НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут біохімії ім. о.в. Палладіна
Краснобрижа Євгенія Миколаївна
УДК 577.112.2:612.128
Вплив стрептокінази на активаційну ланку системи фібринолізу
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Київському національному університеті ім. Тараса
Шевченка
та Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор
Волков Георгій Леонідович,
завідувач відділу структури і функції білка
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник
Козлов Едуард Андрійович,
старший науковий співробітник лабораторії біосинтезу білка Інституту
молекулярної біології і генетики НАН України;
кандидат біологічних наук
Петрова Юлія Іванівна,
науковий співробітник відділу молекулярної імунології
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.
Провідна установа – Національний медичний університет ім. О.О.
Богомольця, кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії.
Захист відбудеться „27” грудня 2004 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім.
О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат розісланий „26” листопада 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.
Загальна характеристика роботи
Актуальність проблеми. Вивчення механізмів регуляції активності та
взаємодії компонентів системи гемостазу є необхідною передумовою для
кращого розуміння перебігу фізіологічних процесів, розробки підходів і
методів корекції численних патологій, які пов’язані з дисбалансом
фібринолітичної системи та системи зсідання крові. Одним із основних
методів корекції та лікування тромботичних ускладнень, широко
розповсюджених на сьогоднішній день, є застосування тромболітичних
препаратів, серед яких особливу увагу привертає до себе стрептокіназа.
Цей інтерес зумовлений тим, що останнім часом значної актуальності
набуває питання стосовно розробки на основі стрептокінази нових
тромболітичних препаратів, що в свою чергу потребує кращого розуміння
механізма її дії. Стрептокіназа – білок бактеріального походження, що
продукується різними видами ?-гемолітичних стрептококів. На відміну від
фізіологічних активаторів плазміногена стрептокіназа не є ферментом.
Молекулярний механізм активації плазміногена стрептокіназою відкритий у
1971 році МкКлінтоком і Беллом. Було запропоновано схему, яка полягає в
непрямій активації головного проферменту системи фібринолізу –
плазміногена, шляхом формування комплексу в якому плазміногеновий
компонент набуває активаторної здатності та активує іншу молекулу
плазміногена до плазміну. Плазмін, у свою чергу, розщеплює фібрин у
складі тромбу, що призводить до руйнування та елімінації тромбів із
русла крові.
Раніше було з’ясовано, що вплив стрептокінази на систему гемостазу
полягає в утворенні плазміну, який є посередником її дії на компоненти
системи гемостазу. Виникає питання, чи існують альтернативні шляхи
впливу стрептокінази на білки системи фібринолізу та на систему
гемостазу в цілому. Не з’ясованими залишаються питання стосовно впливу
стрептокінази на систему фібринолізу, зокрема на її активаційну ланку,
яка включає в себе активатори плазміногена та їх інгібітори.
На сьогоднішній день значної актуальності набуває проблема виникнення
ускладнень в разі тромболітичної терапії стрептокіназою (ретромбози,
коагулопатії різної етіології, порушення мозкового кровообігу, імунна
відповідь) або стрептококових інфекцій, що можна пояснити
неконтрольованим впливом стрептокінази на систему гемостазу. Тому
запобігання виникненню можливих порушень системи гемостазу та покращення
ефективності лікування тромботичних ускладнень є питанням, яке потребує
розробки відповідних теоретичних та методологічних підходів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тему
дисертаційної роботи було затверджено на засіданні вченої ради
Київського національного університету імені Тараса Шевченка (протокол
№3/537 від 29 жовтня 2001 р. ) та уточнено (протокол № 11 від 1 червня
2004 р.).
Дисертаційна робота виконана у рамках теми “Вивчення молекулярних
механізмів регуляції проферментів систем зсідання крові та фібринолізу в
нормі та при патології” (2001-2003 рр.) (№ державної реєстрації
0101U000103) відділу структури і функцій білка Інституту біохімії ім.
О.В. Палладіна НАН України.
Мета та задачі дослідження. Метою даної роботи було дослідження впливу
стрептокінази на механізми регуляції активності та взаємодії компонентів
системи фібринолізу.
Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:
Вивчити вплив різних чинників на процес активації плазміногена в
модельних системах in vitro: визначити активність
плазміноген-стрептокіназного комплексу за різних умов інкубації; вивчити
коректність визначення активності тканинного активатора плазміногена за
введення стрептокінази та її комплексів в плазмі крові;
Дослідити активацію ключових проферментів системи гемостазу
стрептокіназою у плазмі крові ссавців (in vitro);
Проаналізувати зміну параметрів системи гемостазу у хворих на гострий
інфаркт міокарда, яким проводилась тромболітична терапія стрептокіназою;
Дослідити вплив стрептокінази на компоненти системи гемостазу,
використовуючи модельні системи in vivo.
Об’єкт дослідження. Об’єктом дослідження є білки системи фібринолізу.
Предмет дослідження. Вплив стрептокінази на компоненти активаційної
ланки системи фібринолізу.
Методи дослідження. В роботі застосовано методи виділення високоочищених
білкових препаратів з плазми та сироватки крові ссавців: плазміногена,
плазміну, фібриногену та поліклональних антитіл. Визначення активності
плазміну, тромбіну, тканинного активатора плазміногена проводили
спектрофотометрично у мікропланшетах. Для проведення кількісного аналізу
компонентів фібринолітичної системи у плазмі крові було застосовано
метод імуноферментного аналізу (ELISA). Якісний склад компонентів
системи гемостазу вивчали методами диск-електрофорезу,
ензим-електрофорезу та вестерн-блотингу. Дослідження проводились на
модельних системах in vitro та in vivo. Для обчислення отриманих
результатів застосовували методи статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. З’ясовано, що стрептокіназа
впливає на механізми регуляції активності та взаємодії компонентів
системи гемостазу. Виявлено вплив стрептокінази на динаміку
білок-білкових взаємодій між компонентами фібринолітичної системи:
тканинним активатором плазміногена та інгібітором активаторів
плазміногена І типу.
