НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
Гребенюк Сергій Едуардович
УДК [354.3 + 577.38]:577.352:612.822
Роль екстрасинаптичних НМДА рецепторів в СА3-СА1 збуджуючій синаптичній
передачі у гипокампі щурів
03.00.02 – биофизика
Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної
Академії Наук України
Науковий консультант: академік, доктор біологічних наук Кришталь Олег
Олександрович, зав відділом клітинної мембранології Інституту
фізіології ім О.О.Богомольця
НАН України
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Веселовський Микола Сергійович. –
заступник директора Міжнародного центру Молекулярної Фізіології НАН
України
доктор біологічних наук, професор Костерін Сергій Олексійович. – зав.
відділом біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН
України
Провідна установа: Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця,
кафедра нормальної фізіології.
Захист відбудеться 28.10.2004 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул.
Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України.
Автореферат розісланий 27.09.2004 р.
Вчений секретар спеціалізовоної ради,
доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.
Донедавна вважалося, що (синаптична) передача хімічного сигналу від
одного нейрона (пресинаптичного) іншому (постсинаптичному) здійснюється
незалежно від інших синаптичних контактів. Відповідно до цього допущення
Хеббом був постульований принцип модифікації зв’язку між нейронами в
залежності від їхньої активності(Bertіl Hіlle, 2001). Однак, недавно був
опублікований ряд робіт (Rusakov, 1998 59 /іd;Dіamond, 1998
;Arnth-Jensen, 2002), у яких показано, що принцип незалежності синапсів
може порушуватися в умовах збільшеної імовірності звільнення медіатора.
Зокрема показано, що глутамат, який вивільнається при синаптичній
передачі, може активувати N-метил-D-аспартат (НМДА) рецептори, що не
належать даному синапсу. Сформувалася гіпотеза “спіловера”, відповідно
до якої медіатор, звільнений однією синаптичною терминалью, може шляхом
дифузії активувати рецептори, що лежать поза постсинаптичною щільністю
рецепторів. Таким чином, виникло припущення про “перехресну” активацію
синапсів, коли активація одного синапса призводить до активації
сусіднього. Явище перехресної активації синапсів вимагає пересмотрения
поглядів, що сформувалися, на процес синаптичної передачі, як
організованого процесу передачі інформації в структурованих
інформаційних мережах.
Вихід медіатора далеко за межі синаптичної щілини при підвищеній
нейрональній активності, може служити механізмом зв’язку нейрональної
активності з багатьма патологічними процесами в мозку. Зокрема,
епілептичні й ішемічні стани, травми мозку, нейродегенеративні процеси,
порушення в активності вісі гіпоталамус-гіпофіз-надниркова залоза
зв’язані з порушеннями нормальної роботи глутаматергичної передачі.
Особлива роль в індукції нейродегенеративних процесів приділяється НМДА
рецепторам. Гіперактивність цих рецепторів призводити до підвищеного
входу кальцію в клітину й активації каскаду біохімічних реакцій, що
призводять до загибелі нейронів. Відповідно, блокатори цих рецепторів
активно досліджуються як протисудомні, анальгетичні і противоішемічні
препарати.
Можна припустити, що ініціація і розвиток патологічних процесів можуть
бути пов’язані з активацією “надлишкових” екстрасинаптических
глутаматних рецепторів. Крім того, глутаматергічна передача лежить в
основі пластичних змін синаптичної передачі; тому, роль
екстрасинаптичних глутаматних НМДА рецепторів у процесах
запам’ятовування може виявитися несподівано великою.
Ціль роботи полягала в з’ясуванні механізмів посилення постсинаптичного
сигналу в СА3-СА1 збуджуючій синаптичній передачі в зрізах гипокампу
щурів в умовах збільшеного викиду глутамату, зокрема, при пачковому
характері пресинаптичної активності.
Для досягнення даної мети були поставлені наступні задачі.
Дослідити умови виникнення НМДА компонента ЗПСС із повільною кінетикою
деактивации (“повільний компонент”) при збільшеній імовірності викиду
медіатора.
Перевірити припущення про те, що даний компонент опосередкований
активацією екстрасинаптичних НМДА рецепторів.
Дослідити роль глутаматного транспорту в активації екстрасинаптичних
рецепторів.
Дослідити довготривалі зміни синаптичної передачі, викликані пачковою
активністю
Дослідження проводилися відповідно до планів наукової роботи відділу
фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім.
