київський національний університет
імені Тараса шевченка
Копійка Віра Вікторівна
УДК: 612.
017 : [616.-005.9 + 612.112]
Характеристика активованих лімфоцитів у експерименті та клініці
спеціальність 03. 00. 09 – імунологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано на кафедрі імунології та біохімії Запорізького
державного університету Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,
завідувач кафедри імунології та біохімії
Фролов Олександр Кирилович,
Запорізький державний університет
Міністерства освіти і науки України
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник, керівник відділу імунології
Гавриленко Тетяна Іллівна
Інститут кардіології імені М. Д. Стражеска
АМН України
доктор медичних наук, професор
завідувач кафедри загальної та клінічної імунології та алергології
Попов Микола Миколайович,
Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна
Міністерства освіти і науки України
Провідна установа: Інститут фтизіатрії і пульмонології імені
Ф. Г. Яновського АМН України
Захист дисертації відбудеться “8” лютого 2005 р., о 16 00
годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ,
просп. Акад. Глушкова, 2/12; біологічний факультет, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний
факультет; т. 252-16-48.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ім. М. Максимовича
Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033,
м. Київ, вул. Володимирська, 58).
Автореферат розісланий 21 грудня 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Молчанець О. В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Не зважаючи на основну роль імунної системи в
контролі антиген-структурного гомеостазу організму, лабораторні
імунологічні показники ще не стали визначальними при характеристиці
здоров’я, крім розділів імунопатології та трансплантології. Причиною
даного парадоксу є недостатня інформативність доступних для клінічної
практики й експериментальної біології імунологічних методів. Так,
імунологами України на національних імунологічних конґресах і
науково-практичних конференціях неодноразово вказувалося на відсутність
у більшості випадків зв’язку між індивідуальними лабораторними
імунологічними показниками і клінічним станом хворого (Дранник Г. Н.,
1998; Чумак А. А., 1998; Бережная Н. М., 1998). У зв’язку з цим було
запропоновано доповнити загальноклінічні імунологічні методи
фенотипуванням імунокомпетентних клітин моноклональними антитілами та їх
активаційними маркерами (СD25, СD71, СD95, HLA-DR на Т-лімфоцитах та
ін.) (Афримзон Е. А., Чердынцева Н. В., Дизер Л. А. и др., 1996;
Сидоренко С. П., 1998; Пинегин Б. В., Ярилин А. А., Симонова А. В. и
др., 2001).
Однак використання моноклональних антитіл проти панспецифічних
популяційних і субпопуляційних антигенів лімфоцитів не може докорінно
змінити клінічну й експериментальну імунологічну практику, тому що дане
тестування залишається кількісним. Фенотипування лімфоцитів крові проти
активаційних антигенів також не може бути єдиним способом вивчення
функціонального стану імунної системи на момент обстеження. Більшість із
них відносяться до ранніх стадій реакції лімфоцитів на антигени та
мітогени в лімфоїдних органах і не зберігаються або представлені низькою
щільністю на циркулюючих лімфоцитах. Наприклад, рецептори до
інтерлейкіну 2 (СD25) і трансферину (СD71) експресуються на мембранах
Т-лімфоцитів у G1-стадії клітинного циклу для переходу клітини в
S-стадію (Павлюк А. С., Беда М. В. та ін., 1993; Бабаева Е. В.,
Соколенко В. Л., Базыка Д. А., 1999). Вхід лімфоцитів у рециркуляцію
супроводжується їх виходом із мітотичного циклу, що характеризується
G0-стадією. В процесі даного переходу відбувається докорінна перебудова
клітини: втрата одних і поява інших мембранних і метаболічних ознак.
Тому в периферичній крові донорів частота лімфоцитів, які несуть
активаційні ознаки невелика: СD25+ – 1,5-4%, СD71+ – 1-3%, HLA-DR –
8-10% (Павлюк А. С., Беда М. В., Веселова А. В., 1993). Звичайно, при
патології й експериментальних навантаженнях на імунну систему частота
лімфоцитів із ознаками активації підвищується (Ковальчук Л. В., Беда М.
В., Веселова А. В., 1994; Беда М. В., Павлюк А. С., Веселова А. В.,
1995; Ковальчук Л. В., Чередеев А. Н., 1999; Лебедев К. А., 2001;
Симонова А. В., 2002), але це підвищення не відображає весь об’єм
новоутворення лімфоцитів у ході імуногенезу. Тому патогенетичну
значимість активаційних мембранних антигенів на циркулюючих лімфоцитах
ще необхідно вивчати та встановлювати їх зв’язок із іншими клітинними
ознаками активації.
Таким чином, актуальною проблемою сучасної клінічної імунології є
перехід від емпіричного до патогенетичного підходу в аналізі стану
імунної системи за оцінкою основних етапів імуногенезу за допомогою
методів, які тестують більш пролонговані ознаки активації на циркулюючих
у внутрішньому середовищі лімфоцитах.
Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дана робота проводилася в
рамках науково-дослідної роботи університету на тему “Розробка критеріїв
оцінки функціональної активності лімфоцитів в організмі людини і тварин
і їх імунокорекції” (№ держреєстрації 01910054345). Надалі ці
дослідження були продовжені при виконанні науково-дослідної роботи з
теми “Вивчення впливу конституціональних особливостей антиген
структурного поліморфізму на гомеостатичну функцію імунної системи на
ранніх етапах онтогенезу в умовах забрудненого навколишнього середовища”
(№ держреєстрації 0197U012790) та “Розробка і впровадження
патогенетичного підходу до аналізу стану імунної системи у людини і
тварин на різних етапах” (№ держреєстрації 0100U001725).
Мета дослідження. Розробка імуногенезних (патогенетичних) методів
оцінки стану імунітету шляхом виявлення пролонгованих
загальноклітинних, стереотипних ознак активації і порівняння
фенотипічних зрушень класів лімфоцитів у ході антиген- і мітогензалежної
диференціації в культурі та у внутрішньому середовищі організму.
