.

Дослідження експресії і активності нітрооксидсинтаз і функції серця при ішемії–реперфузії міокарда (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
115 3051
Скачать документ

Національна Академія Наук УкраЇнИ

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця

ГАРМАТІНА ОЛЬГА ЮРІЇВНА

УДК 616.127-005.8:616.124+577.127+

612.173:612.13+612.17.015.3

Дослідження експресії і активності нітрооксидсинтаз і функції серця при
ішемії–реперфузії міокарда

14.03.04 – Патологічна фізіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі експериментальної кардіології

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, академик НАНУ,

Мойбенко Олексій Олексійович,

завідувач відділу
експериментальної кардіології,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,

Ткаченко Михайло Миколайович,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник відділу кровообігу

доктор біологічних наук,
професор кафедри біохімії,

Матишевська Ольга Павлівна,

Київський національний університет ім.. Тараса Шевченко,

професор кафедри біохімії

Провідна установа: Науково-дослідний Інститут кардіології ім.
М.Д.Стражеска АМН України

Захист відбудеться “ 11 ” січня 2005 року о 14 00 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті
фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: за адресою: 01024, м. Київ,
вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул.
Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “ 11 ” грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук

З.О.Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Участь оксиду азоту (NO) в регуляції серцево-судинної
системи зумовлює особливу роль цієї молекули в розвитку порушень
міокарду. При вивченні ролі NO у розвитку патологічних станів серця
з’являється все більше даних про його неоднозначний вплив на функцію
міокарду. Сучасні дослідження показали, що в серці експресуються всі три
ізоформи NO-синтаз (eNOS, nNOS, iNOS) [Takimoto Y. et al., 2000]. З
конститутивними NOS пов’язують протективні властивості оксиду азоту,
такі, як вазодилятація, пригнічення процесів агрегації, відкривання
К(АТФ)–каналів, регуляція коронарної циркуляції та серцевих скорочень
[Kojda & Kottenberg, 1999; Gewalting & Kojda, 2002]. При патологічних
умовах, зокрема, при інфаркті міокарда, гіпертензії, стенокардії,
кардіоміопатіях, серцевій недостатності та інших, збільшується експресія
і активність індуцибельної NOS (iNOS), що приводить до значного
збільшення рівня оксиду азоту в міокарді. З високою активністю іNOS
пов’язують міокардіальну дисфункцію. Проте, як буде впливати NO/iNOS на
діяльність серця за умов ішемії–реперфузії міокарда і досі не існує
єдиної думки, а дані різних авторів з цього приводу суперечливі. З
одного боку було виявлено кардіодепресивний ефект оксиду азоту, який
супроводжується дисфункцією серця, некрозом кардіоміоцитів [Cui S. et
al., 1998; Arstall M. et al., 1999; Feng Q. et al., 2001] і застосування
блокаторів його синтезу приводить до відновлення функції та зменшення
пошкодження міокарда [Wildhirt S. et al., 1996,1999; Matsuoka H. et al.,
1998]. З другого боку є дані про кардіопротективний вплив оксиду азоту
[Pabla R. et al., 1996; Guo Y. et al., 1999; Takano H. et al., 1999;
Bolli R. et al., 2001; Zingarelli et al.., 2002].

На сьогодняшній день недостатньо дослідженим лишилось питання про
ендогенну продукцію NO індуцибельною NO-синтазою, експресію та зміни
активності NO-синтаз у ранні терміни ішемії–реперфузії міокарду,
взаємозв’язок з модуляцією активності циклооксигеназного шляху
метаболізму арахідонової кислоти та функцією серця. Мало вивченим
виявилося питання про регуляцію утворення оксиду азоту в різних відділах
серця, зокрема в правому і лівому шлуночках, а також питання про вплив
оксиду азоту на кальцієвий гомеостаз серця, особливо на Са2+– поглинаючу
функцію кальцієвими депо кардіоміоцитів..

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було з’ясування ролі
індуцибельної NO-синтази в розвитку дисфункції міокарда і порушень
коронарного кровообігу в ранні терміни ішемії–реперфузії серця.