А.А.Богомольця НАН України і Міжнародного Центра молекулярної біології
за темою “Вивчення физиологичеких механізмів, що забезпечують включення
НМДА рецепторів у зоні СА1 гипокампау за патофізіологичних умов”.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ.
Матеріали та методи досліджень. В експериментах були використані білі
щури лінії Вістар WAG\GSto (Москва, Росія) віком 18-30 діб, що
підтримувалися на стандартній лабораторній дієті у віварії Інституту
фізіології ім. А. А. Богомольця НАН України. Для дослідження синаптичної
передачі в гипокампі щурів були використані наступні методичні підходи:
а) приготування зрізів гипокампу щурів;
б) реєстрація антидромно- і ортодромно- викликаних потенціалів дії у
відповідь на електричну стимуляцію зрізу;
в) реєстрація збуджуючих постсинаптических струмів у нейроні СА1 при
фіксації потенціалу;
г) моделювання біофізичних характеристик пірамідного нейрона CA1.
Приготування зрізів. Після декапитації тварини обидві півкулі мозку
швидко переносили в чашку Петри, що містила охолоджений (~0оС) розчин
наступного складу (у милимолях): NaCl 125; NaHCO3 26; KCl 5; MgCl2 3;
глюкоза 20. Розчин постійно насичувався газовою сумішшю ПРО2 (95%) і CO2
(5%), рн розчину при цьому підтримувався на рівні 7,35-7,4. Для
запобігання травматичного ушкодження внаслідок гіперактивації
НMDA-рецепторов використовували розчин, що не містить іонів Са2+. Після
охолодження гипокамп переносили на покритий фільтрувальним папіром
вакуумний столик для відведення розчину, що подається зверху, та
фіксації гиппокампа у певному положенні. Зрізи товщиною 300-600 мкм
нарізали з використанням леза при постійному змочуванні поверхні
гипокампу. Приготовані в такий спосіб зрізи витримувались 60-90 хв.
перед експериментом.
Електрофізіологічна реєстрація. Реєстрацію електрофізіологічних
параметрів проводили при кімнатній температурі в экстраклеточному
розчині наступного складу (у мМ): NaCl 135; NaHCO3 18; KCl 2,7; СаСl2
2,5; MgCl2 0,5; глюкоза 20 (p 7,35-7,4 при насиченні газовою сумішшю
ПРО2 і CO2). Гальмівні впливи, опосередковані активацією ГАМКА-
рецепторів усували, додаючи в позаклітинний розчин антагоністи цих
рецепторів бікукулін чи пікротоксин у концентрації 25-50 мкм.
Реєстрація викликаних популяционных потенціалів. Для одержання
викликаних синаптических відповідей у поле СА1 гиппокампа
використовувалася біполярна стимуляція коллатералей Шаффера за допомогою
подвійних, ізольованих по всій довжині, крім кінчиків, ніхромових
електродів товщиною 50 мкм. Стимуляція імпульсами струму 0,1-1 мА чи
напругою 3-30 мВ тривалістю 100-250 мкс забезпечувалося за допомогою
гальванично ізольованого стимулятора. Для відведення популяційних
потенціалів використовували електроди з низьким опором. Реєстрацію
потенціалів чи ЗПСП проводили, занурюючи електрод на невелику глибину в
зріз, відповідно в зону тіл пірамідних нейронів (stratum pyramіdale) і
зону дендритів (stratum radіatum)
Реєстрація викликаних ЗПСС. Зріз гипокампу перерізали між stratum
pyramіdale та stratum orіens тонким струменем экстраклеточного розчину.
Потім видаляли частину альвеусу, чим забезпечували вільний доступ до тіл
пірамідних нейронів. Також були ізольовані зони CA3 і CA1, шляхом
перерізання аксонів нейронів СА3, для запобігання паразитної збудливості
рекуррентных проекцій зони СА3. Реєстрацію ЗПСС проводили за методом
петч-кламп (patch-clamp) у конфігурації “ціла клітина” за допомогою
скляних мікропіпеток. Фіксацію мембранного потенціалу здійснювали шляхом
подачі командного потенціалу на два хлор-срібних електроди, один із яких
був занурений у позаклітинний, а інший у внутрішньоклітинний розчин.
