ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН
ШКАВОЛЯК АНДРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ
УДК 612.015.31..611.37.0018.1-084
Ідентифікація та біохімічна характеристика Na/Li-протитранспорту в
бета-клітинах підшлункової залози щура
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті
ім. Данила Галицького МОЗ України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,
заслужений діяч науки і техніки України,
академік АН ВШ України.
Гжегоцький Мечислав Романович,
Львівський національний медичний університет ім.Данила Галицького МОЗ
України,
зав. кафедри нормальної фізіології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
СТОЙКА РОСТИСЛАВ СТЕПАНОВИЧ,
Інститут біології клітин НАН України,
завідувач відділу регуляції проліферації клітин
доктор біологічних наук, доцент
КЛІЩ ІВАН МИКОЛАЙОВИЧ,
Тернопільська державна медична академія ім..І.Я.Горбачевського МОЗ
України,
доцент кафедри клінічної фармації
Провідна установа: Львівський національний університет
імені Івана Франка МОН України, кафедра біохімії
Захист відбудеться 7 вересня 2004 р. о 12.00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН
(79034, м.Львів, вул. Стуса, 38).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: 79034, м.Львів, вул. Стуса, 38.
Автореферат розісланий 2 серпня 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
О.І.Віщур
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Важливість підшлункової залози в здійсненні
метаболізму визначається розмаїттям властивостей панкреатичних гормонів,
утворення та вивільнення яких тісно спряжені з трансмембранним
перенесенням моновалентних іонів. Зокрема, в реалізації цих процесів в
острівцях Лангерганса провідна роль належить іонам Na+ та К+ (Anello M.
et al., 1996). Стимуляція бета-клітин нутрієнтами призводить до зниження
значень рН в результаті утворення кислих метаболітів, і цей процес тісно
пов’язаний з транспортом Na+ (Hattory М. et al., 1994; Shepherd R.M.,
Henquin J.C., 1995). Цілком ймовірно, що острівці Лангерганса володіють
декількома іонними транспортерами, які попереджують накопичення
протонів. В еритроцитах найбільш реальними претендентами на цю роль є
механізми Na/Н- та Na/Na-протитранспорту (Орлов С.Н. и соавт., 1994; van
Norren K. et al., 1997). Відомо також, що плазматична мембрана
еритроцитів людини та тварин деяких видів володіє нечутливою до овабаїну
транспортною системою, здатною каталізувати обмін іонів Na+ на Li+,
причому остання розглядається як різновид зазначених вище транслокацій.
Na/Li-протитранспорт може здійснюватись однією з ізоформ транспортера,
за посередництвом якого відбувається Na/H-обмін (Canessa M. et al.,
1992; Zerbini G. et al., 2003), а також бути гомологом
Na/Na-протитранспорту (Escobales N., Figueros J., 1991; Hardman T.C.,
Land A.F., 1996). При певних патологічних станах, зокрема, за розвитку
діабету, властивості механізмів Na/Li-протитранспорту в еритроцитах
істотно відрізняються від таких, характерних для цих клітин у здорової
людини ( Guarena C. et al., 1992), і дана обставина обгрунтовує високу
ймовірність наявності в панкреатичних клітинах транспортерів, за
посередництвом яких може відбуватись незалежний від натрієвої помпи
обмін іонів Na+ та Li+. Однак, незважаючи на важливість виявлення
транспортувальних шляхів, якими здійснюється транслокація моновалентних
іонів у панкреатичних клітинах за фізіологічних та екстремальних умов, з
категорії овабаїн-резистентних систем найбільш повно вивчено властивості
лише Na,K,Cl-котранспорту в ацинарних (Zhao Н., Muallem М., 1995) та в
бета-клітинах (Sandstrom P.I., Sehlin J., 1993) миші, Na/H-обміну – в
ацинарних (Anderie I., Thevenod F., 1996) та в бета-клітинах (Shepherd
R., Henquin J.C., 1995) щура. Na,K,Cl-котранспорту – в бета-клітинах
щура (Бобровник A.Д., 1997). Тому однією із актуальних проблем є
дослідження і інших овабаїн-нечутливих механізмів іонного обміну,
зокрема, Na/Li-протитранспорту, що можуть функціонувати у підшлунковій
залозі.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація
виконана згідно з планами науково-дослідних робіт “Обгрунтування методів
відновлювальної фізичної терапії патологічних процесів, що
супроводжуються явищами іонної мембранопатії”, № держреєстрації
0194U008107 та “Дослідження механізмів розвитку іонних мембранопатій”,
№ держреєстрації 0198U00877.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – з’ясування можливості обміну в
бета-клітинах острівців Лангерганса щура внутрішньоклітинного Na+ на
позаклітинний Li+ і вивчення біохімічних властивостей механізму
Na/Li-протитранспорту.
Для здійснення поставленої мети вирішували наступні основні задачі:
1. Аналіз кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах
при їх інкубації в середовищах зі змінними рН, температурою та
осмоляльністю.