Для її досягнення були поставлені такі задачі:

Провести порівняльний аналіз змін експресії iNOS і активності NO-синтаз
в міокарді правого і лівого шлуночків при моделюванні ішемії–реперфузії
ізольованого серця щура;

Вивчити зміни експресії iNOS і активності NO-синтаз в міокарді при
індукції і специфічній блокаді iNOS та порівняти їх в міокарді правого
та лівого шлуночків при ішемії–реперфузії ізольованого серця щура;

Дослідити вплив індукції iNOS за допомогою ліпополісахариду і
специфічної блокади iNOS на функцію серця і коронарний кровообіг при
моделюванні ішемії–реперфузії міокарда;

Провести порівняльний аналіз змін експресії iNOS і активності NO-синтаз
з функцією серця при моделюванні ішемії–реперфузії міокарда;

Дослідити вплив оксиду азоту на швидкість поглинання кальцію
саркоплазматичним ретикулумом міокарда щура за допомогою донора NO –
SIN-1;

Вивчити вплив блокатора циклооксигенази – індометацина і простагландина
Е2 на скоротливу функцію серця щура, експресію iNOS білка і активність
NO-синтаз в міокарді при моделюванні ішемії–реперфузії серця.

Об’єкт дослідження: ізольоване серце щурів, гомогенат міокарда.

Предмет дослідження: біохімічні показники активності ферментів,
експресія білка, параметри кардіодинаміки.

Методи дослідження: У роботі були використані наступні методи:

фізіологічні – перфузія ізольованого серця за методом Лангендорфа,
визначення показників скорочувальної функції серця та коронарного
кровообігу;

біохімічні – визначення активності NO-синтаз, вестерн–блот–аналіз;

біофізичні – вимірювання поглинання Са2+ везикулами саркоплазматичного
ретикулума.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано нові дані про роль
системи оксиду азоту та її взаємозв’язок з циклооксигеназним шляхом
метаболізму арахідонової кислоти в розвитку порушень діяльності серця
при ішемії–реперфузії міокарду. Показано, що пригнічення скоротливої
функції міокарду відбувається одночасно з підвищенням активності iNOS та
може бути частково попереджено специфічним гальмуванням iNOS. Показано,
що за умови індукції експресії iNOS індометацин і ПГЕ2 мають
антиаритмічний ефект, можливо за рахунок пригнічення експресії та
зниження активності iNOS в міокарді.

Вперше проведено порівняльний аналіз відмінностей експресії і активності
NO-синтаз у правому і лівому шлуночках серця як на фоні індукції iNOS,
так і без неї при моделюванні ішемії–реперфузії міокарду щура.
Встановлено, що активність і експресія iNOS є вищими в міокарді правого
шлуночка серця. Вперше показано, що зниження експресії iNOS під впливом
ПГЕ2 більшою мірою відбувається в міокарді правого шлуночка. Показано,
що прозапальні процеси в міокарді посилюють депресивні ефекти
активованої iNOS при ішемії–реперфузії.

Теоретичне і практичне значення роботи. Отримані результати мають як
теоретичне, так і практичне значення. Вони розширюють уявлення про
механізми розвитку дисфункції міокарду за ішемії–реперфузії та сприяють
глибшому розумінню її механізмів. Отримані дані мають значення для більш
повного розуміння метаболізму оксиду азоту в різних відділах серця
(правому і лівому шлуночках), що дозволяє пояснити відмінності в
розвитку та перебігу патологічних процесів у великому і малому колах
кровообігу.

Встановлення шляхів синтезу NO у міокарді за патологічних умов може бути
підставою для розвитку нових і доповнення вже існуючих напрямів
лікування захворювань серцево-судинної системи, особливо гострих
процесів (інфаркту міокарду, стенокардії, операцій на серці,
трансплантації), що розвиваються на фоні хронічних патологій.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено науковий пошук
та обгрунтування напрямку досліджень. Самостійно проведено
експериментальні дослідження, статистичну обробку одержаних результатів
та їх аналіз, сформульовано основні висновки роботи, підготовлено до
публікації матеріали експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідалися на: ІІ міжнародній науково-практичній конференції
“Дисфункція ендотелію” (Вітебськ, Білорусія 2002), міжнародній
конференції “Автоматизований аналіз гіпоксичних станів” (Нальчік, Росія,
2003); міжнародній науковій конференції “Гомеостаз: фізіологія,
патофізіологія, фармакологія та клініка” (Одеса, Україна, 2003);
III-Всеросійській з міжнародною участю школі-конференції з фізіології
кровообігу (Росія, Москва, 2004); 24-й щорічній науковій сесії
Європейської секції досліджень серця (Дрезден, Германія, 2004), III-му
Російському конгресі з патофізіології з міжнародною участю
“Дисрегуляторна патологія” (Росія, Москва, 2004).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано у 9 роботах, з яких 5 –
статті у наукових фахових виданнях, 4 – тези доповідей на наукових
конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 163 сторінках
друкованого тексту та ілюстровано 24 рисунками та 3 таблицями. Робота
складається із списку скорочень, вступу, огляду літератури, розділів
описання матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження,
обговорення результатів, висновків, списку використаних джерел, що
нараховує 334 найменувань.