Внутрішньоклітинний розчин містив (у мм): Cs 100; Na2PO4 40; HEPES-CsOH
10; Trіs-Cl 10 (p 7.3). Після заповнення мікропіпетки
внутрішньоклітинним розчином її опір складав 2-3 MОм. Сигнал
перетерплював посилення і фільтрацію з частотою зрізу 1-3 кГц
(підсилювач Bіologіc Іnc., Франція), далі був оцифрований з частотою
дискретизації 1-10 кГц (у залежності від необхідності) і був записаний
на твердий носій. Хід експерименту контролювався за допомогою
комп’ютера, обладнаного платою АЦП/ЦАП.
Біофізична модель пірамідного нейрона CA1. У спробах врахувати вплив
усіх можливих джерел погіршення контролю фіксації мембранного потенціалу
була побудована і проаналізована біофізична модель типового нейрона CA1.
Для побудови моделі використовувалося загальнодоступна і широко відомf
програма NEURON v 5.3 2002 (John W. Moore, Mіchael Hіnes, Ted
Carnevale).
Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 1 Зміна кінетики ЗПСС при збільшенні
амплітуди ЗПСС, отримане при аналізі моделі пірамідного нейрона CA1.
Модель була отримана шляхом модифікації моделі, що була використана у
роботі (M.Mіglіore, 1999). Модифікована модель була позбавлена
апікального дендритного дерева, що відображало видалення альвеолярного
шару зрізу гипокампу. Оскільки перфузія постсинаптического нейрона Cs
блокує функціонування потенциалзалежних кальцієвих та калієвих каналів,
модельний нейрон також був позбавлений цих мембранних механізмів. Інші
параметри моделі (опір піпетки, температура й ін.) були приведені у
відповідність до експериментальних. У якості пресинаптических і
постсинаптических механізмів використовувалися механізми, описані в
(Destexhe, 1998).
Експерименти з модельним нейроном полягали в наступному. Збільшуючи
щільність постсинаптического розташування НМДА синапсів, ми збільшували
в такий спосіб величину ЗПСС, аналізуючи при цьому його кінетику.
Результати експериментів наведені на REF _Ref69723722 \h \*
MERGEFORMAT Рис. 1 . Результати свідчать, що кінетика спаду ЗПСС
сповільнюється при збільшенні амплітуди. Але зміни у величинах
перенесеного заряду при зміні амплітуди струму, отримані а наших
электрофизиологических експериментах на порядок перевищують зміни,
передбачені моделлю. Також, експерименти показали, що величина вхідного
опору не робить значного впливу на кінетику ЗПСС, імовірно, тому що опір
аксоплазмы вилучених дендритів перевищує опір піпетки. Отже, принаймні
на якісному рівні, аналіз кінетики ЗПСС може бути використаній для
отримання інформації про зміни властивостей синаптичної передачі.
Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 2 Вольт-амперная характеристика НМДА каналів
в експериментальних умовах
Вольт-амперна характеристика НМДА каналів. Використавши данні (Bertіl
Hіlle, 2001) про проникність НМДА каналів для різних іонів і
концентрації іонів в експериментальних розчинах, ми проаналізували
теоретичну вольт-амперну залежність НМДА каналів для визначеності в
інтерпретації експериментальних даних ( REF _Ref70664072 \h \*
MERGEFORMAT Рис. 2 ). Розрахунки показали, що в загальному випадку
амплітуда ЗПССНМДА при позитивному потенціалі приблизно в 2 рази менше,
ніж при негативному потенціалі з тим же модулем. ЗПСС, зареєстровані в
ході експериментів, відповідали отриманої теоретичної залежності.
Результати досліджень.
Моделювання збільшення імовірності викиду медіатора. У гипокампі калієві
канали (Kv1.4, Kv1.1, Kv 1) розташовані поблизу збуджуючих синапсів з
пресинаптичної сторони (Cooper, 1998). Для цих каналів, що швидко
інактвуються, показана участь у регуляції входу кальцію в пресинаптичну
терміналь (Geіger, 2000). Блокування або інактивація цих каналів
призводить до зменшення реполяризуючої компоненти потенціалу дії (ПД) і,
отже, до збільшення тривалості ПД. По прибуттю в пресинаптичну
терміналь, ПД викликає більш тривалу деполяризацію мембрани і, отже,
збільшений приплив іонів кальцію в терміналь, що у свою чергу призводить
до збільшення імовірності злиття примембранных везикул із пресинаптичною
мембраною. Збільшення імовірності викиду медіатора моделювалося або
додаванням 4-амінопірідіну (блокатора калієвих каналів А-типу) або
високочастотною стимуляцією. Висока частота проходження ПД перешкоджає
виходу з інактивації калієвих каналів, що цілком аналогічно їхньому
блокуванню.