Задачі дослідження:
1) вивчити розвиток загальноклітинних, популяційних, субпопуляційних
цитологічних, метаболічних і мембранних ознак лімфоцитів у
короткостроковій і тривалій культурі лімфоцитів при антигенній і
мітогенній стимуляції, із модифікацією екзогенним інтерлейкіном 2 (ІЛ
2);
2) порівняти частоту активованих лімфоцитів у периферичній крові та у
місці патології – плевральному ексудаті у хворих ексудативним плевритом
запальної і канцерогенної етіології;
3) провести апробацію досліджуваних методів при аналізі стану імунітету
у хворих на бронхолегеневу патологію в процесі лікування;
4) вивчити варіації активованих лімфоцитів у периферичній крові та
культурі лімфоцитів у новонароджених дітей із різними клінічними
варіантами затримки внутрішньоутробного розвитку зі співставленням
частот основних популяцій і субпопуляцій лімфоцитів крові, маркованих
моноклональними антитілами (МКАТ) до CD3,CD4, CD8, CD16, CD20;
5) порівняти кількісні та функціональні показники циркулюючих лімфоцитів
крові у новонароджених дітей із рівнем потенційної проліферативної
активності цих клітин у культурі з мітогеном фітогемаглютиніном (ФГА) та
їх сенсибілізації до тканинних антигенів тимусу і головного мозку;
6) за допомогою кореляційного аналізу виявити загальні та специфічні
закономірності співвідношення й динаміки активованих популяцій і
субпопуляцій лімфоцитів у клітинних культурах і у внутрішньому
середовищі організму.
Об’єкт дослідження. Лімфоцити крові та плеврального ексудату обстежених
здорових і хворих осіб.
Предмет дослідження. Ознаки активації лімфоцитів у короткострокових і
тривалих культурах лімфоцитів і на основних етапах імуногенезу у
здорових і хворих осіб.
Методи дослідження. Гематологічні методи для оцінки вмісту лейкоцитів,
визначення відносного і абсолютного вмісту окремих видів лейкоцитів;
міоген- і антигенстимульовані культури лімфоцитів; цитогенетичний;
цитоморфометричний; люмінесцентний із використанням акридинового
оранжевого; аналіз адгезивної здатності Т-лімфоцитів у тесті Е-РУК із
урахуванням їх авідності до еритроцитів барана; мікро- і макрометод
оцінки РБТЛ; непрямий варіант визначення поверхневих антигенів
лімфоцитів за допомогою моноклональних антитіл до CD3, CD4, CD8, CD16,
CD20, CD25; методи отримання пептидних комплексів із тимусу і головного
мозку.
Наукова новизна. Вперше в короткостроковій і тривалій культурі
лімфоцитів, стимульованих мітогенами й антигенами, у комплексі вивчений
спектр загальноклітинних популяційних і субпопуляційних імуногенетичних
ознак активації: цитогенетичних, цитоморфометричних, авідних розеточних
з еритроцитами барана, люмінесцентних із акридиновим оранжевим.
Виявлено один із механізмів стимуляції імуногенезу екзогенним ІЛ-2 –
залучення до імуногенезу інтактних довгоциркулюючих в організмі
лімфоцитів.
Уперше для аналізу імунної системи пропонуються дві ознаки, характерні
для клонів активованих лімфоцитів серед популяцій циркулюючих
лімфоцитів: розмір клітин; авідність Т-лімфоцитів до еритроцитів барана
(ЕБ), які стали основою для розробки відповідних методів:
1) цитоморфометричного – заснованого на аналізі частоти класів
лімфоцитів (КЛ) із діаметром до 6,0 мікрометрів (мкм) (КЛ? 6,0 мкм) і
частини КЛ із діаметром клітин 10 і більше мкм (КЛ? 10 мкм);
2) авідного розеткового – заснованого на аналізі частоти КЛ, що
приєднали 8 і більше еритроцитів барана (КЛ? 8 ЕБ).
.
У запропонований комплекс методів входять раніше використовувані тести,
імуногенезна (патогенетична) значимість яких нами уточнена:
цитогенетичний метод – заснований на аналізі частоти класів лімфоцитів
без асоціацій акроцентричних хромосом (ААХ) (КЛ 0 ААХ) і з двома
акроцентриками в асоціаціях (КЛ 2 ААХ), у сумі (КЛ 0+2 ААХ);
люмінесцентний – заснований на аналізі інтенсивності люмінесценції (I) в
умовних одиницях (у.о.) при довжині хвилі 640 нанометрів (нм) (I 640 нм)
лімфоцитів, флуорохромованих акридиновим оранжевим (АО).
Уперше нами запропонований і апробований на групах обстежених здорових і
хворих осіб (дослідження in vivo) комплекс імуногенезних
(патогенетичних) методів, заснованих на виявленні в циркулюючих
лімфоцитах залишкових ознак їх активації в лімфоїдних органах і які
оцінюють стан імунної системи людини за рівнем імуногенезу і напрямку
міграції лімфоцитів у внутрішньому середовищі організму, характеризують
основні етапи гісто- та імуногенезу лімфоцитів: активацію, проліферацію,
диференціацію і міграцію лімфоцитів в організмі на момент обстеження.
Наукова новизна підтверджена 2 впровадженими деклараційними патентами на
винахід.
Практичне значення. Виділено інформативні ознаки активації лімфоцитів,
що відображають їх попередній імуноцитопоез і імуногенез у центральних і
периферичних органах імунної системи, встановлена їх відповідність
етапам імуногенезу: активації, проліферації, диференціації, що буде мати
застосування в експериментальній біології та клінічній імунології.
На основі виділених залишкових ознак активації на циркулюючих у
внутрішньому середовищі організму лімфоцитах розроблені та впроваджені
імуногенезні (патогенетичні) методи: цитогенетичний, цитоморфометричний,
авідний розеточний із ЕБ, люмінесцентний із АО. Визначено взаємозв’язок
із кількісними і функціональними методами, у тому числі і з
застосуванням МКАТ, які використовуються в традиційній лабораторній
імунології, що дозволяє їх комплексне інтегрування.