Основний зміст РОБОТи

Матеріали та методи досліджень. Досліди виконувались на щурах–самцях
лінії Вістар вагою 250–350 г з дотриманням усіх вимог щодо роботи з
лабораторними тваринами. Проведено 2 серії експериментів, які було
поділено на такі групи: I – вплив індукції iNOS на скоротливу функцію
міокарду і коронарний кровообіг при ішемії–реперфузії серця щура
(рис.1): 1 – контрольна група: ішемія–реперфузія ізольованого серця щура
без добавок; 2 – активація індукції iNOS за допомогою ліпополісахарида
(ЛПС) в концентрації 0,25 мг/кг внутрішньоочеревинно за 18 годин до
початку експерименту; 3 – специфічна блокада iNOS за допомогою 1.3-PBIT
(“Sigma”, США), який додавали в перфузійний розчин в кінцевій
концентрації 50 нмоль/л; 4 – блокада циклооксигенази (СОХ) неспецифічним
блокатором індометацином (“Sigma”, США), який додавали в перфузійний
розчин в кінцевій концентрації 100 мкмоль/л; 5 – вплив на фоні введення
індометацина простагландина Е2 (“Sigma”, США), який вводили в
перфузійний розчин в концентрації 1 мкмоль/л протягом останніх 5 хв
перед ішемією через мікрокатетер; II – дослідження впливу донора NO на
швидкість поглинання кальцію саркоплазматичним ретикулумом в гомогенаті
міокарда щура: 1 – контрольна група, 2 – специфічна блокада
Са2+–уніпортера мітохондрій рутенієвим червоним (25 мкмоль/л) (РЧ), 3 –
додавання в середовище інкубації донора NO – 3-морфоліносіднонімина (30
мкмоль/л) (SIN-1, “Sigma”, США), 4 – додавання SIN-1 і рутенієвого
червоного, 5 – додавання SIN-1 і L-метіоніна (20 ммоль/л) – скавенджера
пероксинітрита; 6 – додавання SIN-1 і супероксиддисмутази (СОД, 100 од,
“Sigma”, США) – скавенджера супероксиданіона ((О2().

Перфузія ізольованого серця за методом Лангендорфа. Тварин анестезували
уретаном (125 мг/кг, в/о), вводили гепарин (250 од/кг) за 10 хв до
вилучення серця. Проводили торакотомію, швидко видаляли серце, яке
одразу поміщали в льодовий розчин Кребса. Серце ретроградно перфузували
модифікованим розчином Кребса (37(С, рН=7,4), насиченим карбогеном (95%
O2 і 5% CO2). У порожнину лівого шлуночка вставляли латексний балончик,
з’єднаний з тензодатчиком. Реєстрували перфузійний тиск у коронарних
судинах (ТКС) за умов постійної об’ємної швидкості перфузії та тиск в
лівому шлуночку (ТЛШ) за допомогою багатоканального полікардіографа
Мінгограф–82 (“Elema”, Швеція). Кількість аритмій обраховувалась на
ділянках, де на протязі 1 хв їх кількість була максимальною. Серце
стабілізували 20 хв, після чого моделювали ішемію-реперфузію шляхом
повної зупинки перфузії на 30 хв з подальшою реперфузією впродовж 40 хв.

Визначення активності NO-синтаз. Активність NO-синтаз в лівому шлуночку
(з міжшлуночковою перегородкою) і в правому шлуночку серця визначали за
допомогою комбінації методів [Moncada S. et al., 1991] та [Chin S. et
al., 1999], пристосовану для спектрофотометричного вимірювання продукту
реакції – нітрит–аніона [Vodovodz Y. et al., 1994]. Активність NOS
представляли в пікомолях NO, що утворювався за 1 хв на 1 мг загального
білка гомогенату серця. Вміст загального білка в пробах визначали
методом Бредфорда [Bradford M., 1976]. Активность Ca2+-незалежної
NO–синтази (iNOS) визначали аналогічним чином, додаючи в середовище
інкубації 4 ммоль/л EGTA замість CaCl2 [Green L. et al., 1982].
Активність Ca2+-залежної NOS (сNOS) обраховували як різницю загальної
активності NO-синтаз та активності Ca2+- незалежної NOS.*