Вперше показано, що стрептокіназа викликає значне вивільнення
ендотеліальними клітинами у русло крові одного з головних ферментів
системи фібринолізу – тканинного активатора плазміногена. Вперше
виявлено, що стрептокіназа здатна викликати значне підвищення секреції з
?-гранул тромбоцитів інгібітора активаторів плазміногена І типу на фоні
зниження його активності. В дослідах з використанням модельних систем in
vitro виявлено, що протромбін різних видів ссавців активується
стрептокіназою, внаслідок чого утворюється тромбін – ключовий фермент
системи зсідання крові, який навіть в надзвичайно низьких концентраціях,
здатен впливати на цілий ряд процесів в організмі, взаємодіяти з
ендотеліальними клітинами і таким чином стимулювати синтез тканинного
активатора плазміногена, що можна розглядати як опосередкований механізм
дії стрептокінази на білки системи фібринолізу. Розроблено модельні
системи in vivo з метою дослідження можливих шляхів дії стрептокінази.
На модельній системі, в якій плазміноген активується стрептокіназою,
показано, що вплив стрептокінази може відбуватись опосередковано,
внаслідок дії плазміну, продуктів деградації фібрину/фібриногену та
тромбіну на ендотеліальні клітини. На модельній системі in vivo, в якій
плазміноген не активується стрептокіназою, вперше показано, що
стрептокіназа здатна впливати на судинно-тромбоцитарну ланку системи
гемостазу, не використовуючи протеїнолітичну властивість плазміну.
Виявлено, що стрептокіназа викликає зниження рівню протромбіну, проте
активації системи зсідання крові не спостерігається.
Показано, що у пацієнтів з гострим інфарктом міокарда одною з причин
тромботичних ускладнень є дисбаланс у функціонуванні фібринолітичної
системи, який пов(язаний зі зниженням активності тканинного активатора
плазміногена на фоні підвищення активності його інгібітора. Введення
препарату гепарину призводить до поступового та значного підвищення
активності тканинного активатора плазміногена, на відміну від препаратів
гірудину та низькомолекулярного гепарину (фраксипарину). Це дозволяє
зробити припущення про індукцію гепарином синтезу та/або фізіологічне
вивільнення тканинного активатора плазміногена з ендотеліальних клітин.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати дозволяють
глибше зрозуміти складні механізми багаторівневої регуляції активності
та взаємодії компонентів системи гемостазу у нормі та при тромботичних
ускладненнях.
Отримані результати дають змогу спрогнозувати можливі ускладнення в разі
тромболітичної терапії стрептокіназою або при появі стрептококових
інфекцій в організмі та розробити методи їм запобігання. Важливим
значенням роботи є те, що використовуючи отримані дані, можна створити
основу для розробки нових підходів для проведення та контролю
антитромботичної терапії, що надасть змогу поліпшити якість лікування.
На основі даних, представлених в роботі, можливо розробити діагностичні
тест-системи для покращення діагностики і в подальшому ефективності
лікування захворювань, в основі яких лежать тромботичні ускладнення.
Особистий внесок здобувача. Представлена дисертаційна робота – завершене
дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних
досліджень, спланованих, проведених та узагальнених протягом 2001 –2004
років. Експериментальну частину роботи виконано дисертантом особисто.
Аналіз отриманих результатів, обговорення та інтерпретацію проведено
спільно з науковим керівником д.б.н., професором Г.Л. Волковим та к.б.н.
О.М Савчуком. Друковані праці підготовані за безпосередньої участі
автора.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи було
продемонстровано на VIIІ Українському біохімічному з’їзді (м. Чернівці,
2002 р.); на 7-мій Пущинській школі-конфереції молодих науковців (м.
Пущино 14-18 квітня 2003 р.), міжнародних конференціях –XІХ
International Symposium Thrombosis and Haemostasis (Бірмінгем, Англія,
2003 р.), школі-конференції молодих науковців за темою “Homeostasis”
FEBS (Спетсес, Греція, 2003 р.), 18th International Congress on
Thrombosis (Ljubljana, Slovenia, 2004 р.).
Матеріали роботи було представлено у 2002 році на конкурсі молодих
вчених Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України на здобуття
стипендії імені видатних вчених-біохіміків, де робота здобула премію ім.
Д.В. Фердмана, робота доповідалась на засіданнях відділу структури та
функції білка та на наукових семінарах Інституту біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи, опубліковано 4 статті в
періодичних наукових спеціальних виданнях України включених до переліку,
затвердженому ВАК України, 6 тез доповідей у збірках наукових
конференцій та отримано 2 патенти.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу,
огляду літератури (1 розділ, 5 підрозділів), експериментальної частини
(3 розділи, 5 підрозділів), висновків та списку літературних джерел (161
найменування). Роботу викладено на 118 сторінці, проілюстровано 24
рисунками та 2 таблицями.
Основний зміст роботи
огляд літератури
В огляді літератури детально висвітлено сучасні дані про структуру та
функції компонентів активаційної ланки системи фібринолізу. Представлено
дані про екзогенний активатор плазміногена – стрептокіназу та її
взаємодію із компонентами системи гемостазу.