2. Вимірювання інтенсивності Na/Li-протитранспорту в нативних
бета-клітинах та в бета-клітинах зі змінним іонним складом.
3. Порівняння кінетичних параметрів Na/Li-протитранспорту в
бета-клітинах та в еритроцитах щура і в еритроцитах здорової людини.
4. Вивчення взаємоз’язку між концентрацією моновалентних іонів,
швидкістю Na/Li-протитранспорту та інтенсивністю активного транспорту
Na+ в бета-клітинах щурів, опромінених монохроматичним червоним світлом.
Об’єкт дослідження: Іон-транспортувальні системи.
Предмет дослідження: Кінетичні параметри Na/Li-протитранспорту в
бета-клітинах острівців Лангерганса та в еритроцитах щура, в еритроцитах
людини.
Методи дослідження:
– біохімічні – фармакокінетичний аналіз параметрів Na-транспортувальних
процесів;
– фізіологічні – виділення острівців Лангерганса, лазерне опромінення
лабораторних щурів;
– морфологічні – електронна мікроскопія острівців Лангерганса;
– статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Нами вперше отримано свідчення
наявності в бета-клітинах острівців Лангерганса щура
іон-транспортувального механізму, який може здійснювати стимульовану
позаклітинним літієм транслокацію внутрішньоклітинного Na+. У
використаних як експериментальні транспортні моделі бета-клітинах
виявлено та кількісно оцінено основні параметри Na/Li-протитранспорту.
Окреслено механізми регуляції вказаного іонного обміну, що реалізуються
через модуляцію його окремих властивостей за впливу змінних фізичних
(температура, осмоляльність) та хімічних (наявність транспортних
інгібіторів, іонний склад внутрішньо- та позаклітинного середовищ, рН)
факторів. Вперше проведено порівняння кінетичних параметрів
Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах та в еритроцитах щура і в
еритроцитах людини. Розширено теоретичні уявлення про механізми
функціонування Na/Li-протитранспорту в нееритроїдних клітинах.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати вказують,
що експериментальною моделлю для вивчення властивостей
Na/Li-протитранспорту можуть служити бета-клітини острівців Лангерганса
щура, позаяк останні достатньою мірою проявляють фармакологічні
(чутливість до транспортних інгібіторів) та функціональні (чутливість до
рН, осмоляльності, температури, іонного складу внутрішньо- та
позаклітинного середовищ) характеристики.
Проведено оптимізацію умов дослідження Na/Li-протитранспорту, що
дозволяє здійснювати порівняльну оцінку окремих показників цієї іонної
транслокації в клітинах, що перебувають в стані, наближеному до
природнього, за створення екстремальних умов та за впливу випромінювання
гелій-неонового лазера. Матеріали дисертаційної праці впроваджені в
навчальний процес у ЛНМУ ім. Данила Галицького в лекційні курси кафедр
нормальної фізіології, патологічної фізіології, біохімії.
Особистий внесок здобувача. Збір літератури, лазерне опромінення
лабораторних тварин, статистичне обчислення отриманих даних, їх опис
виконано особисто дисертантом. Разом з науковим керівником сплановано
комплекс біохімічних та фізіологічних методів і серії експериментальних
досліджень, обговорено та узагальнено одержані результати. Виділення
острівців Лангерганса та вимірювання параметрів Na-транспортувальних
систем проведено спільно зі співробітниками ЦНДЛ ЛНМУ, які є
співавторами публікацій. Електронно-мікроскопічне дослідження здійснено
старшим науковим співробітником цієї ж лабораторії Ковалишиним В.І.
Апробація результатів дисертації. Основні результати та положення роботи
були оприлюднені та винесені на обговорення на XV з’їзді фізіологів
України (Львів, 1998), науково-практичній конференції “Актуальні
проблеми лазерної медицини, ендоскопічної хірургії та гінекології”
(Одеса, 1999), симпозіумі “Водно-сольовий обмін та його роль в
гомеостатичних реакціях організму” (Львів, 1999), Міжнародній науковій
конференції “С.З.Гжицький і сучасна аграрна наука” (Львів, 2000), IV та
V Міжнародних медичних Конгресах студентів і молодих вчених (Тернопіль,
2000 та 2001, відповідно), Міжнародній конференції студентів і молодих
вчених (Дніпропетровськ, 2001), ІІІ з’їзді Українського біофізичного
товариства (Львів, 2002), VІІ з’їзді Українського лікарського товариства
(Тернопіль, 2003).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 18
публікаціях, з яких 7 опубліковано у наукових фахових виданнях, 4 – у
збірниках та вісниках наукових праць, 7 – у матеріалах та тезах
конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках
машинописного тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури,
матеріалів і методів досліджень, опису отриманих результатів та їх
обговорення, узагальнення, висновків, списку використаних джерел із 200
найменувань та 3 додатків (актів впровадження). Робота ілюстрована 5
таблицями, 23 рисунками та 4 світлинами, які займають 15 сторінок
тексту.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень
Робота виконана на 230 лабораторних щурах-самцях. Дослідження проводили
на виділених методом Lacy P.E., Kostianowsky M. (1967) бета-клітинах
острівців Лангерганса, інтактність яких оцінювали за посередництвом
трипанового синього (Senglen P., 1976) та електронною мікроскопією, а
також на еритроцитах цих тварин і 30 здорових осіб.
