ секреторних клітин належить SH-групам
(Larina, Manko, Klevets, 2001). Нами встановлено, що інкубація
оброблених сапоніном слинних залоз із ПХМБ концентрацях 1, 5 та 10
мкмоль/л не супруводжувалась статистично достовірними змінами вмісту
Са2+ у тканині залоз (Р=0,10, Р=0,14, Р=0,56 відповідно, n=6). Проте за
наявності у середовищі блокатора Са2+-помпи еозину Y (20 мкмоль/л) ПХМБ
викликав зменшення вмісту Са2+ в тканині залоз. Таке зменшення досягало
першого рівня достовірності (Р=0,05, n=6) при концентрації ПХМБ 10
мкмоль/л і становило 35,39±8,19 %. За наявності ПХМБ у цій концентрації
ІФ3 збільшував вміст Са2+ в тканині залоз на 25,36±7,42 % (Р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