матеріали та методи досліджень
Плазмін одержували з Глу-плазміногена (Пг), виділеного методом афінної
хроматографії на лізин-сефарозі (Deutch, Mertz, 1970), з наступною
активацією урокіназою (Ук) у співвідношенні Пг:Ук = 1:1250 у 0,05 М
трис-НСl буфері, рН 7.4, що містить 25% гліцерину (за об’ємом). В таких
умовах 95% плазміногена активується в плазмін, активність якого складала
22 к.о./мг. Фермент зберігали в 0,05 М трис-НСl буфері, рН 7.4, що
містить 50% гліцерину (за об’ємом) при 4оС.
Протеолітичну активність плазміну визначали за здатністю гідролізувати
казеїн за Гамерстеном (Robbins, Summaria, 1979).
Фібриноген людини одержували з плазми крові шляхом висолювання 16%
розчином сульфату натрію з наступним відділенням кріофібриногена за
методом Т.В.Варецької (1960).
Поліклональні антитіла одержували з сироватки крові імунізованих тварин
з використанням протеїн А сефарози за стандартною методикою ( Ey at
all., 1978 ).
Імуноферментний аналіз (ELISA) проводили у мікропланшетах із сорбційною
здатністю за стандартною методикою для розчинних білків (Wisdom, 1976).
Визначення активності тканинного активатора плазміногена (ТАП) проводили
за модифікованим методом Chmielewska J., Ranby M. and Wiman B (1983).
Реакційну суміш, що містила Глу-Пг – 1,2 к.о./мл, еуглобулінову фракцію
100мк/мл, 0,3 мМ субстрат S2251, 0,05 М фосфатний буфер рН 7,4
інкубували при 370С протягом 90 хвилин. Появу п-нітроаніліну, який
звільняється з хромогенного субстрату під дією плазміну, що утворився,
реєстрували за довжини хвилі 405 нм на фотометрі Multiskan MC протягом
усього терміну інкубації.
Визначення активності інгібітора тканинного активатора плазміногена
(ПАІ-1) проводили за модифікованим методом Eriksson E., Ranby M., та
співавторів (1988), з використанням хромогенного субстрату S2251.
Амідолітичну активність плазміну вимірювали за допомогою хромогенного
субстрату S2251, відповідно до стандартної методики Castellino
F.J.(1976).
Активність ?2-антиплазміну вимірювали з використанням хромогенного
субстрату S2251 за методом Teger-Nilsson A.C., Friberger P., Gyzander E.
(1977).
Вміст фібриногену визначали з використанням Анцистрону-Н, що дозволяє
визначити концентрацію фібриногену у присутності інгібіторів зсідання
крові за методом Т.М. Платонової (1993).
Вміст розчинного фібрину у плазмі визначали з використанням фосфатного
методу за методом Т.В. Варецької (1992).
Електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецил сульфату
натрію (ДС-Na) проводили за методом Леммлі (1970) на приладі для
вертикального гель-електрофорезу (Bio-Rad, США) у пластинах товщиною
0,75 або 1 мм. В якості маркерів використовували суміш білків фірми
“Pharmacia” (Швеція) з відомою молекулярною масою, кДа: фосфорилаза Б –
94; альбумін – 67; овальбумін – 43; карбоангідраза – 30; соєвий
інгібітор трипсину – 20,1; лактальбумін – 14,4.
Метод вестерн-блотингу проводили відповідно до стандартного методу
“Western blotting” W.N. Burnette (1981), використовували поліклональні
антитіла до фібриногену та до фрагменту Е для імунохімічного фарбування.
Математичну обробку даних експериментів проводили використовуючи
комп’ютерні програми Origin 6.1. До роботи включено лише результати
експериментів, що є статистично достовірними за t- критерієм стьюдента
(р>&
(
A
I
? ? ? ? ¶ ? ? 1/4 ooc**ccooIIAAAocccoooo
P
1/4
3/4
A
„O
]„yy^„O
„O
^„O
dh^„i `„7
dh`„7a$ 3/4$
&
(
¦
A
o
„J
„io^„J
„
„7^„
„O
^„O
„
„7^„
„O
^„O
&
)му 0,87±0,09 МО/мл порівняно з нормою 2,05±0,5 МО/мл, проте
спостерігались відхилення показника активності тканинного активатора
плазміногена від вищенаведеного: при надходженні у деяких пацієнтів
активність тканинного активатора плазміногена наближалась до норми (у
15% обстежених пацієнтів виявлено підвищений рівень активності ТАП
близько 3,5±0,5МО/мл, який майже не змінювався протягом усього періоду
лікування). Активність інгібітора активаторів плазміногена І типу при
надходженні пацієнтів була значно підвищена 63±4,4 МО/мл порівняно із
нормою (в середньому 15±7,5 МО/мл).
У деяких пацієнтів відмічалась надзвичайно висока активність ПАІ-1, яка
досягала в деяких випадках 78 МО/мл на фоні значно зниженої активності
тканинного активатора плазміногена до 0,29 МО/мл, що безперечно свідчить
про майже повне пригнічення потенціалу системи фібринолізу. Варіювання
показників активності ТАП і його інгібітора ПАІ-1 та загальної
фібринолітичної активності при надходженні пацієнтів наведено на рис.3.
Проведення тромболітичної терапії стрептокіназою призводило до значного
підвищення активності тканинного активатора плазміногена 7,88±3,47 МО/мл
через 2 години після введення стрептокінази на фоні зниження активності
його інгібітора І типу до 38,9±6,5 МО/мл (рис. 3.В.).