Запропоновано індивідуальний підхід до аналізу стану імунної системи за
рівнем імуногенезу та міграції активованих лімфоцитів у організмі, що
дозволяє визначати депонування імунокомпетентних клітин у патологічних
осередках або в органах із напругою функції та наступний їх вихід у
загальну рециркуляцію при реконвалесценції або відновленні вихідного
рівня антиген структурного гомеостазу.
Доведена необхідність пролонгації стаціонарного лікування і подальшого
диспансерного спостереження дітей і дорослих, у яких рівень активованих
лімфоцитів у периферичній крові не досяг фізіологічного рівня.
Отримані дані успішно застосовуються в практиці імунологічного
обстеження дітей на кафедрі шпитальної педіатрії Запорізького державного
медичного університету. Аналіз частот активованих лімфоцитів та їх
сенсибілізації до тканинних антигенів тимуса і головного мозку
покладений в основу укладання класифікації новонароджених дітей за типом
затримки внутрішньоутробного розвитку.
Основні положення дисертаційної роботи застосовуються при підготовці
студентів біологічного факультету Запорізького державного університету з
профільних дисциплін і циклів спеціалізації “Біохімія та імунологія”.
Препарати і матеріали, отримані в результаті виконання роботи,
використовуються в навчальному процесі студентами Запорізького
державного університету.
Особиста участь автора при отриманні результатів, які представлено в
дисертації. Автор дисертації самостійно оцінював стан імунної системи
дітей і дорослих, виконував лабораторні дослідження, проводив їх
статистичну обробку й оформлення. Науково обґрунтував і розробив
комплекс методів імуногенезного (патогенетичного) аналізу для
індивідуальної оцінки стану імунітету дітей і дорослих. Аналіз та
обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим
керівником – доктором медичних наук, професором, завідувачем кафедри
імунології та біохімії Запорізького державного університету.
Робота виконувалася на кафедрі імунології та біохімії Запорізького
державного університету. Апробація даних дисертації проходила на 4-ій,
5-ій та 6-ій Українських науково-практичних конференціях з актуальних
питань алергології, клінічної та лабораторної імунології (Київ 1999,
2000, 2002), на 4-му Міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми
старіння” (Харків 2000), на 3-му з’їзді імунологів і алергологів СНД
(Сочі 2000), на 3-ій Всеукраїнській науково-практичній конференції
“Питання імунології в педиатрії”, міжнародній науковій конференції
“Каразинські природознавчі студії” (Харків 2004) і щорічних підсумкових
наукових конференціях студентів і викладачів Запорізького державного
університета (Запоріжжя 1998-2004).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, серед яких
5 статей в спеціалізованих виданнях, затверджених ВАК України, 8 тез, 2
деклараційних патенти на винахід. Патенти підтверджені актами про
впровадження на кафедрі шпитальної педіатрії Запорізького державного
медичного університету, розташованій на базі Запорізької обласної
дитячої лікарні, на кафедрі педіатрії Запорізької медичної академії
післядипломної освіти, на кафедрі гістології Запорізького державного
медичного університету.
Обсяг і структура дисертації. Матеріали дисертації викладено на 160
сторінках. Дисертація складається зі вступу, 3 розділів, аналізу і
узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних
рекомендацій, списку використаних джерел і додатків. Список літератури
містить 196 джерел, із яких 16 – іноземних авторів. У роботі наводиться
25 таблиць, 7 рисунків, у додатках міститься 10 мікрофотографій.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Виявлення на циркулюючих лімфоцитах
залишкових ознак їх попереднього імуногенезу в лімфоїдних органах
проводилось в культурах лімфоцитів: 1) короткострокових, стимульованих
ФГА (3 донори 26-34 років, тривалість культивування складала 3 доби) та
екзогенним інтерлейкіном 2 (3 донори 26-34 років, тривалість
культивування – 3 доби); 2) тривалих, стимульованих ФГА та мітогеном
лаконоса (3 донори 26-34 років, тривалість культивування – до 15 днів),
у тому числі стимульованих HLA-DR антигенами в одно- та двоспрямованій
змішаній культурі лімфоцитів (16 подружніх пар 17-37 років, тривалість
культивування – 7 діб). Запропонований напрямок оцінки стану імунітету
та імуногенезні методи впроваджені при клінічних дослідах у наступних
групах обстежених: 1) хворі на ексудативний плеврит запальної (1 жінка і
4 чоловіка 46-74 роки) та метастатичної (5 жінок 46-54 роки) етіології з
первинною локалізацією первинної пухлини в молочних залозах, контрольну
групу складали 22 донора (19 чоловіків і 3 жінки 24-57 років)
Запорізької станції переливання крові; 2) діти із бронхолегеневою
патологією (гострі бронхіти – 14 осіб 8-14 років, гострі пневмонії – 11
осіб 8-15 років, алергічні захворювання – 8 осіб 6-15 років),
контрольною групою були 11 дітей віком 6-11 років; 3) новонароджені із
затримкою внутрішньоутробного розвитку (ЗВУР) (гіпотрофічний варіант
ЗВУР – 12 дітей, гіпопластичний варіант – 12, диспластичний – 5,
недиференційований – 6), групою контролю були 14 новонароджених
подібного віку. У значної частини новонароджених, як клінічний симптом,
спостерігалась тимомегалія різного ступеня. Тому в останній групі дітей
було проведене дослідження стану імунітету новонароджених без ознак
тимомегалії (Т0) та дітей із тимомегалією в залежності від ступеня її
прояву – 1-го, 2-го,
3-го ступеня (Т1, Т2, Т3 відповідно). Матеріалом для дослідження як in
vitro, так і in vivo була венозна гепаринізована кров. Виняток складала
група дітей із бронхолегеневою патологією, у яких для дослідження стану
імунітету брали капілярну кров ( з пальця) в 2 етапи – при надходженні в
стаціонар (гострий період) та через 8 днів (рання репарація). У хворих
на ексудативний плеврит різної етіології для вивчення імунологічної
активності лімфоцитів із патологічного осередку (плеврального ексудату)
та порівняння їх функціональної характеристики з лімфоцитами крові,
додатково збирався плевральний ексудат. Імуногенезна характеристика
досліджуваних методів доводилась кореляційними зв’язками в культурі
лімфоцитів (in vitro) і в крові обстежених (in vivo), включно із
застосуванням МКАТ до панспецифічних (CD3, CD4, CD8, CD16, CD20) і
стадіоспецифічних (CD25) мембранних структур.