На стаціонарний стан бета-клітин острівців Лангерганса впливали
декількома способами: модифікацією іонного складу розчинів, які
використовували для інкубації, змінами рН, осмоляльності та температури
позаклітинного середовища. У вільному від Na+ або Li+ середовищі ці іони
заміняли на холінхлорид. Значення осмоляльності інкубаційного середовища
контролювали осмометром типу ОМКА Ц-01. Про об’єм клітин судили за
вмістом внутрішньоклітинної води (Sayeed M.M., 1984).
Параметри Na/Li-протитранспорту встановлювали в нативних клітинах та в
клітинах зі змінним іонним складом, що досягалось впливом
пара-хлормеркурібензенсульфонату (Garrahan P., Rega A.F., 1967) або
інкубацією клітин при 0,5(С. Вимірювання концентрацій Na+ та К+ у
клітинах здійснювали методом полум’яної фотометрії на фотометрі моделі
Plapho 4, Carl Zeiss, Jena.
Про інтенсивність овабаїн-чутливого транспорту Na+ судили за збільшенням
концентрацій Na+ в клітинах після їх інкубації в середовищах, що містили
овабаїн (в ммоль/л): 5,0 – для бета-клітин; 1,0 – для еритроцитів щура;
0,1 – для еритроцитів людини (Cumberbatch M., Morgan B., 1978; de
Mendonca M. et al., 1983). Активність Na,K-АТФази клітин обчислювали як
різницю між активностями сумарної АТФази та Mg-АТФази, що їх визначали
за приростом концентрацій неорганічного фосфату. Na/Li-протитранспорт
був досліджений як стимульований позаклітинним літієм вихід Na+.
Стандартну активність Vstd та максимальну реакційну швидкість Vmax
Na/Li-протитранспорту встановлювали за різницею концентрацій Na+,
виміряних в в клітинах в нульовий та завершальний час інкубації при
поєднаному додаванні в середовища потоку, що містили NaCl в концентрації
140 ммоль/л або 150 ммоль/л, відповідно, двох транспортних інгібіторів –
овабаїну та фуросеміду – за наявності та відсутності LiCl. Константа
спорідненості Міхаеліса (Кm) до позаклітинного Na+ була визначена
графічним методом.
При опроміненні піддослідних тварин розфокусований потік
монохроматичного червоного світла (МЧС), генерований гелій-неоновим
лазером типу ЛГ-75, скеровували на депільовану епігастральну область.
Густина потужності випромінювання становила 0,5 мВт ( см-2. Дозування
проведено шляхом змін кількості сеансів та їх тривалості.
Статистичний аналіз одержаних результатів здійснювали на
персональному комп’ютері Celeron-400 з використанням програми Excel
пакету Microsoft Office. Для оцінки рівня вірогідності використовували
критерій Стьюдента. Зміни показників вважали вірогідними при р 0,05) відносно значень,
зареєстрованих при застосуванні ізоосмоляльного середовища. При внесенні
в гіперосмоляльне середовище овабаїну (5,0 ммоль/л) об’єм бета-клітин
залишався незмінним, а при їх інкубації в ізоосмоляльному середовищі за
наявності овабаїну кількість внутрішньоклітинної води була на 19,6% (р
z?X
c
¤
¦
?
??ec
¤
?
?
?
P///ooaeUUaeaeaeaeaeaeaeaeaeaeaeaeaeaeaeUU
”“–“-” ”,–v™??® YQEEEEE
kd*
!
?O
!
!
!
”
!
1-протитранспорту проведено за відсутності в середовищах потоку
пара-хлормеркурібензенсульфонату, за умови 5-кратного промивання
бета-клітин MgCl2-сахарозним розчином.
Після застосування методичних прийомів, що сприяли Na-навантаженню
клітин, збільшення внутрішньоклітинних концентрацій цього іону, при яких
значення стандартної активності Na/Li-протитранспорту були
максимальними, становило в середньому 150 відсотків (табл.3).
Таблиця 3
Концентрація Na+ та К+ (ммоль ( 1 кг клітин-1) та
кінетичні параметри (ммоль Na+ · 1 кг клітин-1 · 1 год-1)
Na/Li-протитранспорту в бета-клітинах острівців Лангерганса щура
Промиті клітини Навантажені натрієм клітини
Натрій 17,00 ( 1,84 41,65 ( 2,75*
Калій 88,65 ( 9,87 63,21 ( 1,67
Стандартна активність Vstd 0,53 ( 0,05 0,70 ( 0,07*
Максимальна швидкість Vmax 0,69 ( 0,07 0,94 ( 0,09*
Примітка. * - вірогідність р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