Зміна кінетики ЗПСС при збільшенні імовірності викиду медіатора. Всі
описані в роботі експерименти проводилися з ізольованим НМДА компонентом
ЗПСС (реєстрація відбуваліся в присутності 10mkМ NBQX, антагоніста
(-аміно-3-гидроксі-5-метил-4-ізоксазол-пропіонова кіслота (АМПА)
рецепторів, оскільки експерименти показують, що в умовах збільшеного
викиду медіатора зміна кінетики є характерною тільки для НМДА
компонента, хоча фасилітацию перетерплювали обидва компоненти ( REF
_Ref69730213 \h \* MERGEFORMAT Рис. 3 .)
Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 3 . Зміни АМПА компоненти (в присутності
50мкМ APV, ліворуч) та НМДА компоненти (в присутності 10мкМ NBQX,
праворуч) в результаті збільшення імовірності викиду медіатора. Vh = –
45 мВ.
ЗПССНМДА вимірювався в нейронах СА1 гипокампу при потенціалі +50 мВ або
-45 мВ у відповідь на електричну стимуляцію колатералей Шаффера.
Стимуляція велася поодинокими стимулами або короткими пачками (2-9
стимулів з частотою 200Гц, що імітує природний патерн активності
(Dobrunz, 1999)). Після стимуляції пачкою спад ЗПССНМДА (ЗПССНМДАПАЧКА)
драматично сповільнювався REF _Ref69737365 \h \* MERGEFORMAT Рис. 4
, B, запис a,c).
Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 4 Ступінь уповільнення кінетики спаду
ЗПССНМДА як функція кількості стимулів. А,B, залежність кінетики
ЗПССНМДА від кількості стимулів. Велика амплітуда відповідає більшій
кількості стимулів. Перенесений заряд при одиночній стимуляції прийнятий
за одиницю. С, D, Окремий випадок даної залежності: a, запис ЗПССНМДА
від одиночного стимулу, b,c, записи ЗПССНМДА після пачки з 7 стимулів.
Запис с отриман при зменшенні сили стимулу в ~2 рази. D, Уповільнення
кінетики спаду ЗПССНМДА після пачки з 7 стимулів кількісно виражається
збільшенням перенесеного заряду.
Ми досліджували кінетику спаду ЗПССНМДАПАЧКА, змінюючи кількість
стимулів у пачці. REF _Ref69737365 \h \* MERGEFORMAT Рис. 4
демонструє поступову зміну кінетики спаду ЗПССНМДАПАЧКА з ростом
кількості стимулів, що їшли з частотою 200 Гц. На REF _Ref69737365 \h
\* MERGEFORMAT Рис. 4 ,С оцінено залежність кількості Ca2+, що війшов у
клітину від кількості стимулів у пачці. Темним кольором показана
експериментально отримана залежність перенесеного заряду від кількості
стимулів. Світлим кольором позначена залежність у гіпотетичних умовах, в
яких кінетика ЗПССНМДА залишається постійною, а приріст перенесеного
заряду здійснюється лише за рахунок збільшення амплітуди ЗПСС (описані
умови відповідають тим, у яких відбувається зміна заряду, перенесеного
АМПА компонентой ЗПСС). Таким чином, видно, що завдяки зміні кінетики
ЗПСС від стимулу до стимулу, різниця в постсинаптичному сигналі між
сусідніми стимулами стає набагато значнішою.
Ці спостереження знаходиться в повній відповідності з даними, отриманими
раніше (Arnth-Jensen, 2002). Зміни кінетики ЗПССНМДАПАЧКА оцінювалися за
допомогою нормалізації значення перенесеного заряду до амплітуди
ЗПССНМДАПАЧКА. Більше значення перенесеного заряду відповідає більш
повільній кінетиці спаду і навпаки. Нормалізоване значення перенесеного
заряду ЗПССНМДАПАЧКА було на 240 ± 32 % більше аналогічного параметра
для ЗПССНМДА, викликаного одиночним стимулом (ЗПССНМДАОДИН , p
Oe0”yO
%, 2768 ± 480 нМ. Спорідненість до NR2D-суб’одиниці статистично
відрізнялося від кожного з гетеродимерів (p
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