Результати та їх обговорення. У результаті проведених досліджень було
виявлено, що залишковими, відносно пролонгованими активаційними ознаками
попереднього імуногенезу на циркулюючих в організмі людини лімфоцитах є:
частота асоціацій акроцентричних хромосом, розмір клітин, авідність
Т-лімфоцитів до ЕБ та інтенсивність люмінесценції лімфоцитів,
флуорохромованих акридиновим оранжевим.
На основі виявлених активаційних ознак були розроблені відповідні
імуногенезні (патогенетичні) методи.
Запропонований комплекс імуногенезних (патогенетичних) методів
(цитогенетичний, цитоморфометричний, авідний розетковий і люмінесцентний
із застосуванням АО) є основою для формування нового напрямку
патогенетичного підходу до оцінки імунної системи людини – аналіз рівня
імуногенезу та міграції активованих лімфоцитів у внутрішньому середовищі
організму.
У результаті проведених досліджень у короткостроковій стимульованій ФГА
(20 мкг/мл) культурі лімфоцитів (табл. 1) було виявлено, що збільшення
на 1 добу експресії раннього активаційного маркера CD25+ збіглося з
початком підвищення рівня реакції бластної трансформації лімфоцитів
(РБТЛ), збільшенням частоти КЛ(8 ЕБ, які характеризують активацію
лімфоцитів до їх вступу в проліферацію, та КЛ(6,0 мкм. Збільшення
останніх було результатом постактиваційної апоптотичної реакції, так як
перші мітози в культурі виявлялися лише після двох діб культивування. На
2 добу в культурі збільшилася кількість бласттрансформованих лімфоцитів
і КЛ? 10,0 мкм, у яких було відзначено значне зростання люмінесцентного
показника І 640 нм і особливо І 530 нм, що свідчить про активацію їх
білок-синтетичної системи, характерне для даного періоду клітинного
циклу.
Подібний із літературними даними пік РБТЛ (3 доба) збігся з
максимальними значеннями КЛ? 10,0 мкм, І 530 нм і І 640 нм на тлі
мінімальних рівнів КЛ? 6,0 мкм та КЛ? 8 ЕБ.
Таблиця 1
Динаміка цитоморфометричних, авідного розеткового до еритроцитів барану,
люмінесцентних показників і частоти СD25 у короткостроковій культурі
лімфоцитів, одноразово стимульованій ФГА
у день постановки досліду
Доба культи-вування Цитоморфомет-ричні показники, % РБТЛ, % CD 25, % КЛ?
8 ЕБ, % Люмінесцентні показники, у.о.
КЛ? 6,0 мкм КЛ? 10,0 мкм І 530 нм І 640 нм
0 13,0±
2,38 23,0±
2,98 2,0±
0,99 3,0±
1,21 26,0±
3,10 2,61±
0,04 0,49±
0,02
1 22,0±
2,93* 26,0±
3,10 31,0±
3,27* 28,0±
3,17* 34,0±
3,35 2,31±
0,03* 0,69±
0,03*
2 15,0±
2,52 40,0±
3,46* 44,0±
3,51* 37,0±
3,41* 17,0±
2,66* 5,90±
0,09* 1,77±
0,04*
3 8,0±
1,92* 52,0±
3,53* 78,0±
2,93* 59,0±
3,48* 3,0±
1,21* 6,65±
0,06* 2,66±
0,03*
5 11,0±
2,21 50,0±
3,54 56,0±
3,51* 45,0±
3,52* 12,0±
2,30* 3,46±
0,04* 2,11±
0,02*
Примітка: * – показник, який достовірно відрізняється від значення
попередньої доби культивування.
Для визначення впливу ІЛ2 на імунокомпетентні клітини ставили
мітогенстимульовану культуру лімфоцитів. Результати досліджень у 3-х
короткострокових стимульованих ФГА (20 мкг/мл) (контроль) й
ФГА+екзогенний ІЛ2 (20 мкг/мл ФГА+ 0,12 мл екзогенного ІЛ2 з кінцевим
розведенням цитокіну в культурі 1:25) (дослід) культурах лімфоцитів
показали, що у всіх обстежених під впливом зазначеного цитокіну
відмічена тенденція до зниження кількості КЛ 0+2 ААХ і підвищення частки
КЛ 3-10 ААХ. Так, вміст КЛ 0+2 ААХ у культурі лімфоцитів, стимульованій
ФГА склав 27,33±2,57%, а в стимульованій ФГА у комбінації з екзогенним
ІЛ2 – 22,67±2,42%. Зважаючи на те, що КЛ 0+2 ААХ характеризують
проліферативний пул лімфоцитів імунної системи, а КЛ 3-10 ААХ складають
довгоциркулюючі, але тимчасово інтактні лімфоцити, нами розкритий
механізм імуностимулюючої дії ІЛ2 – додаткове залучення до мітотичного
циклу довгоциркулюючих лімфоцитів пам’яті, що приводить в організмі до
збільшення об’єму лімфоцитів, які реагують на антиген.
При тривалому культивуванні 3-х культур лімфоцитів, стимульованих ФГА
(20 мкг/мл) і 3-х – мітогеном лаконоса (1 мкг/мл) (до 15 доби, рис. 1),
по мірі культивування клітин до 9 доби поступово наростала кількість КЛ
0+2 ААХ, демонструючи проходження лімфоцитами послідовних мітозів, при
яких руйнуються асоціації акроцентричних хромосом.
Рис. 1. Частота КЛ 0+2 ААХ в субкультурах лімфоцитів, стимульованих ФГА
та мітогеном лаконоса (МЛ), відібраних із культур, одноразово
стимульованих ФГА у день їх постановки.
Отже, КЛ 0+2 ААХ, що тестуються в крові, є активованими ще в організмі
людини і недавно ввійшли в пул рециркулюючих лімфоцитів після серії
мітотичних поділів. Різна частота КЛ 0+2 ААХ у субкультурах із ФГА і МЛ
вказує на неоднакову чутливість популяцій лімфоцитів до даних мітогенів:
на ФГА реагують більшість Т-лімфоцитів, а на МЛ – переважно В-лімфоцити.
Крім того, підвищені значення КЛ 0+2 ААХ у культурах із МЛ вказують на
більш швидке оновлення в рециркулюючому пулі В-лімфоцитів, ніж Т-клітин.
Зниження частоти КЛ 0+2 ААХ на 9-11 дні культивування відбувалося
внаслідок втягування у проліферативні реакції довгоциркулюючих
клітин-пам’яті з високою вихідною частотою ААХ. Починаючи з 12-14 дня
культивування в проліферацію втягується переважна більшість лімфоцитів і
до кінця досліду їх доля складала 70-80%.
Динаміка показників активації лімфоцитів у тривалих ФГА-стимульованих
(20 мкг/мл) культурах лімфоцитів (без подальшого субкультивування) була
подібною (табл. 2).
Так, максимум РБТЛ спостерігався на 3 добу культивування з наступними
піками на 5, 9 і 11 добу, відображаючи гетерогенність популяції
лімфоцитів і їх послідовне залучення в проліферацію.
Відповідно РБТЛ змінювалися і цитоморфометричні та розеткові показники.
Так, частота КЛ? 6,0 мкм знижувалася при залученні лімфоцитів до
проліферативної реакції (3, 5, 9, 11 доба культивування), досягаючи
мінімальних величин на найбільшій висоті РБТЛ (3 доба), після якої
частка КЛ? 6,0 мкм (4, 6, 10 доба) і КЛ 0+2 ААХ (55 годин-10 доба)
збільшувалася, відображаючи об’єм новоутворених у результаті серії
мітозів вторинних малих лімфоцитів.
Динаміка змін розеткоутворення Т-лімфоцитів збігалася з функціональними
ознаками СD2-структури: активації й адгезії. У період активації культури
на 31 годині відзначено перший значний підйом розеткоутворюючої
активності та їх авідності до ЕБ. Зниження експресії СD2, що
проявляється зменшенням КЛ? 8 ЕБ, на 3-ю добу пояснюється тим, що на
попередніх етапах (24-31 година) у клітини вже був проведений активуючий
мітогенний сигнал. Тому на етапах бластної трансформації лімфоцитів і
проліферації функціональне навантаження на СD2-рецептор знижується. На
наступних етапах культивування у вторинних малих лімфоцитах, що
утворилися, підсилюються процеси диференціації, внаслідок чого частота
Е-РУК і КЛ? 8 ЕБ зростає. Висновок щодо функціональних ознак
CD2-структури підтверджується негативною кореляцією між рівнем РБТЛ і
Е-РУК (r= -0,41±0,21 для 1 донора і r= -0,56±0,17 для 2 донора), з КЛ? 8
ЕБ (r= -0,22±0,25 і r= -0,45±0,19 відповідно).
Зміна включення АО у нуклеїнові кислоти мала хвилеподібний синергічний
характер із піками на 55 годині, 7, 9-10 добі культивування, що
передувало наступному збільшенню кількості бласттрансформованих
лімфоцитів.
Подібна закономірність зниження розеткоутворюючої здатності
Т-лімфоцитів при збільшенні рівня РБТЛ виявлена й у змішаній одно- і
двоспрямованій культурі (ЗКЛ) лімфоцитів 16 подружніх пар. Так, при
підвищенні рівня РБТЛ в обох варіантах ЗКЛ знижується загальна кількість
Е-РУК (в середньому на 15%) й особливо високоавідних Т-лімфоцитів (в
середньому в 2 рази). При цьому коефіцієнт кореляції між рівнем РБТЛ і
ступенем зниження Е-РУК складав +0,739±0,11 в односпрямованій і
+0,769±0,10 у двоспрямованій ЗКЛ; між РБТЛ і ступенем зниження КЛ? 8 ЕБ
– +0,757±0,11 і + 0,600±0,16 відповідно. Даний експеримент також
підтвердив переважну функцію СD2-структури – участь на початкових
стадіях активації й у наступній адгезії Т-лімфоцитів.
Таким чином, моделювання основних етапів імуногенезу в короткостроковій
і тривалій культурах лімфоцитів, стимульованих мітогенами та антигенами,
показало імуногенезну значимість виявлених залишкових ознак активації
лімфоцитів у вторинних лімфоїдних органах (цитогенетичних,
цитоморфометричних, люмінесцентних і авідних розеткових) і довело
наявність їх зв’язку з окремими етапами імуногенезу. Наявність таких
ознак на циркулюючих у внутрішньому середовищі лімфоцитах дала підставу
для можливості проведення індивідуальної об’єктивної оцінки стану
імунної системи організму. Апробація вищевказаних методів була проведена
в клінічних дослідах.
Таблиця 2
Динаміка цитогенетичного, цитоморфометричних, авідного розеткового із ЕБ
та люмінесцентних показників у тривалій культурі лімфоцитів, одноразово
стимульованій ФГА у день постановки культури (без субкультивування)
Доба культивування Показник
РБТЛ, % КЛ 0+2 ААХ, % КЛ? 6,0 мкм, % КЛ? 8 ЕБ, % І 530 нм, у.о. І 640
нм, у.о.
0 2,0±0,66 0 16,5±1,86 17,5±1,90 2,51±0,04* 0,53±0,02*
1 30,5±2,30* 0 16,0±1,83 27,0±2,22* 2,29±0,03* 0,71±0,02*
31 година 35,0±2,38 – 29,5±2,28* 31,0±2,31 1,95±0,05* 0,43±0,01*
2 42,5±2,47* 26,0±3,10 15,0±1,79* 13,5±1,71* 5,03±0,15* 1,59±0,04*
55 годин 41,5±2,46 – 21,5±2,05* 6,5±1,23* 6,40±0,08* 2,71±0,04*
3 65,5±2,38* 36,0±3,39* 6,0±1,19* 2,25±0,74* 5,96±0,12* 2,37±0,05*
4 43,0±2,48* 58,5±3,48* 23,5±2,12* 21,75±2,06* 2,55±0,04* 2,64±0,03*
5 48,0±2,50 62,5±3,42 13,0±1,68* 8,0±1,36* 3,55±0,05* 2,04±0,02*
6 40,0±2,45* 71,0±3,21 32,0±2,33* 21,75±2,06* 4,69±0,08* 1,50±0,02*
7 35,0±2,38 72,5±3,16 21,5±2,05* 17,25±1,89 6,29±0,10* 2,54±0,06*
8 32,0±2,33 77,5±2,95 45,5±2,49* 18,25±1,93 3,63±0,05* 1,25±0,03*
9 38,0±2,43 83,0±2,65 40,0±2,45 11,25±1,58* 7,89±0,06* 2,82±0,03*
10 21,0±2,04* 89,0±2,21 43,5±2,48 7,0±1,28* 6,58±0,20* 2,91±0,04
11 42,0±2,47* – 33,0±2,35* 19,75±1,99* 2,46±0,08* 0,87±0,03*
12 43,0±2,48 – 21,5±2,05* 17,0±1,88 2,90±0,06* 1,62±0,05*
14 44,0±2,48 – 26,0±3,10 18,0±2,72 2,24±0,06* 1,12±0,04*
15 29,0±2,27* – 33,0±3,32 27,0±3,14 1,89±0,03* 0,92±0,03*
Примітка: * – показник, який достовірно відрізняється від значення
попередньої доби культивування; І 530 нм – інтенсивність флуоресценції в
умовних одиницях при довжині хвилі 530 нм; І 640 нм – інтенсивність
флуоресценції в умовних одиницях при довжині хвилі 640 нм; “-” –
дослідження не проводились.
Ексудативні плеврити (ЕП) є зручною патогенетичною групою захворювань у
наших дослідах, тому що лімфоцити можуть бути отримані безпосередньо з
патологічного осередку (з плеврального ексудату) і більшість лімфоцитів
плеврального ексудату (ПЕ) імунологічно активні.
Виявлено (табл. 3), що в крові хворих на метастатичний плеврит частота
циркулюючих цитогенетичних (КЛ 0+2 ААХ) класів лімфоцитів була вище, ніж
у хворих із запальним ексудативним плевритом, які мали подібний до
донорів вміст КЛ 0+2 ААХ, що підкреслює більш сильну напругу імунітету в
групі хворих із метастатичними плевритами. Такий висновок
підтверджується збільшенням частоти КЛ? 8 ЕБ у периферичній крові та ПЕ
хворих на ексудативний плеврит, особливо в групі з метастатичною
етіологією ЕП. Кількість активованих лімфоцитів із КЛ? 6,0 мкм у
периферичній крові всіх хворих була у 1,8-2 рази вище, ніж відповідний
показник донорів, що свідчить про активні проліферативні реакції
лімфоцитів у організмі хворих на ексудативний плеврит.
Таблиця 3
Порівняльна характеристика показників цитогенетичного,
цитоморфометричного та авідного розеткового методів у крові та
в плевральному ексудаті у хворих на ексудативний плеврит різної
етіології
Показник, % Дослід-жувана біологіч-на рідина Обстежені групи
Донори
(контроль) Хворі на ЕП (запальна+ме-тастатична етіологія) ЕП
запальної етіології ЕП метаста-тичної етіології
КЛ 0+2 ААХ Кров 25,2±1,12 27,3±2,7 22,8±4,65 31,8±1,02*
ПЕ – 44,7±1,59* 43,8±2,37* 45,6±2,32*
КЛ? 6,0 мкм Кров 14,39±1,56 26,05±1,74* 25,1±3,40* 27,0±1,25*
ПЕ – 53,4±3,83* 52,1±7,77* 54,7±2,21*
КЛ? 10,0 мкм Кров 13,59±1,86 3,95±0,80* 4,0±1,38* 3,9±0,99*
ПЕ – 4,95±0,86* 6,6±0,80* 3,3±1,15*
КЛ? 8 ЕБ Кров 37,16±0,70 44,28±2,45* 42,13±5,15 46,0±1,99*
ПЕ – 47,94±4,47* 46,0±4,64 49,5±7,59
Примітка: * – показники, які достовірно відрізняються від даних групи
контролю.
,
0
,
.
0
\
L
’
Ue
??
L
U
Ue
TH
Ue
TH
??
??
hO:AEB*
hO:AEB*
hO:AEB*
&
hO:AEB*
?$?частоти активованих лімфоцитів у порівнянні з периферичною кров’ю
були різко підвищені (цитогенетичні – у середньому в 1,5 рази,
цитоморфометричні – у 2 рази). Таке підвищення підтверджує нашу
концепцію про перерозподіл і депонування активованих лімфоцитів у
патологічних осередках. Тому в ряді випадків виявлена лімфопенія не є
абсолютною, а може бути результатом перерозподілу активованих фракцій
лімфоцитів у місця патології.
Частота високоавідних розеточних класів лімфоцитів (КЛ? 8 ЕБ) у крові і
плевральному ексудаті хворих на ЕП різної етіології були однаково
високими і статистично не відрізнялися між собою. Даний факт підкреслює
тимчасову наявність підвищеної щільності CD2 структур на активованих
лімфоцитах, що обмежується передмітотичною фазою імуногенезу, у
порівнянні з іншими активованими показниками (цитоморфометричними і
цитогенетичними).
За збільшенням рівня лейко- та лімфопенії класів активованих лімфоцитів
(табл. 4) виявлена ступінь важкості протікання патологічного процесу в
групах дітей із бронхолегеневими захворюваннями (за збільшенням важкості
протікання патології): із гострими бронхітами – із гострими пневмоніями
– з алергічними захворюваннями (бронхіальна астма). При цьому в
більшості дітей із бронхітами і пневмоніями при виписці зі стаціонару
імунологічні показники кількості КЛ? 6,0 мкм і КЛ? 8 ЕБ поверталися до
рівня здорових дітей.
Таблиця 4
Динаміка імунологічних показників лімфоцитів крові дітей
із бронхолегеневою патологією в динаміці лікування
Групи Цитоморфометричні показники, % КЛ? 8 ЕБ, % РБТЛ, %
КЛ? 6,0 мкм КЛ? 10,0 мкм
Здорові (контроль) 23,80±2,08 6,45±0,82 8,35±0,68 73,95±2,40
Бронхіти 1 22,46±1,66 8,43±0,87 7,54±0,69 61,14±1,27*
2 34,46±1,62* 8,64±0,63* 9,21±0,46 62,54±1,59*
Пневмонії 1 20,68±2,89 9,77±1,10* 6,86±0,50 53,36±2,03*
2 33,64±2,59* 12,45±1,87* 8,41±0,57 71,55±1,27
Алергічні захворювання 1 16,50±2,04* 20,87±2,72* 10,31±1,03 59,88±2,01*
2 12,13±1,19* 17,06±1,91* 15,5±1,08* 56,00±3,10*
Примітка: * – показники, які достовірно відрізняються від даних
контрольної групи; 1 – гострий період хвороби; 2 – рання репарація.
У обстежених із пневмоніями, як і в групі з бронхітами, початок санації
антигенного осередку виявлявся масовим виходом у периферичну
рециркуляцію КЛ? 6,0 мкм, але з одночасним збільшенням КЛ? 10,0 мкм,
частиною з яких є активовані незрілі імунобласти. Найбільш важке
протікання захворювання відзначене в дітей з алергічними захворюваннями,
у яких депонування активованих КЛ? 6,0 мкм і збільшення в периферичній
крові
КЛ? 10,0 мкм, що мають високу щільність СD2-структури, продовжувалося й
у період ранньої репарації.
Знижені рівні РБТЛ унаслідок депонування КЛ? 6,0 мкм, що зберігають
підвищену проліферативну активність на мітогени (зокрема на ФГА) у всіх
обстежених хворих характеризували ступінь напруги імунної системи дітей.
У групах обстежених новонароджених дітей із затримкою
внутрішньоутробного розвитку (ЗВУР) за допомогою методу фенотипування
лімфоцитів МКАТ (табл. 5) виявлене істотне зниження кількості
Т-лімфоцитів у всіх групах, яке відбувалося, в основному, за рахунок
зниження кількості
Т-хелперів.
Таблиця 5
Імунологічні показники лімфоцитів новонароджених
із затримкою внутрішньоутробного розвитку
Показник, % Обстежені групи новонароджених за варіантом ЗВУР
КГ ГТ ГП ДП НД
Фенотипу-вання лімфоцитів із використан-ням МКАТ CD3 49,5±
2,12 38,91±
6,93 28,42±
5,76* 27,8±
9,63* 18,8±
6,85*
CD4 41,86±
3,18 20,82±
3,72* 22,08±
4,57* 18,0±
9,97* 30,2±
8,06
CD8 29,14±
4,64 24,18±
3,63 15,75±
3,80* 19,0±
6,18 20,6±
5,10
CD16 23,93±
4,13 10,91±
2,53* 10,75±
2,25* 24,4±
6,99 26,2±
10,18
CD20 20,0±
2,61 21,27±
4,35 20,08±
3,45 28,6±
2,93* 41,6±
11,20
КЛ? 6,0 мкм 35,0±
5,51 33,71±
4,73 25,21±
5,68 25,5±
14,36 7,21±
4,37*
КЛ? 10,0 мкм 14,32±
4,77 14,75±
3,20 20,08±
4,28 16,4±
6,35 46,08±
10,04*
КЛ? 8 ЕБ 28,86±
3,21 19,95±
2,90* 27,33±
3,67 19,1±
1,86* 30,17±
4,61
Інтактні лімфоцити І 530 нм 1,45±
0,19 1,72±
0,24 2,13±
0,32 1,21±
0,13 1,72±
0,18
І 640 нм 0,76±
0,11 0,57±
0,09 0,91±
0,16 0,57±
0,13 0,51±
0,14
Індекс стимуляції
(І 530 нм +
І 640 нм)
у РБТЛ на: ФГА 244,02±39,39 282,08±42,30 177,46±29,78 195,92±39,20
200,85±29,51
Т 99,61±
19,20 73,79±
12,48 98,50±
20,71 98,69±
26,10 166,80±33,40
ГМ 90,96±
18,00 164,98±24,80* 116,30±25,85 94,90±
20,90 183,82±36,60*
Примітка: * – показники, які достовірно відрізняються від даних групи
контролю.
Зниження Т-ефекторів (СD8) виявлено лише в гіпопластичному (ГП) варіанті
ЗВУР, натуральних кілерів – у ГП і гіпотрофічному (ГТ) варіантах.
Напруга В-системи відзначалася збільшенням кількості СD20 у
диспластичному (ДП) й особливо в недиференційованому (НД) типах ЗВУР.
Кількісні показники лейкоцитів і лімфоцитів не мали істотних
відмінностей у групах обстежених новонароджених дітей із ЗВУР, тоді як
за функціональними були характерні відмінності.