Вестерн–блот–аналіз. Дослідження експресії іNOS в міокарді проводили за
допомогою апаратного комплексу та протоколу Bio–Rad Laboratories (США) з
використанням реагентів фірми “Sigma” (США). Тканини лівого (з
міжшлуночковою перегородкою) і правого шлуночків серця механічно
подрібнювали в рідкому азоті та гомогенізували в ультрагомогенізаторі,
додаючи лізис-буфер і інкубували 30 хв на льоду, потім центрифугували 20
хв при 10 000g і 4?С. Вміст білка в пробі визначали за методом ВСА–1
(“Sigma”, США). Супернатанти (по 50 мкг білка) розділяли на 7,5%
SDS–PAGE і переносили на PVDF–мембрани (“Bio–Rad”), які блокували 4%-м
розчином желатину 18-20 год, обробляли поліклональними
анти–іNOS–антитілами (“Sigma”, США) 2 год, після відмивання обробляли
антикролячим IgG кози і забарвлювали за допомогою ExtrAvidinPeroxidase
Staining Kit (“Sigma”, США).

Вимірювання швидкості поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом (СР)
в гомогенатах міокарда щурів в присутності оксалата. Швидкість
поглінання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом вимірювали в гомогенатах
міокарда щурів [Loukianov E. et al., 1999; Saborido A. et al., 1999].
Тварин анестезували уретаном (125 мг/кг, в/о), вводили гепарин (250
ед/кг). Грудну порожнину відкривали і видаляли серце, яке одразу
поміщали в льодовий фізіологічний розчин. Після видалення передсердь,
великих судин і правого шлуночка міокард гомогенізували за допомогою
гомогенізатора Поттера (тефлон/скло, 1000 об/хв). Протягом досліду
гомогенати тримали на льоду. АТФ–азну активність мітохондрій (МХ)
блокували азидом натрію (10 ммоль/л) [Kawata T. et al., 1988].
Накопичення Са2+ у присутності оксалату запускали АТФ (2 ммоль/л) та
вимірювали кальційчутливим електродом (фірма “Orion”, США) у
термостатованій камері (37оС). Швидкість транспорту вимірювали за умов
специфічної блокади мітохондріального уніпортера рутенієвим червоним
(РЧ) (25 мкмоль/л) і без такої. Швидкість поглинання Са2+ везикулами СР
представляли в мікромолях Са2+ за 1 хв на 1 г тканини серця.

Експериментальні результати обробляли за допомогою статистичної програми
“Origin 6.0”. Статистичний аналіз отриманих даних проводився за
допомогою методів варіаційної статистики з використанням t–критерію
Стьюдента для оцінки вірогідності відмінностей груп даних. Статистично
вірогідними вважалися результати, для яких Р^?Eee| Ue TH 0T ‚ o \^( & & ???????e ??????? ?? ?????? ooocOOoccEooooA??? Iщо регуляція акумуляції і виходу кальція у клітинах може відбуватись і при участі оксиду азоту [Stoyanovsky D. et al., 1997; Xu K. et al., 1999]. Оксид азоту змінює функцію серця, його метаболізм і впливає на кальцієвий гомеостаз та скоротливу функцію міокарда [Campbell D. et al., 1996; Kelly R. et al.,1996; Carmeliet E., 1999]. Але механізм його впливу на внутрішньоклітинні депо кальцію до останнього часу остаточно не з’ясован. Для оцінки поглинання Са2+ СР нами було використано гомогенат міокарда щура. Було створено умови, оптимальні для накопичення Са2+ у везикулах СР, а саме введення у середовище інкубації оксалату калію (10 ммоль/л), інгібітора АТФ-азної активності мітохондрій азиду натрію (10 ммоль/л), АТФ (2 ммоль/л). При інкубації з оксалатом запобігається участь рианодинових рецепторів у зміні концентрації кальцію в середовищі інкубації. Середнє значення швидкості поглинання Са2+ везикулами саркоплазматичного ретикулума міокарду за цими умовами склало 5,2±0,5 мкмоль Са2+/хв на г тканини (n=6) (рис.7). Для дослідження впливу мітохондрій на поглинання Са2+ ми використали високоспецифічний блокатор Са2+-уніпортера рутенієвий червоний (РЧ) (25 мкмоль/л) [Trolinger et al., 2000], що дозволило заблокувати вхід Са2+ в мітохондрії і виключити їх участь в поглинанні Са2+ з середовища інкубації. Це дозволило зареєструвати вхід Са2+ саме у везикули СР. В наших експериментах РЧ викликав збільшення швидкості поглинання Са2+ на 110% (Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020