На наступних етапах лікування активність тканинного активатора
плазміногена підвищувалась, порівняно з даними при надходженні пацієнта,
та наближається до норми, хоча у деяких пацієнтів відмічалась низька
активність тканинного активатора протягом усього лікування. На 30 добу
його активність досягала 2,21±0,38 МО/мл. Було проведено порівняльний
аналіз даних 1 підгрупи пацієнтів, яких лікували препаратом гепарину,
2ої підгрупи пацієнтів, лікування яких проводили аналогом гепарину –
фраксипарином та 3ої підгрупи, що лікували препаратом гірудину. Аналіз
даних показав, що активність тканинного активатора плазміногена у групі,
в якій проводили гепаринотерапію на 3 добу лікування підвищувалась на
24%, відносно показника активності при надходженні. На 7 добу лікування
спостерігалось значне підвищення активності тканинного активатора
плазміногена– на 184%. В той час як у другій підгрупі пацієнтів, яким
вводили фраксипарин, спостерігалось незначне підвищення активності
тканинного активатора плазміногена: на 3 добу цей показник підвищувався
на 38%, а на 7 добу лікування на 53% відносно активності ТАП при
надходженні. У третій підгрупі пацієнтів, яких лікували препаратами
гірудину, взагалі не відмічається значного підвищення активності
тканинного активатора плазміногена. На третю добу активність тканинного
активатора плазміногена підвищувалась на 9 % відносно цього показника
при надходженні пацієнтів. На 7 добу майже ніяких змін не
спостерігалось. Отже, при введенні препарату гірудину не спостерігалось
підвищення активності тканинного активатора плазміногена протягом
лікування, на відміну від дії препаратів фраксипарину та гепарину. Проте
при введенні препарату гепарину цей ефект був найбільш потужно
виражений, порівняно із дією фраксипарину.
Відомо, що гепарин зв’язується і поглинається ендотеліальними клітинами,
які в свою чергу, забезпечують синтез тканинного активатора плазміногена
та його накопичення. Можна зробити припущення, що гепарин індукує певні
синтетичні механізми у ендотеліальних клітинах або підсилює секрецію
тканинного активатора плазміногена ендотеліальними клітинами. Отже,
можливо, механізм дії гепарину на фібринолітичну систему може полягати в
індукції синтезу тканинного активатора плазміногена та/або у його
фізіологічному вивільнені з ендотеліальних клітин.
Отже, у пацієнтів з гострим інфарктом міокарда одною з можливих причин
тромботичних ускладнень є дисбаланс у функціонуванні фібринолітичної
системи, який пов(язаний зі зниженням активності тканинного активатора
плазміногена на фоні підвищення активності його інгібітора. Введення
стрептокінази спричиняє різке підвищення активності тканинного
активатора плазміногена у декілька разів, що може свідчити про прямий
або опосередкований вплив стрептокінази на ендотеліальні клітини.
Вплив стрептокінази на параметри системи гемостазу в модельних системах
in vivo
Отримавши вищенаведені результати, на наступному етапі дослідження
постала задача дослідити шляхи дії стрептокінази на компоненти системи
гемостазу. Тому особливий інтерес представляло вивчення механізмів дії
стрептокінази на систему гемостазу з використанням модельних систем in
vivo. Було зроблено припущення, що можливі шляхи впливу стрептокінази
полягають не тільки в дії Пм, але існують і шляхи, опосередковані дією
продуктів деградації фібрину/фібриногену (які утворилися внаслідок дії
Пм), тромбіну або безпосередньо дією стрептокінази. Особлива увага
приділялась вивченню динаміки тканинного активатора плазміногена та його
інгібітора ПАІ-1 у руслі крові. Для проведення експерименту у якості
модельної системи in vivo було використано систему гемостазу кролів та
свиней. Система гемостазу кролів була обрана з наступних міркувань: це
зручна і доступна модель, плазміноген якої, активується стрептокіназою,
отже можливо змоделювати процеси що відбуваються в організмі людини
після введення препаратів стрептокінази. Проте, як свідчать дані,
плазміноген людини активується стрептокіназою на порядок краще ніж
плазміноген кроля. Тому досліджувані механізми дії стрептокінази,
опосередковані дією плазміну, в організмі кроля можуть бути дещо слабше
виражені.
У якості модельної системи також було обрано систему гемостазу свиней, в
якій плазміноген не активується стрептокіназою і, таким чином, може бути
виключений можливий вплив плазміну та продуктів деградації
фібрину/фібриногену на ендотеліальні клітини судин. На модельних
системах in vivo (кролі (n=7), свині (n=5)) досліджувався вплив
стрептокінази на основні параметри системи гемостазу. В системі
фібринолізу вивчали наступні параметри: активність плазміногена,
?2-антиплазміну, активність та концентрацію ТАП та ПАІ-1, склад
еуглобулінової фракції аналізували методом ензим-електрофорезу. Стан
системи зсідання крові оцінювали за наступними параметрами: концентрація
фібриногену, розчинного фібрину, склад фракції продуктів деградації
фібриногену/фібрину, що був охарактеризований методами
диск-електрофорезу та вестерн-блотингу.
Препарат стрептокінази вводили у дозі відповідно до схеми лікування
людей при захворюванні на гострий інфаркт міокарда у перерахунку на вагу
тварин.
На першому етапі досліджень з використанням модельних систем in vivo
вивчали вплив стрептокінази на систему гемостазу кролів. Результати
досліджень показали, що через 1 годину після введення стрептокінази
спостерігалося зниження вмісту нативного плазміногена на 30 % порівняно
із нормою, що свідчить про його активне перетворення на плазмін. Цей
факт корелює з літературними даними і свідчить про активацію
плазміногена стрептокіназою та перетворення плазміногена на плазмін. На
1 та 3 добу відмічалося поступове підвищення концентрації плазміногена і
нормалізація на 7 добу. При цьому необхідно відмітити, що активність
головного інгібітора плазміногена – ?2-антиплазміну незначно знижувалась
через 1 годину після введення Ск і коливалась в межах норми на наступних
етапах лікування. Активність та концентрація тканинного активатора
плазміногена значно підвищувалась через 1 годину після введення
стрептокінази і досягала 2,54±0,3 МО/мл і 12±1,5 нг/мл, в той час як в
контрольній групі цей параметр становив 0,7±0,1 МО/мл і 5±1,3 нг/мл
(рис.4.). Підвищення активності тканинного активатора плазміногена майже
в 3,5 рази пов’язано з підвищенням його концентрації, що можна пояснити
секрецією його ендотеліальними клітинами, в яких він накопичується.
Через 4 години цей показник складала 1,05±0,2 МО/мл та відповідно
концентрація 8±1,3 нг/мл, а на наступних етапах наближається до норми.
Після введення стрептокінази активність інгібітора активаторів
плазміногена – ПАІ-1 – знижувався до 6,5±2,7 МО/мл, тоді як в
контрольній групі цей показник становить 12±5,3 МО/мл (рис.5.). Проте
концентрація ПАІ-1 у вільній та у комплексній формі з тканинним
активатором плазміногена або вітронектином після введення стрептокінази
зростала і досягала 16,5±1,3 нг/мл тоді як до введення стрептокінази
становить 8,4±2,3 нг/мл. Отримані дані можуть свідчити про активацію
системи фібринолізу, пов’язану із зростанням концентрації тканинного
активатора плазміногена у руслі крові, і, відповідно, посиленням
інгібування фібринолітичної активності. Оскільки вміст функціонально
активних молекул ПАІ-1 знижується на фоні зростання вмісту його
комплексів, то можна зробити припущення, що відбувається активний процес
інгібування підвищення вмісту активаторів плазміногена. Беручи до уваги
те, що 90% ПАІ-1 накопичується в ? гранулах тромбоцитів, то можна
зробити припущення, що стрептокіназа, активуючи тромбоцити (згідно даним
літератури), призводить до секреції ПАІ-1. Надалі активність інгібітора
активаторів плазміногена І типу підвищувалась протягом дослідження та на
7 добу досягала 19,6±3,5 МО/мл, що пояснюється зниженням вмісту та
активності тканинного активатора плазміногена.
Аналіз даних ензим-електрофореграм еуглобулінової фракції плазми крові
кролів (рис.6.) показав наявність білкових компонентів, які мають
фібринолітичну активність і відповідають зонам з молекулярною масою 92,
70 і 54 кДа. Наведені зони за молекулярною вагою та рухомістю у даних
умовах відповідають плазміну, тканинному активатора плазміногена та
двохланцюговій урокіназі відповідно. На електрофореграмі через 1 годину
після введення СК помітно підвищення активності плазміну, тканинного
активатора плазміногена та двохланцюгової урокінази відносно контрольної
групи, а на наступних етапах активність цих білків знижується і
наближається до норми.
Дослідження параметрів системи зсідання крові дозволило виявити
дисбаланс в системі гемостазу, про що свідчить поява розчинного фібрину
після введення стрептокінази, тоді як в нормі він відсутній. Розчинний
фібрин це комплекси мономерного фібрину з фібриногеном або продуктами
деградації фібрину/фібриногену. Накопичення розчинного фібрину свідчить
не тільки про активацію системи зсідання крові, але й про порушення
динамічної рівноваги між функціонуванням систем зсідання крові та
фібринолізу. Концентрація розчинного фібрину досягала максимальних
значень через 4 години після введення стрептокінази та складала
0,05±0,01 мг/мл, і поступово знижувалась на наступних етапах, що
свідчить про відновлення нормального функціонування системи зсідання
крові. Концентрація фібриногену зменшувалась через 1 годину після
введення стрептокінази до 1,8±0,8 г/л порівняно із нормою 2,8±0,1 г/л,
що є показником патологічної активації системи фібринолізу, яка
розщеплює нативний фібриноген. Вміст фібриногену в плазмі крові – один з
важливих показників, що характеризує стан системи гемостазу. Необхідно
зауважити, що спостерігається зниження вмісту протромбіну на 30 % через
1 годину після введення стрептокінази на фоні активації системи зсідання
крові, що є свідченням активації протромбіну. Для аналізу фракції
розчинних фібрин-мономерних комплексів було розроблено метод одержання
даної фракції з плазми крові ссавців. Електрофоретичний аналіз фракцій
розчинних фібрин-мономерних комплексів плазми крові кролів показав
наявність в їх складі білкових зон з молекулярною масою 200-300, 85-110
і 50-70 кДа. Аналіз цих фракцій (рис. 7.), проведений методом
вестерн-блотингу з використанням антитіл до фібриногену та до фрагменту
Е показав накопичення фібрину/фібриногену, фрагментів Х, Y, Д та Е
різного ступеня розщеплення. Наведені дані свідчать про активацію
системи фібринолізу після введення стрептокінази, внаслідок чого
відмічається накопичення продуктів деградації фібрину/фібриногену.
Спостерігається тенденція до підвищення вмісту фрагментів Е та Д на 7
добу після введення стрептокінази.
Отримані результати свідчать, що стрептокіназа безпосередньо або
опосередковано впливає на ендотеліальні клітини та тромбоцити, внаслідок
чого відбувається вивільнення ТАП та ПАІ-1. Опосередкований вплив
стрептокінази може відбуватись через дію плазміну, продуктів деградації
фібрину/фібриногену та тромбіну.
На наступному етапі нашого дослідження на модельних системах in vivo ми
вивчали вплив Ск на систему гемостазу свиней.
Результати експериментів показали, що через 1 годину після введення
стрептокінази, активації плазміногена не реєструвалось. Проте необхідно
відзначити, що через 4 години спостерігалась тенденція до споживання
плазміногена, що може свідчити про появу у кровотоці підвищеного вмісту
активатора плазміногена. Активність ?2-антиплазміну незначно
коливається. Активність та концентрація тканинного активатора
плазміногена значно підвищувалась через 1 годину після введення
стрептокінази і досягала 3,6±0,5 МО/мл, що майже в 4 рази більше норми
(0,75±0,1 МО/мл). Концентрація ТАП досягала 16±1,5 нг/мл, тоді як цей
показник в контрольній групі складав 6±0,9 нг/мл (рис. 8.).
Дослідження динаміки активності ПАІ-1 виявило, що через 1 та 4 години
після введення стрептокінази цей показник значно знижував до 17±5,3
МО/мл та до 13,57±1,5 МО/мл відповідно, при нормі 41±7,5 МО/мл, а на
наступних етапах нормалізується, що, можливо, пов’язано з
функціонуванням механізмів взаєморегуляції компонентів системи
фібринолізу. Спостерігалось значне підвищення вмісту ПАІ-1 у вільній та
у комплексній формі з тканинним активатором плазміногена або
вітронектином після введення стрептокінази і досягало 46,5±5,3 нг/мл,
тоді як до введення стрептокінази вміст ПАІ-1 становив 28,7±2,3 нг/мл
(рис.9.). Після введення стрептокінази відмічалося підвищення
концентрації інгібітора активаторів плазміногена майже в 2 рази, що може
бути компенсаторною відповіддю системи фібринолізу на підвищення
активності та вмісту тканинного активатора плазміногена в руслі крові.
Як уже згадувалось, що 90% ПАІ-1 накопичується у тромбоцитах, тому
значне підвищення концентрації інгібітора активаторів плазміногена
пов’язано з активацією тромбоцитів стрептокіназою, внаслідок чого
спостерігається секреція ПАІ-1 з ? гранул тромбоцитів. На фоні
підвищення вмісту інгібітора активаторів плазміногена спостерігається
зниження його активності, що свідчить про те, що ПАІ-1 знаходиться у
неактивній комплексній формі з тканинним активатором плазміногена або
вивільняється з тромбоцитів вже у неактивній формі, внаслідок їх
нефізіологічної активації стрептокіназою.
Аналіз даних ензим-електрофорезу еуглобулінової фракції плазми крові
свиней (рис.10.) показав наявність зон з молекулярними масами 92 і 70
кДа, які виявляють фібринолітичну активність. Активні зони відповідають
плазміну та тканинному активатора плазміногена відповідно. На
ензим-електрофореграмі через 1 годину після введення Ск зафіксовано
підвищення активності тканинного активатора плазміногена відносно норми
та зниження його активності на наступних етапах.
Аналіз параметрів системи зсідання крові свині показав, що після
введення стрептокінази розчинний фібрин був відсутній у руслі крові, а
концентрації фібриногену змінювалась у межах норми, що свідчить про
нормальне функціонування системи коагуляції. Виявлено зниження рівня
протромбіну у руслі крові, проте активації системи зсідання крові не
спостерігається (рис.11).
Отже, на модельній системі, плазміноген якої не активується
стрептокіназою, показано, що стрептокіназа здатна впливати на
ендотеліальні клітини та тромбоцити без участі плазміну, викликаючи
значне підвищення вмісту та активності тканинного активатора
плазміногена та вмісту ПАІ-1. Внаслідок впливу стрептокінази на
ендотеліальні клітини, можливо відбувається їх пошкодження, що
узгоджується з припущенням даними літератури де висувається припущення,
що стрептокіназа здатна спричиняти значні ендотеліальні пошкодження.
Можна припустити, що в організмах ссавців, плазміноген яких активується
стрептокіназою, відбувається комбінована дія стрептокінази (пряма та
опосередкована) на систему гемостазу та судинно-тромбоцитарну ланку
зокрема.
З’ясовано, що стрептокіназа впливає на механізми регуляції активності та
взаємодії компонентів системи гемостазу. Виявлено вплив стрептокінази на
динаміку білок-білкових взаємодій між тканинним активатором плазміногена
та інгібітором активаторів плазміногена І типу. Вперше показано, що
спостерігається значне вивільнення тканинного активатора плазміногена з
ендотеліальних клітин внаслідок введення стрептокінази. Виявлено, що
стрептокіназа через 1 годину після введення її у русло крові, здатна
викликати значне підвищення секреції з ?-гранул тромбоцитів інгібітора
активаторів плазміногена І типу на фоні зниження його активності.
Висновки
Вплив стрептокінази на систему гемостазу полягає в утворенні плазміну,
який є посередником її дії на компоненти системи гемостазу. Нами
показано, що існують альтернативні шляхи впливу стрептокінази на
активаційну ланку системи фібринолізу та на систему гемостазу в цілому.
Показано, що стрептокіназа здатна впливати на судинно-тромбоцитарну
ланку системи гемостазу без участі плазміногена.
Виявлено, що стрептокіназа викликає значне вивільнення з ендотеліальних
клітин тканинного активатора плазміногена у русло крові.
Показано, що стрептокіназа викликає значне підвищення секреції з
?-гранул тромбоцитів інгібітора активаторів плазміногена І типу на фоні
зниження його активності.
З’ясовано, що посередниками впливу стрептокінази на динаміку
білок-білкових взаємодій між тканинним активатором плазміногена та його
інгібітором І типу можуть бути плазмін, продукти деградації
фібрину/фібриногену та тромбін.
Розроблено метод визначення активності тканинного активатора
плазміногена під час проведення тромболітичної терапії при патологіях
системи гемостазу.
Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації
Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Макогоненко Є.М. Визначенння активності
тканинного активатора плазміногена у хворих на гострий інфаркт міокарда
// Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2002. – № 3. –
с.87-92.
Краснобрижа Є.М., Савчук О.М., Волков Г.Л. Вплив стрептокінази на
параметри системи гемостазу в модельних системах in vivo // Українській
біохімічний журнал . – 2004. – т. 76. №3 – С.56 – 61.
Краснобрижа Є.М., Савчук О.М., Волков Г.Л. Фібринолітичний потенціал
плазми крові // Медична хімія. – 2004. – №2. – С.30 – 34.
Краснобрижа Є.М., Савчук О.М., Волков Г.Л. Вплив стрептокінази та
антикоагулянтних препаратів на стан системи фібринолізу у хворих на
гострий інфаркт міокарда // Експериментальна та клінічна фізіологія і
біохімія. – 2004 – №2. – С. 86 – 91.
Пат. 51418А Україна, МПК 7С12N9/68. Спосіб діагностики стану системи
фібринолізу: Пат. 51418А Україна, МПК 7С12N9/68. Савчук О.М.,
Краснобрижа Є.М.; Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України. – №
2002032098; Заява 15. 03. 2002; Опубл. 15.11.2002, бюл. № 11. – 3 с.
Пат. 52215А Україна, МПК 7С12N9/68. Спосіб прогнозування тромботичних
ускладнень при різних патологіях, що супроводжуються розвитком
внутрішньо судинного зсідання крові: Пат. 52215А Україна, МПК 7С12N9/68.
Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Чернишенко Т. М. Платонова Т.М.; Інститут
біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України. – № 2002032146; Заявл. 18. 03.
2002; Опубл. 16.12.2002, бюл.№ 12. – 3 с.
Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Мороз Є.Д., Волков Г.Л. Визначення
фібринолітичного потенціалу плазми крові та його взаємозв’язок з
системою зсідання крові // Міжнародний симпозіум „Гемостаз – проблемы и
перспективы”. Київ: Міжвідомчий збірник „Гематологія і переливання
крові”, 2002. – Випуск 31. – С. 99-104.
Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Чернишенко Т. М. Платонова Т.М., Іващенко
Т.І., Деяк С.І., Волков Г.Л. Особливості порушення системи гемостазу при
серцево-судинних захворюваннях // Міжнародний симпозіум „Гемостаз –
проблемы и перспективы”. Київ: Міжвідомчий збірник „Гематологія і
переливання крові”, 2002. – Випуск 31. – С. 94 -98.
Краснобрижая Е.Н., Савчук А.Н.., Волков Г.Л. Способ прогнозирования
тромботических осложнений при развитии ДВС-синдрома // VIII Украинский
биохимический съезд. – Черновцы, 2002. – Т. 74. – С. 149-150.
E. Krasnobryzha Influence of streptokinase on the hemostasis system
parameters // XІХ International Symposium Thrombosis and Haemostasis. –
Birmingham (England), 2003. – CD 087.
Краснобрижая Е.Н. Стрептокиназа – модулятор фибринолитического
потенциала // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых. – м.
Пущино (Россия), 2003. – С. 344 – 345.
Krasnobryzha I., Savchuk O. The t-PA and PAI-1 activities under
treatment by thrombolytic and anticoagulant medicaments in patients with
acute myocardial infarction // 18th International Congress on
Thrombosis. – Ljubljana, Slovenia, 2004. – P. 100 – 101.
анотація
Краснобрижа Є.М. Вплив стрептокінази на активаційну ланку системи
фібринолізу. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна
НАН України, Київ, 2004.
Дисертація присвячена дослідженню впливу стрептокінази на механізми
регуляції активності та взаємодії компонентів системи фібринолізу.
Дослідження проводили з використанням модельних систем in vitro та in
vivo. Особлива увага приділялась дослідженню параметрів тканинного
активатора плазміногена, інгібітора активаторів плазміногена І типу та
їх взаємодії. Також було досліджено наступні компоненти системи зсідання
крові: фібриноген, розчинний фібрин, продукти деградації фібрину та
тромбін.
Проведені дослідження показали, що активність та концентрація тканинного
активатора плазміногена значно підвищується, майже в 3,5 рази, через 1
годину після введення стрептокінази у всіх модельних системах in vivo.
Надалі цей показник наближається до норми. Після введення стрептокінази
активність інгібітора активаторів плазміногена – ПАІ-1 знижується, проте
концентрація ПАІ-1 зростає у 2 рази. Оскільки 90% ПАІ-1 накопичується в
?-гранулах тромбоцитів, можна зробити висновок, що стрептокіназа,
активуючи тромбоцити, призводить до підвищеної секреції ПАІ-1. Отримані
дані свідчать про активацію системи фібринолізу, пов’язану зі зростанням
концентрації тканинного активатора плазміногена у руслі крові і
відповідно компенсаторним підсиленням його інгібування.
Таким чином показано, що стрептокіназа здатна впливати на
судинно-тромбоцитарну ланку системи гемостазу без участі плазміногена,
внаслідок чого відбувається значне вивільнення тканинного активатора
плазміногена та інгібітора активаторів плазміногена І типу.
Ключові слова: фібриноліз, гемостаз, стрептокіназа, тканинний активатор
плазміногена, інгібітор активаторів плазміногена І типу, ендотеліальні
клітини, тромбоцити.
АННОТАЦИЯ
Краснобрижая Е.Н. Влияние стрептокиназы на активационное звено системы
фибринолиза. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. Институт биохимии им. О.В. Палладина
НАН Украины, Киев, 2004.
Диссертация посвящена исследованию влияния стрептокиназы на механизмы
регуляции активности и взаимодействия компонентов системы фибринолиза.
Исследование проводили с использованием модельных систем in vitro и in
vivo (кроли и свиньи). Система гемостаза свиней интересна тем, что её
плазминоген не активируется стрептокиназой, таким образом, исключается
возможное опосредованное влияние плазмина и продуктов деградации
фибрина/фибриногена. Также было проанализировано состояние системы
фибринолиза людей, заболевших острым инфарктом миокарда, которым
проводили лечение препаратами стрептокиназы. Особое внимание уделялось
исследованию параметров тканевого активатора плазминогена, ингибитора
активаторов плазминогена І типа (ПАИ-1) и их взаимодействия.
Проведенные исследования показали, что активность и концентрация
тканевого активатора плазминогена значительно повышается, почти в 3,5
раза, через 1 час после введения стрептокиназы во всех модельных
системах in vivo. На следующих этапах этот показатель приближается к
норме. После введения стрептокиназы активность ингибитора активаторов
плазминогена – ПАИ-1 снижается. Тем не менее, концентрация ПАИ-1 после
введения стрептокиназы возрастает в 2 раза. Поскольку 90% ПАИ-1
накапливается в ?-гранулах тромбоцитов, то можно сделать вывод, что
стрептокиназа, активируя тромбоциты, приводит к секреции ПАИ-1. Отличие
между активностью и концентрацией ПАИ-1, согласно нашим предположениям,
объясняется тем, что изначально ПАИ-1 высвобождается из тромбоцитов в
неактивной форме, вследствие нефизиологического влияния стрептокиназы
либо происходит интенсивное образование комплексов с тканевым
активатором, в котором ПАИ-1 неактивный. Полученные данные могут
свидетельствовать об активации системы фибринолиза вследствие
возрастания концентрации тканевого активатора плазминогена в русле
крови, и, соответственно, компенсаторным усилением его ингибирования.
Анализ данных энзим-електрофореграмм эуглобулиновой фракции плазмы крови
показал, что через 1 час после введения стрептокиназы отмечается
повышение активности тканевого активатора плазминогена относительно
контрольной группы. Исследование параметров системы свертывания крови
выявило снижение уровня протромбина in vivo. В то же время в опытах in
vitro показано, что стрептокиназа активирует протромбин разных видов
млекопитающих (человека, кролика, свиньи). Выявлен дисбаланс в системе
гемостаза, о чем свидетельствует появление растворимого фибрина после
введения стрептокиназы, тогда как в норме он отсутствует.
Анализ фракции растворимых фибрин-мономерных комплексов, проведенный
методом вестерн-блотинг с использованием антител к фибриногену и к
фрагменту Е, показал накопление фибрина/фибриногена, фрагментов X, Y, Д
и Е разной степени расщепления. Максимальное накопление продуктов
деградации регистрируется на 7 день после введения стрептокиназы.
Полученный результат свидетельствует, что стрептокиназа непосредственно
или опосредовано влияет на эндотелиальные клетки и тромбоциты, вызывая
секрецию тканевого активатора плазминогена и ПАИ-1. Опосредствованное
влияние стрептокиназы может происходить через действие плазмина,
продуктов деградации фибрина/фибриногена и тромбина.
Таким образом, в опытах с использованием модельных систем in vivo,
плазминоген которых не активируется стрептокиназой, было показано, что
стрептокиназа способна влиять на сосудисто-тромбоцитарное звено системы
гемостаза без участия плазминогена. Выявлено, что стрептокиназа вызывает
значительное повышение концентрации и активности тканевого активатора
плазминогена через 1 час после введения ее в русло крови, влияя на
эндотелиальные клетки. Возможно, вследствие повреждения эндотелиальных
клеток. Показано, что стрептокиназа вызывает секрецию ПАИ-1 из ?-гранул
тромбоцитов в русло крови.
Ключевые слова: фибринолиз, гемостаз, стрептокиназа, тканевой активатор
плазминогена, ингибитор активаторов плазминогена І типа, эндотелиальные
клетки, тромбоциты.
Summary
Krasnobryzha I. M., Influence of streptokinase on the fibrinolytic
system activation link. – Manuscript.
Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by
specialty 03.00.04 – Biochemistry. – Palladin Institute of Biochemistry
of National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 2004.
The present study is dedicated to the investigation of the effect of
thrombolytic agent – streptokinase (Sk) on the activity and interaction
regulation mechanisms of fibrinolytic system components. The study of
thrombolytic agent influence was carried out with use of in vitro and in
vivo model systems. Especially we were interested in study of the
changing fibrinolytic system parameters such as tissue type plasminogen
activator, plasminogen activator inhibitor (PAI-1), plasminogen,
?2-antiplasmin activities. Also the main parameters of coagulation
system such as fibrinogen, soluble fibrin, fibrin degradation products
levels and thrombin activity were studied.
It was shown that activity and concentration of t-PA were significantly
increased in 3,5 times in 1 hour after streptokinase injection in all
model systems in vivo. On the next stages of investigation this
parameters tend to norm. After streptokinase injection PAI-1 activity
was decreased however PAI-1 quantity was increased in 2 times. PAI-1
activity and concentration are distinguished due to formation of
complexes with t-PA in which PAI-1 is an inactive.
The injection of Sk causes the significant increase of t-PA activity and
quantity possibly due to the direct effects on endothelial cells. We can
conclude that streptokinase causes PAI-1 secretion due to effect on
platelets as 90% of PAI-1 storage is in ? granules of platelets. Thus
analysis of the data displayed besides of well-known Sk function the
influence of Sk on the changing of fibrinolytic system potential
possibly due to its effect of it on endothelial cells and platelets.
Key words: fibrinolytic system, haemostasis system, streptokinase,
tissue plasminogen activator, plasminogen activator inhibitor type I,
endothelial cells, platelets.
PAGE 2
1
В
А
3
2
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