Для функціональної характеристики стану імунітету обстежуваних дітей
запропоновано спосіб оцінки реакції бластної трансформації лімфоцитів у
культурі клітин із застосуванням акридинового оранжевого, на який
отримано деклараційний патент. Так, при подібних із контрольною групою
(КГ) рівнях люмінесцентних показників інтактних лімфоцитів у всіх дітей
із ЗВУР стан напруги морфогенетичної функції імунної системи в дітей із
ЗВУР по ГТ типу наближався до фізіологічної, про минулу її активність
свідчить висока сенсибілізація до тканин нервової системи. При ГП типі
ЗВУР при зниженому рівні сенсибілізації на ФГА, імунітет дітей
знаходився в напруженому стані, про що свідчить депонування КЛ? 6,0 мкм
і збільшення великих розмірних класів лімфоцитів. Діти, що відносились
до НД типу ЗВУР ближче за своїми імунологічними показниками до ГП типу,
але імунологічні зрушення у них виражені більш контрастно, зокрема,
знижена кількість малих лімфоцитів і підвищена кількість незрілих
імунобластів (КЛ? 8 ЕБ + КЛ? 10,0 мкм), включаючи також значне
збільшення сенсибілізації до тканин тимусу (Т) і нервової системи, а
саме головного мозку (ГМ). Різке зниження всіх імунологічних показників
при ДП типі ЗВУР (КЛ? 6,0 мкм, КЛ? 8 ЕБ, СD3, СD4) може вказувати на
слабкість морфогенетичних реакцій імунної системи, що вимагає пильної
уваги до таких дітей і призначення імуномодулюючої терапії.
Крім того, у дітей зі ЗВУР виявлено достовірну середню кореляцію між
відносними показниками КЛ? 10 мкм і КЛ? 8 ЕБ (r=+0,44±0,14) та між
середнім діаметром та КЛ? 8 ЕБ (r=+0,45±0,14). Позитивний зв’язок між
розміром і авідністю до ЕБ Т-лімфоцитів, на перший погляд, суперечить
даним кореляційного аналізу, отриманим в пролонгованій культурі
Т-лімфоцитів, де зв’язок між вказаними показниками був негативним.
Імовірне пояснення може бути таким. У культурі лімфоцитів, стимульованій
мітогенами і HLA-антигенами, клітини регулярно проходять мітотичний
цикл. Тому, відповідно до нього, іде біологічно виправдана динаміка
щільності СD2 структури (один сайт якої є рецептором до ЕБ) – її
зменшення на стадії бластної трансформації та проліферації, так як
функція СD2 полягає у проведенні в клітину сигналу активації, а також
адгезії до інших клітин. У периферичній крові новонароджених хворих
дітей великі лімфоцити з ознаками незрілості, бластної трансформації в
основному є наслідком зрушення лімфоцитарної формули крові вліво. В
даному випадку їх попадання в загальну рециркуляцію супроводжується
виходом з мітотичного циклу (G0-стадія) із збереженням підвищеної
щільності СD2, оскільки вони для майбутнього функціонування повинні мати
сайти активації, адгезії та міграції через високий епітелій
посткапілярних венул. Тому дану різницю авідності Т-лімфоцитів у
культурі клітин і під час рециркуляції в організмі слід обов’язково мати
на увазі при трактуванні авідного розеткового тесту.
Варіації ступеня тимомегалії не були пов’язані з клінічними
патогенетичними групами обстежених новонароджених, що підтверджує дані
інших авторів (Ткаченко Ю. П., 1996; Тяжкая А. В., 1996).
У результаті фенотипування лімфоцитів венозної крові моноклональними
антитілами (табл. 6) виявлені знижені показники кількості В-лімфоцитів
(CD20) у групі дітей із 3 ступенем прояву тимомегалії (Т3) – 17,33±2,67.
У дітей зазначеної групи відмічені найбільш значні зрушення
імунологічних показників, які полягають у зниженій частоті малих
цитоморфометричних класів лімфоцитів (КЛ? 6,0 мкм), що є результатом їх
депонування в патологічних осередках, при значній реєстрації в
периферичній крові великих лімфоцитів з ознаками незрілості, бластної
трансформації (КЛ? 10,0 мкм). Останнє є зрушенням лімфоцитарної формули
крові вліво і свідчить про велику напругу імунітету в рішенні
морфогенетичних проблем в організмі. Крім того, у дітей Т3 групи
відзначена підвищена сенсибілізація лімфоцитів на антигени тимусу, що
вказує на роль Т-лімфоцитів в морфогенезі самого тимуса і вказує на
причину даного феномену – компенсаторну реакцію цього центрального
органу імунітету на корекцію порушень морфогенезу в пренатальному
періоді.
У порівняльному аналізі частот популяцій і субпопуляцій лімфоцитів,
маркованих МКАТ, з кількістю активованих лімфоцитів позитивний зв’язок
виявлено лише між відносними показниками CD16 і КЛ? 10,0 мкм. Так, у
новонароджених в патогенетичних групах коефіцієнт кореляції складав
+0,43±0,14 (кореляція середньої сили), а в групах за проявом ступеня
тимомегалії – +0,70±0,12 (сильний кореляційний зв’язок), що відповідає
відомим морфологічним ознакам натуральних кілерів, які мають морфологію
великих гранулярних лімфоцитів. Більш якісне виявлення морфології клітин
крові стало можливим завдяки удосконаленню способу фарбування мазків
венозної крові, на який отримано деклараційний патент. Даний спосіб
паноптичного фарбування у мазках крові дозволяє більш чітко виявляти
межі та гранули імунокомпетентних клітин, у тому числі й великих
гранулярних лімфоцитів, що є необхідним для цитоморфометричних
досліджень, а запровадження його для фарбування препаратів Е-РУК – межі
лімфоцитів та приєднаних до них ЕБ, що в цілому підвищує якість та
швидкість аналізу препаратів.
Таблиця 6
Імунологічні показники лімфоцитів новонароджених з тимомегалією
Показник, % Обстежені групи новонароджених за ступенем прояву
тимомегалії
Т0 (контроль) Т1 Т2 Т3
Фенотипування лімфоцитів із використанням МКАТ CD3 35,36±
3,35 47,2±
14,35 31,64±
5,04 40,33±
18,75
CD4 31,39±
3,02 13,4±
6,55* 23,91±
4,53 37,33±
17,23
CD8 22,32±
2,94 18,6±
6,76 25,45±
3,55 21,0±
11,85
CD16 19,29±
2,66 10,0±
7,56 18,18±
4,79 15,67±
7,45
CD20 25,86±
2,95 24,0±
5,62 19,09±
4,21 17,33±
2,67*
КЛ? 6,0 мкм 28,01±
3,64 30,7±
7,99 31,33±
6,01 18,0±
5,68
КