ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ
ДУБІНІНА НАТАЛІЯ ВЛАДИСЛАВІВНА
УДК 615.33: 577.112.384.2/4
Протимікробні властивості глюкогенних амінокислот та їх синергізм з
антибіотиками
03.00.07 – мікробіологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2004
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Національному фармацевтичному університеті
Міністерства охорони здоров`я України
Науковий керівник – доктор медичних наук, професор І.Л.Дикий, завідувач
кафедри мікробіології, вірусології та імунології Національного
фармацевтичного університету МОЗ України
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Савінова Олена Михайлівна, кафедра
клінічної імунології та мікробіології, Харківська медична академія
післядипломної освіти МОЗ України;
доктор біологічних наук, професор Руденко Адель Вікторівна, завідуюча
відділом мікробіології, Інститут урології АМН України
Провідна установа:
Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного Національної
академії наук України
Захист дисертації відбудеться “ 10 ” червня 2004 р. о 13.00 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при Інституті
мікробіології та імунології
ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м.Харків, вул. Пушкінська,14)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології
та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, м.Харків, вул. Пушкінська,
14.
Автореферат розісланий “ 7 ” травня 2004 р.
Учений секретар
cпеціалізованої вченої ради
к. мед. н. С.В.Бруснік
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Сучасний стан і перспективи розвитку хіміотерапії у
XXI столітті принципово визначає необхідність послідовної зміни
антибіотиків перших поколінь на сучасні протимікробні препарати,
основною відміною яких є виражена антисептична здатність і оптимальна
біосумісність за фармакологічними ознаками для організму хворого. Серед
таких антисептиків у медичній практиці широко використовується
ектерицид. Більш ніж за тридцятирічний термін його медичного
застосування не встановлено формування до ектерициду відповідної або
множинної лікарської стійкості та побічних ефектів, пов`язаних з
подразнюючою, алергенною активністю або наявністю токсичної дії
місцевого та системного рівня. Разом із цим, ектерицид використовується
лише в якості антисептика місцевого призначення, що обумовлено його
антибактеріальною активністю лише в нативному розчині. У зв`язку з
останнім вельми актуальною є розробка нового препарату типа ектерициду з
підвищеними рівнями антибактеріальної активності й придатністю для
парентерального використання.
Зв`язок роботи з науковими програмами , планами, темами. Дисертація
виконана відповідно до комплексної наукової програми Національного
фармацевтичного університету “Створення нових лікарських препаратів на
основі рослинної і природної сировини” (№ державної реєстрації
1980007008). Тема дисертації затверджена на РПК “Мікробіологія”
(протокол № 12 від 16 травня 2002 року).
Мета і завдання дослідження. Мета роботи – обґрунтувати закономірність
прояву протимікробних властивостей аспарагінової та глютамінової
амінокислот, означити їх потенціюючий вплив на специфічну активність
антибіотиків, сконструювати антисептик аспарцид із принципово новим
механізмом протимікробної дії.
Для досягнення мети сформульовано й розв`язано такі основні задачі:
Визначити спектр та рівень протимікробної активності кислих амінокислот
щодо референтних та клінічних штамів грампозитивних та грамнегативних
мікроорганізмів;
Оцінити рівні антибактеріальної активності досліджуваних амінокислот по
відношенню до мікроорганізмів, які відповідно чутливі або стійкі до
антибіотиків;
Оцінити селективний потенціал аспарагінової амінокислоти;
Дослідити потенціюючий вплив аспарагінової кислоти на вихідну активність
антибіотиків;
Проаналізувати технологічну схему виготовлення ектерициду та визначити
напрямки підвищення його специфічної активності;
Розробити технологію створення антисептика аспарциду, визначити
співвідношення рівній бактерицидних та бактеріостатичних концентрацій,
по відношенню до чутливих та стійких до антибіотиків мікроорганізмів,
встановити наявність селективних властивостей та їх вплив на формування
антибіотикорезистентності;
На моделях локалізованої і генералізованої гнійно-запальної інфекції
довести хіміотерапевтичну ефективність аспарциду як антисептика
парентерального призначення.
Об`єкт дослідження. Гнійно-запальні захворювання.
Предмет дослідження. Кислі амінокислоти з глюкогенними властивостями;
патогенні та умовно-патогенні мікроорганізми.
Методи дослідження. Мікробіологічні, токсикологічні, імунологічні,
фармакотерапевтичні, бактеріохімічні, математико-статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлено, що кислі
амінокислоти з глюкогенними якостями відрізняються супутньо вираженими
антимікробними властивостями по відношенню до грампозитивних і
грамнегативних бактерій незалежно від їх чутливості або стійкості до
антибіотиків. Доведено, що аспарагінова та глютамінова амінокислоти
виявляють синергідну сумісність з антибіотиками, суттєво підвищуючи їх
вихідну активність у прояві бактерицидних властивостей. Розроблено
технологію конструювання оригінального антисептика аспарциду на основі
спрямованого гідролізу риб`ячого жиру аспарагіновою кислотою.
За результатами виконаних досліджень оформлено патент України на винахід
(антимікробний засіб, деклараційний патент на винахід № 2003109738 від
22.04.2003р).
Обґрунтованість і достовірність наукових положень, висновків і
рекомендацій. Роботу виконано з використанням сучасних методів
досліджень. В обґрунтованості основних положень та висновків дисертація
спирається на поглиблених дослідженнях основних біологічних властивостей
158 референтних та клінічних штамів грампозитивних і грамнегативних
мікроорганізмів, їх чутливості до антибіотиків та антисептиків.
Хіміотерапевтичні дослідження кислих амінокислот і розробленого
антисептика аспарциду проведено з використанням моделей локалізованої та
генералізованої гнійно-запальної інфекції.
Практичне значення одержаних результатів. Доведено виражену
протимікробну активність аспарагінової та глютамінової кислот, що
доцільно враховувати при їх призначенні за основними фармакологічними
властивостями як фактора антиінфекційної спроможності (наприклад, при
інфекційних менінгоенцефалітах). Обґрунтовано необхідність розробки
комплексних антисептичних препаратів на основі сумісного використання
антибіотиків, антисептиків та кислих амінокислот.
Запропоновано технологію створення антимікробних препаратів на
субстратній основі природних жирів та розроблено новий антисептик
аспарцид. Проведено доклінічне дослідження і визначено перспективність
використання аспарциду в номенклатурі антимікробних препаратів.
Розроблено методичні рекомендації щодо вивчення специфічної активності
протимікробних лікарських засобів (Київ, 2004), схвалених
науково-експертною радою Державного Фармакологічного Центру МОЗ України
(протокол № 9 від 30.10.2003 р.).
Результати роботи впроваджено у інноваційні технології нових лікарських
засобів на основі використання аспарагінової й глютамінової амінокислот,
а також у навчальному процесі кафедр мікробіології, вірусології та
імунології Національного фармацевтичного університету, Тернопільської
медичної академії ім. І.Я. Горбачевського, Вінницького національного
медичного університету ім. М.І. Пирогова, Донецького державного
університету, Дніпропетровського медичного університету, ХМАПО, а також
у післядипломної підготовці фахівців на базі НДІ імунопатології
Російської Академії Природничих Наук, ХМАПО. Розроблений препарат
аспарцид включений до перспективного плану виробничого освоєння НДІ
імунопатології РАПН (Росія).
Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведено первинний
мікробіологічний скринінг кислих амінокислот, визначено їх спектр та
рівні антисептичної дії щодо референтних і клінічних штамів
мікроорганізмів. Самостійно оцінено співвідношення рівней бактерицидної
та бактеріостатичної активності досліджуваних амінокислот, вивчено їх
селективний потенціал та синергідность з антибіотиками в проявах
антимікробної дії. Розроблено новий антисептик аспарцид, придатний для
парентерального використання. Самостійно оцінено його протимікробні
властивості in vitro та хіміотерапевтичну активність на моделях
експериментальної гнійно-запальної інфекції.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені
й обговорені на міжнародних наукових конференціях: “Актуальні питання
боротьби з інфекційними захворюваннями” (Харків, 2003), на III
Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми
суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003),
міжнародній науковій конференції “Пробіотики – XXI століття. Біологія.
Медицина. Практика” (Тернопіль, 2004), а також на науково-практичних
конференціях Національного фармацевтичного університету України (
Харків, 2002; 2003, 2004).
Публікації. Матеріали дисертації відображено в 9 статтях, із них три у
журналах, рекомендованих ВАК України для опублікування результатів
досліджень пошукувачам наукового ступеню; одержано патент “Антимікробний
засіб” (№ 2003109738 від 22.04.2003р) .Обсяг і структура дисертації.
Робота оформлена відповідно до вимог ВАК України на 143 сторінках
машинописного тексту, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів
і методів, 5 розділів власних досліджень, обговорення результатів та
висновків.
Список літератури включає 206 джерел вітчизняних та іноземних авторів.
Матеріали дисертації ілюстровано 26 таблицями та схемою.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження.
Мікробні культури. В роботі використано референс-штами S. aureus
ATCC-25923, E. coli ATCC-25922, P. aeruginosa ATCC-22853, B. subtilis
ATCC-6633, C. albicans ATCC-10261 та клінічні штами, які вилучені з
різного матеріалу: гнійного вмісту хірургічних ран, ексудатів черевної
порожнини, фекалій хворих на кишкові дисфункції. Усього вилучено,
охарактеризовано й ідентифіковано бактерій родів: Staphylococcus (16
штамів), Streptococcus (13 штамів), Esherihia (10 штамів), Proteus (18
штамів), Shigella (8 штамів), Bacillus (11 штамів), Vibrio (8 штамів),
Pseudomonas (9 штамів), Mycobacterium (12 штамів), Neisseria (17
штамів), Corynebacterium (24 штами). Клінічні штами ідентифіковано за
тінкторіальними, морфологічними й біохімічними властивостями. Виділення
чистих культур проведено згідно загально прийнятих методик.
Препарати. Оцінку лікарської стійкості референтних і клінічних штамів
проведено з використанням антибіотиків різного механізму дії:
інгібіторів синтезу клітинної стінки – бензилпеніцилін, оксациліну
натрієва сіль; інгібіторів синтезу білку – гентаміцину сульфат,
доксіциклін, канаміцин, стрептоміцин, тетрациклін, хлорамфенікол,
еритроміцин; інгібіторів функції клітинної мембрани – поліміксин,
офлоксацин та рифампіцин.
Визначення антибіотикорезистентності використаних мікроорганізмів
проведено за стандартними методиками двократних серійних розведень,
методом паперових дисків та дифузії в агар. Оцінку селективного
потенціалу аспарциду проведено шляхом багаторазового послідовного
культивування тест-мікробів у присутності постійних або зростаючих
субактивних концентрацій препарату.
Вивчення здатності глюкогенних амінокислот знижувати вихідну стійкість
тест-мікробів до антибіотиків проведено за методикою В.С.Зуєвої (1971).
Локалізовану та генералізовану інфекцію білих мишей відтворено за
методикою Г.Н. Першина (1971).
Експериментальну модель інфекційного опіку у білих мишей обох статей
масою 25-30 г викликали за допомогою спеціального пристрою, що
складається з товстостінного порожнього мідного циліндра, у який
заливали воду. Через відвідну мідну трубку вставляли жало
електропаяльника. При включенні останнього в мережу електроструму, вода
в циліндрі закипає (1000С), при цьому площа нижньої площини циліндру
дорівнює 100 мм2. Тваринам під легким ефірним наркозом депілювали на
спині ділянку шкіри площею 1,5 х 1,5 см, після чого розігрітий прилад
прикладали до підготовленої поверхні. Термін експозиції 20 сек, контакт
здійснювався без тиску. Така маніпуляція призводила до того, що у всіх
тварин через 24 години на місці контакту з пристроєм формувалося вогнище
ураження, візуально означеного серозно-геморагічною кіркою площею 54-55
мм2, по периферії якої виражені набряк і гіперемія шкіри , границі яких
збігалися з площею кірки. Патоморфологічні дослідження показали, що під
кіркою сформувався детермальний виразковий дефект, що відповідає опіку
3-А – 3-Б ступеня. Через 3 години після відтворення травми опікову
поверхню зрошували суспензією добової агарової культури синьогнійної
палички у дозі 40 млн мікробних тіл у мл, що при внутрішньо-судинному
уведенні обумовлює загибель 80-100% тварин. Ефективність лікування
оцінювали за характером гнійного ускладнення шляхом порівняння
інтенсивності й ступеня ураження в групах лікованих і контрольних
тварин.
Результати власних досліджень у розділах 3-7
Розділ 3 підпорядкований доказу наявності супутніх антимікробних
властивостей у глюкогенних амінокислот – аспарагінової та глютамінової.
Враховуючи можливий вплив стереохімічних відмін у визначенні
прогнозованих антимікробних властивостей, у першій серії
мікробіологічних досліджень проведено паралельне співставлення рівней
вираженості антибактеріальної та антифунгальної здатності у рацематів.
L- та D- ізомерів досліджуваних амінокислот. При використанні в якості
мікробіологічної моделі S. aureus, E. coli, P. aeruginosа, B. subtilis,
C. albicans встановлено, що L- ізомери порівнювальних амінокислот
практично не відрізняються ступенем прояву антимікробних властивостей.
Обмежена бактеріостатичною активністю фонова здатність на рівні 36-41
мг/мл за своїми абсолютними значеннями не може бути прийнятою до уваги в
якості показника антимікробного потенціалу у ліворуч обертаючих ізомерів
порівнювальних амінокислот. Одночасно встановлено, що D- ізомери
аспарагінової й глютамінової амінокислот дещо перевищують аналогічну
бактеріостатичну здатність L- ізомерів по відношенню до S. aureus
відповідно у 10-14 разів, а відносно B. subtilis – від 6 до 21 разів.
Слід також зазначити, що, на відміну від L- ізомерів, праворуч обертаючі
стереохімічні варіанти аспарагінової та глютамінової амінокислот виявили
відповідну активність по відношенню до C. albicans.
Аналізуючи одержані результати, необхідно підкреслити, що виявлені
розбіжності у наявності та рівнях вираженості супутніх антимікробних
властивостей між порівнювальними стереохімічними варіантами
досліджуваних амінокислот пов`язані з використанням бактеріальною
клітиною L- аспартази при синтезі аспарагінової та глютамінової
амінокислот. Останнє означає, що L- ізомери глюкогенних амінокислот не
повинні відрізнятися реєструємою антимікробною активністю. Одночасно D-
ізомери, які не підпадають під ферментно-контролюючу функцію аспартаз та
не використовуються у біохімічному синтезі мікроорганізмів, проявляють
помірно виражену бактерицидну та фунгіцидну активність за механізмами,
імовірно притаманними сульфаніламідам.
При теоретичному обґрунтуванні закономірностей прояву антимікробних
властивостей у досліджуваних амінокислот слід враховувати, що
характерною фізико-хімічною ознакою моноамінодікарбонових кислот є
низькі показники рН. Відомо, що представники резидентної мікрофлори
характеризуються здатністю до персистенції в умовах знижених показників
рН. Одночасно більшість патогенних мікроорганізмів інгібіційно чутлива
до пониженої концентрації водневих іонів та фізіологічно адаптована до
їх основних значень. З цього виходить, що в разі підтвердження
достатньої антисептичної спроможності у D- ізомерів глюкогенних
амінокислот розкривається перспектива створення мікроекологічно
ефективних препаратів, антимікробний потенціал яких вибірково
спрямований щодо патогенних мікроорганізмів. Додатковим механізмом в
обґрунтуванні антимікробних властивостей D- ізомерів аспарагінової та
глютамінової амінокислот слід вважати і те, що при можливості
бактеріохімічного засвоєння вони все-таки підлягають на
внутрішньоклітинному рівні певному хімічному метаболізму. Унаслідок
цього під впливом ендоферментів D- ізомери повинні відновлюватись до
кетокислот, альдегідів та органічних перекисних сполук, яким притаманні
виражені антимікробні властивості.
Наявність антимікробних властивостей у D- ізомерів досліджуваних
амінокислот не виключає прояву відповідного селективного потенціалу й
здатності на ко-селективному рівні впливати на формування у
мікроорганізмів відповідних рівней антибіотикорезистентності.
При цьому, для цілеспрямованого вивчення селективних потенцій рацематів
та D- ізомерів кислих амінокислот використано антибіотикочутливі
референтні культури S. aureus та E. coli. Дослідження проведено в умовах
безперервного послідовного культивування в присутності постійних
субактивних концентрацій досліджуваних амінокислот. Наявність
селективного потенціалу оцінена шляхом порівняльного співставлення
вихідних та наведених рівней чутливості в умовах 25 кратного пасування.
Установлено, що D- ізомерам аспарагінової та глютамінової амінокислот
притаманний уповільнений селективний потенціал, що виявилося по
відношенню до аспарагінової кислоти підвищенням вихідної лікарської
стійкості S. aureus – у 3 рази, та E. coli відповідно – у 5 разів. Для
глютамінової кислоти ці показники відповідно становили 5 та 6 разів.
Підтвердження уповільненої селективної здатності кислих амінокислот
визначало доцільним вивчення їх можливого впливу на формування
антибіотикорезистентності у пасованих варіантів тест-штамів.
Порівняльними дослідженнями антибіотикограм до і після спрямованого
культивування референтних культур S. aureus та E. coli принципово
встановлено, що набуття відповідної лікарської стійкості супроводжується
збільшенням вихідної антибіотико-резистентності S. aureus від 1,6 до 3,5
раза. Розбіжності в антибіотикограмах вихідної культури E. coli та її
селекційних варіантів проявилися в межах підвищення рівней
антибіотикорезистентності в межах 2-2,6 раза.
Таким чином, правомірно дійти висновку про те, що завдяки наявності
помірних антимікробних властивостей, глюкогенні амінокислоти принципово
здатні в якості факторів ко-селекції індуктивно впливати на формування
антибіотикорезистентності. У зв`язку з останнім ставало доцільним
вивчення антимікробної активності D- стереохімічного варіанту
аспарагінової кислоти по відношенню до чутливих і антибіотикостійких
тест-мікробів. Виключення з подальшого дослідження глютамінової кислоти
обумовлено тим, що за абсолютними рівнями антимікробної активності
глютамінова амінокислота суттєво поступалася перед своїм аналогом.
Результати проведених досліджень показали, що антибіотикостійкі
представники досліджуваних тест-культур S. aureus, E. coli, Str.
pyogenes, P. aeruginosа, B. subtilis, C. albicans виявилися більш
стійкими до мікробостатичної дії аспарагінової кислоти в середньому у
7,6 раза, а за мікробоцидними відповідно – у 11,3 раза. Таким чином,
проведені дослідження показують, що клінічне використання аспарагінової
та глютамінової амінокислот може супроводжуватися неоднозначними
мікробіологічними ефектами. При довготерміновому використанні таких
препаратів за соматичним призначенням може виникати ко-селективна
активація антибіотикорезистентності у ендогенної або транзиторної
мікрофлори. Одночасно, при наявності в організмі антибіотикорезистентних
збудників, побічний мікробіологічний ефект кислих амінокислот повинен
бути мінімізованим або відсутнім.
За абсолютними рівнями антисептичної активності досліджувані
амінокислоти не можуть бути охарактеризовані як антимікробні препарати.
Останнє означає, що перспективи використання виявлених антимікробних
властивостей у аспарагінової та глютамінової амінокислот можуть бути
пов`язані з визначенням їх антимікробної сумісності з антибіотиками або
антисептиками. Проведеними дослідженнями доведено, що в субактивних
концентраціях аспарагінова кислота виявляє виражену потенціюючу
здатність по відношенню до вихідних рівней антимікробної властивості
антибіотиків. Так установлено, що під впливом субактивної концентрації
аспарагінової кислоти вихідна антибактеріальна здатність
бензилпеніциліну збільшується в залежності від видової належності
тест-мікробу – у 10-15 разів, стрептоміцину сульфату – у 1,3-4 раза,
еритроміцину фосфату – від 2 до 40 разів, гентаміцину сульфату –
відповідно у 2 рази. При цьому особливе значення набуває те, що
потенціюючий вплив аспарагінової кислоти рівноцінно виражається як по
показникам бактеріостатичної. так і бактерицидної активності
досліджуваних антибіотиків (табл. 1). Останнє служить експериментальним
аргументом для сумісного використання кислих амінокислот та антибіотиків
у здійсненні антиінфекційної терапії. Також слід вважати перспективним
створення комплексних лікарських засобів на основі компонентного
суміщення в рецептурному складі антибіотиків та кислих амінокислот.
Фізико-хімічними особливостями досліджуваних амінокислот є те, що вони
відрізняються кислими показниками рН. Указане прогнозує можливість
їхнього спрямованого використання як фактора гідролізу природних жирів.
Останньому і підпорядкований 4 розділ власних досліджень, в якому
представлено спосіб виготовлення, фізико-хімічні й фармакологічні
властивості препарату, створеного при взаємодії аспарагінової кислоти та
риб`ячого жиру. Технологічним взірцем для створення такого препарату
став антисептик ектерицид, який більш ніж 30 років успішно
використовується в клініці як антисептик широкого спектру антимікробної
дії.
Однак суттєвим недоліком при цьому є те, що антимікробну активність
ектерицид виявляє лише у нативному вигляді або в розведеннях, які не
перевищують 1:2, 1:4. У зв`язку з цим клінічне застосування цього
препарату обмежене аплікаційними або інстиляційними засобами.
В задачу дослідження покладено створення модифікаційного аналога
ектерициду, який за абсолютними рівнями антисептичної дії повинен
суттєво перевищувати ектерицид, та завдяки цьому виявляти придатність
для парентерального використання. При аналізі технологічної схеми
виробництва ектерициду встановлено, що її основу складає сумісне
окислення та водний гідроліз риб`ячого жиру. Тому в скринінгових
технологічних дослідженнях апробовано варіанти посилення гідролітичних
ефектів за рахунок використання кислотного або лужного гідролізу,
збільшення початкової маси риб`ячого жиру для відповідного гідролізу,
суміщення гідролізу з примусовим окисом, тощо.
В результаті встановлено непридатність випробуваних технологічних
засобів для суттєвого підвищення вихідних антимікробних властивостей
цільового продукту. У зв`язку з цим обґрунтовано використання
аспарагінової кислоти в якості фактора гідролізу риб`ячого жиру при
одержанні антисептичного препарату. Для індуктивного поліпшення
первинних гідролітичних процесів риб`ячий жир на протязі 1 доби
обробляють 10% розчином пероксиду водню при періодичному шютелюванні.
Таблиця 1
Потенціюючий вплив аспарагінової кислоти
на специфічну активність антибиотиків (n = 6)
Анти-біотик
Тест-
штамм Протимікробна активність, мкг/мл
контроль DL-аспарагінова кислота кратність
МІК МБК МІК МБК МІК МБК
Бензил- пеніцилін S. aureus 3,9(0,9 7,8(1,3 0,15(0,04 0,31(0,08 25,0
25,0
B. subtilis
125(11,6 125,6(7,7 3,12(0,6 6,25(1,1 40,0 20,0
E. coli 62,5(5,8 125,3(10,5 1,25(0,3 2,5(0,7 50,0 50,0
Ps. aeru-ginosa 118,3(7,6 149,3(10,6 7,3(0,9 15,6(2,2 16,0 10,0
Стрепто-міцину сульфат St. aureus 3,9(1,1 7,8(1,8 3,1(0,6
6,2(1,4 1,3 –
B. subtilis 3,9(0,93 3,9(0,6 1,2(0,3 2,0(0,7 3,0 4,0
E. coli
15,6(3,4 15,6(2,2 23,0(3,8 23,0(3,6 – –
Ps. aeru-ginosa 125,0(9,2 472,3(16,6 186,3(14,1 386,4(1,5 – –
?
?
¤
AE
,
j
?
c
¤
,
??
&
&
B
B
(
*
4
6
^
`
‚
?
?
¬
®
1/4
3/4
I
I
akdI
,7(11,3 289,5(16,3 62,8(7,7 136,2(14,3 2,0 2,0
E. coli 462,3(16,8 500,0(16,7 11,5(1,1 46,3(12,2 40,0
11,0
Ps. aeru-ginosa 386,3(22,9 (500 309,6(19,4 (500 1,3 –
Гентамі-цину сульфат S. aureus 5,0(0,3 5,0(1,2 2,5(0,6 5,0(1,3 2,3 –
B. subtilis 0,2(0,03 0,4(0,06 1,0(0,2 2,0(0,4 – –
E. coli 5,0(1,1 10,2(1,2 2,5(0,7 5,0(1,2 2,0 2,0
Ps. aeru-ginosa 1,25(0,14 2,5(0,7 2,0(0,3 4,6(0,9 – –
Примітки: n – число визначень; МІК – мінімальна інгібуюча концентрація;
МБК – мінімальна бактерицидна концентрація
Після цього до обробленого риб`ячого жиру додавали 10% розчин
аспарагінової кислоти з послідуючою інкубацією при 370 С на протязі
16-17 діб. Надалі розчин фільтрують, спочатку через марлевий фільтр, а
потім – через стерилізуючі пластини фільтру Зейтца (схема).
Схема
ХІМІЗМ ОСНОВНИХ СТАДІЙ СПОСОБУ ОДЕРЖАННЯ АСПАРЦИДУ
1. Стадія реакційної ініціації нейтральної молекули
риб`ячого жиру перекисом
водню
нейтральна молекула риб`ячого жиру
водорозчинні жирні кислоти
нестійкі
перекисні речовини
альдегіди, кетони, спирти
обмежно розчинні
нерозчинні
2. Стадія кислотного гідролізу і
“антикетогенної”
дії аспарагінової кислоти
Реакційно ініційована молекула риб`ячого жиру
гліцериди
Гідроперекисі, альдегіди, вторинні спирти жирних кислот
аміди
Одержаний препарат представляє собою прозору обезбарвлену рідину зі
слабо вираженим специфічним смаком. При середньому рН 3,13 розроблений
препарат уміщує 0,31 г / % вільних жирних кислот та 61 г / % альдегідів,
а також органічних перекисей, які і визначають його антимікробну
активність. Виходячи з хімічних ознак та біологічних властивостей
препарату надана умовна назва –аспарцид.
В 5 розділі власних досліджень оцінено антибактеріальні властивості
аспарциду. Враховано, що клінічну перспективу кожного нового
антимікробного препарату комплексно визначають: виражені рівні
етіологічно спрямованої антибактеріальної активності; переважна або
вибіркова мікробоцидна здатність; рівноцінна активність по відношенню до
чутливих та антибіотикостійких штамів; відсутність або уповільнення
селективної здатності щодо формування відповідної або множинної
лікарської стійкості у мікроорганізмів. Виходячи з того, що розроблений
препарат аспарцид за відповідністю субстратної сировини є аналогом
ектерициду, визначено доцільним провести порівняльну оцінку рівней їх
антисептичних властивостей. В дослідах використано 158 референтних і
клінічних штамів тест-мікробів. Результати проведених досліджень
показали, що за рівнями притаманної мікробоцидної активності аспарцид
cуттєво перевищує антимікробну активність ектерициду (табл. 2). Так, по
відношенню щодо піогенних
коків аспарцид виявився у 38-58 разів більш активним, ніж препарат
порівняння; по відношенню до збудника гонореї – у 20 разів; до
синьогнійної палички – у 21 раз; до туберкульозної палички – у 11 разів;
до дифтерійної палички відповідно – у 21 раз. Тобто, по всім
використаним мікробіологічним моделям розроблений препарат аспарцид
суттєво перевищував свій субстратний аналог ектерицид.
Визначені розбіжності в рівнях антисептичної активності обґрунтували
доцільність вивчення особливостей механізмів дії аспарциду та ектерициду
на мікробну клітину. За результатами проведених досліджень встановлено,
що ектерицид виявляє мікробоцидну активність шляхом одночасної
інгібуючої дії як щодо визначаючої біохімічні процеси мікробної клітини,
так і щодо деяких складових її хімічної структури. Установлено, що
інгібуюча дія ектерициду проявляється суттєвим зниженням пероксидазної,
амілазної та естеразної активності, тобто – спрямована на пригнічення
препаратом ліпідно-вуглеводневого обміну та окисно – відновлювальних
процесів мікробних клітин. Разом із цим доведено, що ектерицид
відрізняється певним деструктивним впливом на структуру бактеріальних
ліпополісахаридів. Так, внаслідок добового контакту з ектерицидом, в
хімічній структурі стафілококу достовірно зменшується кількісний уміст
загальних ліпідів на 30, а полісахаридів – на 18,3%.
Таблиця 2
Порівняльна характеристика спектрів та ступеню бактерицидної дії
ектерициду і аспарциду
Тест-мікроб
Кількість штамів
Рівень бактерицидної дії
( розведення)
Кратність
активностей
ектерицид
аспарцид
Рs. aeruginosa 9 1,22 ( 0,27 25,7 (7,60 21
P. vulgaris 8
1,12 ( 0,26
27,5 ( 8,86
24,5
P. mirabilis 10
1,81 ( 0,41
30,8 ( 7,49
17
B. subtilis 11
не активний
26,6 ( 6,03
27,6
E. coli 10
1,90 ( 0,38
33,6 ( 5,56
17,6
Sh. flexneri 8
1,87 ( 0,63
29,0 ( 8,77 15,5
S. typhi 12 1,50 ( 0,15 7,60 ( 0,91 5
Vibrio 8 2,60 ( 0,42 38,0 ( 6,03 14,6
N. intracellulare 7 3,14 ( 0,40 18,8 ( 4,83 5,9
N. gonorrhoeae 10
4,60 ( 0,60 92,8 ( 21,1 20
Staphylococcus 16 0,75 ( 0,035 44,0 ( 7,38 58,6
Streptococcus 13 цільний 38,1 ( 5,29 38,1
M. tuberculosis 12 2,83 ( 0,93 32,0 ( 6,14 11,3
C. diphtheriae 24 3,03 ( 0,52 74,5 (18,8 21,1
Примітка. Бактерицидну активність оцінено в показниках рівня розведення
препаратів; результати достовірні при р(0,05
Одночасно у протеїв, як типових представників грамнегативних бактерій,
обумовлений дією ектерициду кількісний дефіцит ліпідів становить 20,4% і
полісахаридів – 30,7%.
На протилежність цьому, при дослідженні визначаючих механізмів аспарциду
встановлена переважна деструктивна дія препарату на структурні білки та
нуклеопротеїди. Останнє проявляється зниженням умісту цитоплазматичних
білків для стафілокока на 19%, для протеїв – на 14%. У свою чергу
дефіцит нуклеопротеідів для стафілококів становить –28,6%, для протеїв –
52%.
В 6 розділі власних досліджень оцінено хіміотерапевтичну активність
аспарциду при локалізованій та генералізованій експериментальній
інфекції.
Хіміотерапевтичну активність аспарциду при локалізованій гнійній
інфекції випробувано на 340 білих мишах, яку відтворювали погрупно
шляхом підшкірного уведення 0,2 мл змивів добових агарових культур
стафілококу в дозі 800 млн мікробних тіл, синьогнійної палички в дозі 30
млн мікробних тіл, гемолітичного стрептококу – в дозі 25 млн мікробних
тіл. Разом із цим для відтворення локалізованої гнійної інфекції
використано змиви змішаних мікробних культур у компонентному складі 266
млн мікробних тіл стафілококу, 10 млн мікробних тіл синьогнійної палички
та 100 млн мікробних тіл протеїв.
Лікування інфікованих білих мишей проведено за наступними схемами: 1)
одночасно із зараженням однократне внутрішньосудинне уведення аспарциду
в об`ємі 0,5 мл; 2) двократне внутрішньосудинне уведення аспарциду в
разовій дозі 0,5 мл через 6 та 24 години після зараження; 3) двократне
підшкірне уведення аспарциду у разовій дозі 1 мл у перифокальну зону
інфекту одночасно та через 12 годин після зараження; 4) трьохкратне з
інтервалом 18 годин підшкірне уведення аспарциду у разовій дозі 1,0 мл,
починаючи через добу після зараження; 5) двократне внутрішньом`язове
уведення аспарциду в разовій дозі 0,5 мл одночасно та через 24 години
після зараження; 6) трьохкратне з інтервалом 18 годин внутрішньом`язове
уведення аспарциду через 24 години після зараження. Використання різних
схем парентерального уведення аспарциду мало за мету оцінку
порівнювальної хіміотерапевтичної ефективності при різних методах
уведення, а також випробування лікувально-профілактичних властивостей
препарату на різних етапах формування гнійно-некротичного процесу.
Результати випробування аспарциду на різних стадіях патогенезу
локалізованої гнійної інфекції, відповідно відтвореної зараженням
стафілококом, стрептококом, синьогнійною паличкою та мірабільним
протеєм, а також змішаною культурою цих збудників довели його високо
виражену лікувально-профілактичну активність при використанні усіх
задіяних методів і схем парентерального уведення, що виявилось
достатніми для попередження виникнення інфекційного процесу при
одночасному із зараженням використанні, а також для локалізації та
лікування вже сформованих вогнищ гнійно-некротичного ураження при
початку хіміотерапії у період розгорнутої клініко-морфологічної картини
захворювання. При цьому необхідно зазначити, що на стадії інфекування
усі використані методи парентерального уведення аспарциду майже з
рівноцінним ефектом попереджували виникнення вогнищ гнійно-некротичного
ураження у 90-100% білих мишей. На клініко-патогенетичній стадії
сформованого вогнища гнійно-некротичного ураження найбільш ефективним
виявився метод підшкірного уведення препарату, що закономірно
забезпечував вилікування тварин у термін від 2 до 4 діб поза залежністю
від розбіжностей етіології інфекційного процесу. При цьому слід
враховувати, що термін спонтанного вилікування тварин контрольної групи
складав 15-17 діб.
Для відтворення генералізованої інфекції білих мишей у якості
етіологічного фактора використано: стафілокок, синьогнійну паличку та
мірабільний протей. Досліди виконано на 480 білих мишах середньою масою
15-17 г. Зараження білих мишей проводили внутрішньочеревним уведенням
відповідних збудників у дозі ЛД50, визначеної для кожного мікроорганізму
методом пробіт-аналізу. Мікробні взвісі вводили у суміші з 0,4% водного
агару. Препарат випробовували шляхом використання однократних і
багатократних внутрішньосудинних, підшкірних та внутрішньочеревних
уведень при започаткуванні лікування одночасно із зараженням; через 6
годин після зараження; через 18 годин після зараження.
Лікувально-профілактичну активність аспарциду при генералізованій
інфекції білих мишей оцінювали за врахуванням наступних показників:
виживаємість тварин у встановлені терміни клінічного спостереження;
сумаційних термінів життя піддослідних білих мишей, що виражено у
мише-днях по відношенню до максимальних запланованих в даній групі;
результатів бактеріологічного дослідження органів та крові інфікованих
та загиблих тварин.
При аналізі одержаних результатів установлено, що випробуваний
антисептик аспарцид виявляє виражені лікувально-профілактичні
властивості при одночасному із зараженням однократному
внутрішньосудинному та внутрішньочеревному уведенні, попереджуя розвиток
та загибель 90-100% тварин унаслідок розвитку септицемії. При
використанні препарату за схемами багаторазового підшкірного та
внутрішньом`язового уведення захист інфекованих тварин від загибелі
становив 80-95%. При лікуванні тварин на стадії продромального розвитку
септицемії (через 6 годин після зараження) рівень захисту білих мишей
від загибелі при внутрішньочеревному уведенні становив 100%, при
внутрішньосудинному – 90-100%, при підшкірному –80%. У розпалі клінічної
картини експериментальної септицемії через 18 годин після зараження
хіміотерапевтичний ефект від внутрішньосудинного лікування аспарцидом
становив 75-80%; при внутрішньочеревному уведенні – 65-80%; при
підшкірному –60%; при внутрішньом`язовому 50-60%.
При контрольному бактеріологічному дослідженні крові та органів
вилікуваних тварин установлено стерильність досліджуваних біооб`єктів.
Підводячи загальні підсумки випробування хіміотерапевтичної активності
аспарциду правомірно дійти обґрунтованого висновку про те, що
розроблений антисептик володіє високо вираженими хіміотерапевтичними
властивостями при лікуванні локалізованої та генералізованої
експериментальної гнійної інфекції.
ВИСНОВКИ
На експериментально-теоретичному рівні обґрунтований новий напрямок у
створенні високо ефективних антисептиків природного походження, що
технологічно базується на використанні в якості спрямованого гідролізу
природних жирів кислих амінокислот із глюкогенними властивостями.
1. Уперше доведено закономірну наявність супутніх антимікробних
властивостей у кислих амінокислот, які за хімічною структурою
характеризуються як моноамінодікарбонові сполуки і за основними
фармакологічними ознаками відносяться до глюкогенних амінокислот.
2. На прикладі глютамінової та аспарагінової амінокислот, як типових
представників кислих моноамінодікарбонових кислот, розшифровано механізм
їх антимікробної спроможності. Показано, що прояви антимікробної
активності пов`язані зі спрямованим метаболізмом цих амінокислот, який
супроводжується відтворенням амідів дікарбонових кислот із притаманною
антимікробною здатністю.
3. Доведено, що аспарагінова й глютамінова амінокислоти характеризуються
широким спектром антимікробної активності щодо грампозитивних і
грамнегативних бактерій незалежно від показників їх антибіотикограм.
4. Обґрунтовано сумісне використання глюкогенних амінокислот з
антибіотиками на основі синергідного взаємопосилення антимікробної дії.
Показано, що під впливом субактивних концентрацій аспарагінової кислоти
вихідна антибактеріальна активність бензилпеніциліну збільшується в
залежності від видової належності тест-мікробів у 10-50 разів;
стрептоміцину сульфату – у 1,3-4 раза; еритроміцину фосфату – від 2 до
40 разів; гентаміцину сульфату – відповідно у 2 раза.
5. На основі спрямованого використання аспарагінової кислоти як
фактора кислого гідролізу риб `ячого жиру доведено, що під
цілеспрямованим впливом досліджуваної амінокислоти гідроліз риб`ячого
жиру супроводжується інтенсивним накопиченням у водній фазі альдегідів,
органічних пероксидів та вторинних спиртів жирних кислот, продуцентами
яких є не тільки водорозчинні, але й обмежено розчинні жирні кислоти.
6. Показано, що, на відміну від ектерициду, аспарцид виявляє кратно
підвищену та суттєво поширену за спектром антимікробну дію, не
відрізняється суттєво за токсичністю й алергеністю, завдяки чому
придатний для парентерального використання за антиінфекційним
призначенням.
7. На моделях локалізованої та генералізованої гнійної інфекції в
експериментальних тварин підтверджено виражену хіміотерапевтичну
активність аспарциду.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1. Рекомендовано використовувати препарати на основі аспарагінової та
глютамінової амінокислот у комплексних схемах антибіотикотерапії як
компонентів , які суттєво підвищують вихідні рівні специфічної
активності та бактерицидну дію антибіотиків.
2. Доцільно використання кислих амінокислот у технологіях створення
антисептиків природного походження на основі їх, гідролітичного впливу
на природні жири з утворенням водорозчинних та обмежено розчинних
похідних.
3. Основні положення та висновки роботи впроваджено в навчальний процес
кафедри мікробіології. вірусології та імунології Національного
фармацевтичного університету (м. Харків), Тернопільської медичної
академії, Вінницького державного медичного університету, Донецького
державного університету, Дніпропетровського медичного університету, у
післядипломної підготовці фахівців на базі НДІ імунопатології Російської
Академії Природничих Наук, ХМАПО. Розроблений препарат аспарцид включено
до перспективного плану виробничого засвоєння у НДІ імунопатології РАПН
(Москва).
ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Дубинина Н.В., Холупяк И.Ю. Антимикробний потенциал некоторых
амінокислот //Експе-риментальна і клінічна медицина – 2002. – №3. –
С.75-77. (Пошукувач здійснив мікробіологічне вивчення кислих
амінокислот).
Дикий І.Л., Дубініна Н.В., Стрельникова Ю.Л. Параметри потенційного
впливу аспарагінової кислоти на специфічну активність антибіотиків //
Буковинський медичний вісник – 2003. – №4. – С.149-152. (Пошукувач
дослідив синергізм між аспарагіновою кислотою та антибіотиками).
Дикий И.Л., Филимонова Н.И, Дубинина Н.В. Антимикробные свойства и
химиотерапевтическая активность нового антисептика аспарцида при
экспериментальной гнойной инфекции // Експериментальна і клінічна
медицина. – 2004. – №2. – С.43-46. (Пошукувач провів мікробіологічні та
хіміотерапевтичні дослідження антисептика аспарцида).
Неспецифическая иммунотерапия рассеянного склероза / Абидов М.Т.,
Дубинина Н.В., Петько А.П., Клименов А.Л. и др. // Аллергия и
иммунопатология. – 2004. – Т.5. – №1. – С.214. (Пошукувач довів
імунотропну активність глюкогенних амінокислот при лікуванні розсіяного
склерозу).
Вивчення специфічної активності протимікробних лікарських засобів /
Волянський Ю.Л., Гриценко І.С., Широбоков В.П., Дубініна Н.В. та інш. //
Метод. рекомендації. – Київ. – 2004. –38с. (Пошукувачем наведені сучасні
методи вивчення специфічної активності антисептиків).
Дубініна Н.В. Антимікробний потенціал глютамінової та аспарагінової
кислот // Пp. наукової студентської конф. – Харків, 2002. – С.183.
(Пошукувач здійснив мікробіологічне вивчення глютамінової та
аспарагінової кислот).
Дикий І.Л., Дубініна Н.В. Антимікробний потенціал аспарагінової кислоти,
її сумісність з антибіотиками і вплив на формування
антибіотикорезистентності // Тр. II Міжнародної науково-практичної
конф. “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація,
біотехнологія”. – Харків, 2003. – С.103. (Пошукувач довів вплив
аспарагінової кислоти на формування антибіотикорезистентності).
Дикий И.Л., Дубинина Н.В., Дикая Е.М. Зависимость сопутствующих
антимикробных свойств от стереохимической структуры кислых глюкогенных
аминокислот // Пр. Міжнародної наукової конф. ”Актуальні питання
боротьби з інфекційними захворюваннями.” Журнал Анали Мечніковського
інституту. – Харків, 2003. – №4-5. – С.131. (Пошукувач встановив
залежність рівней антимікробних активностей від особливостей
стереохімічних ізомерів глюкогенних амінокислот).
Дубініна Н.В., Дикий І.Л. Показники хіміотерапевтичної сумісності
аспарциду в комплексних схемах антибіотикотерапії // Пр. Міжвузівської
наукової конф. “Актуальні питання створення нових лікарських засобів”. –
Харків, 2004. – С.153. (Пошукувач визначив дозозалежні співвідношення
при сумісному використанні аспарциду та антибіотиків).
АНОТАЦІЯ
Дубініна Н.В. Протимікробні властивості глюкогенних амінокислот та їх
синергізм з антибіотиками. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового
ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 –
мікробіологія. – Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова
АМН України, Харків, 2004.
Досліджено антимікробну здатність кислих амінокислот із глюкогенними
властивостями. Доведено, що рацемати та стереохімічні D- ізомери
аспарагінової та глютамінової амінокислот відрізняються широким спектром
помірно вираженої мікробоцидної активності по відношенню до чутливих та
антибіотикостійких штамів грампозитивних бактерій. Розроблено новий
антисептик аспарцид, який відрізняється вираженою
лікувально-профілактичною активністю при експериментальній локалізованій
та генералізованій інфекції, яка етіологічно відтворена грампозитивними
та грамнегативними мікроорганізмами з вираженими піогенними
властивостями.
Ключові слова: аспарагінова кислота, глютамінова кислота, антибіотики,
гнійно-запальна інфекція.
АННОТАЦИЯ
Дубинина Н.В. Антимикробные свойства глюкогенних аминокислот и их
синергизм с антибиотиками. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой
степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 –
микробиология. – Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова
АМН Украины. Харьков, 2004.
Диссертация посвящена теоретическому обоснованию и экспериментальному
доказательству нового направления в создании высокоэффективного
препарата антимикробного назначения. На основе анализа существующих
направлений в создании антибиотиков и антисептиков, признано
перспективным использование природных жиров, как исходного субстрата для
получения путём гидролиза препаратов с выраженными микробоцидными
свойствами.
В качестве фактора гидролиза рыбьего жира использована аспарагиновая
кислота, как типичный представитель моноаминодикарбоновых кислот,
которая отличается низкими значениями рН и способна обеспечивать
эффективный гидролиз растворимых и ограничено растворимых жиров в
составе рыбьего жира, с продукцией в водную фазу альдегидов,
органических перекисей и вторичних спиртов.
Впервые установлено, что наряду с основными видами фармакологической
активности, кислые аминокислоты обладают умеренно выраженными
микробоцидными свойствами и способны оказывать антиинфекционные эффекты
при лечении инфекционно-аллергических заболеваний различной этиологии.
При этом в микробиологическом отношении кислые аминокислоты отличаются
выраженными микробоцидными свойствами, уровни проявления которых не
зависят от чувствительности или резистентности микроорганизмов к
антибиотикам.
Установлено, что кислые аминокислоты способны синергидно
взаимодействовать с антибиотиками, кратно повышая их исходную
активность, придавая преимущественно бактерицидные свойства и снижая их
селективный потенциал.
Одновременно показано, что наличие сопутствующих антимикробных свойств
присуще лишь рацематам и D- изомерам этих аминокислот. Отличаясь умерено
выраженной бактерицидной активностью, DL- и D- изомеры этих аминокислот
проявляют микробоцидное действие путем восстановительного метаболизма до
амидов, перекисей и альдегидов дикарбоновых аминокислот.
Разработана технология получения антисептика аспарцида на основе
гидролитического воздействия на нейтральную молекулу рыбьего жира
аспарагиновой аминокислотой. Показано, что аспарцид обладает широким
спектром избирательно выраженных микробоцидных свойств по отношению к
чувствительным и устойчивым к антибиотикам микроорганизмам. В отличие от
своего аналога (эктерицида), аспарцид пригоден для парентерального
применения при лечении инфекционных и гнойно-воспалительных заболеваний.
На экспериментальной моделе локализованой и генерализованой гнойной
инфекции, соответственно воспроизведенной грамположительными и
грамотрицательными пиогенными бактериями, а также их смешанными
культурами, подтверждена высоко выраженная химиотерапевтическая
активность разработанного препарата, которая на стадии инфецированности
и продромы достаточна для 90-100% предупреждения развития заболевания.
На стадии развернутой клинической картины септикопиемии, посхемное
применение аспарцида при внутрибрюшинным способе введения обеспечивает
65-80% защиты от гибели, при внутривенном 75-80%, при использовании
подкожно и внутримышечно – защитний эффект инфицированных животных
соответственно составляет 50% и 60%.
Получен новый антисептик аспарцид, который характеризуется выраженной
микробоцидной активностью по отношению к широкому спектру чувствительных
и устойчивых к антибиотикам патогенных и условно-патогенных
микроорганизмов, а также выраженной лечебно-профилактической активности
при локализованной и генерализованной гнойной инфекции.
Ключевые слова: аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота,
антибиотики, гнойно-воспалительный процесс.
SUMMARY
Dubinina N.V. Antimicrobial properties of glucogenic amino acids and
their synergism with antibiotics.-Manuscript. The dissertation on
reception of a scientific degree of the candidate of medical sciences
behind a speciality 03.00.07-microbiology.-Institute of microbiology and
immunology by I.I.Metchnikov AMS of Ukraine, Kharkov, 2004.
It was investigated the antimicrobial ability of acidic amino acids with
glucogenic properties. Is proved, that the racemates and stereochemical
D-isomers aspartic and glutaminic amino acids differ by a wide spectrum
some expressed microbocydic activity in relation to responsive and
antibioticresistance of strains Gram-positive bacterias. The new
antiseptic asparcid is developed which differs by the expressed
treatment-and-prophylactic activity at an experimental localized and
generalized infection contamination, which etiologically is reproduced
by Gram-positive and Gram-negative microorganisms with the expressed
pyogenic properties.
Key words: aspartic acid, glutaminic acid, antibiotics, purulent –
inflammatory infection contamination.
PAGE 1
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
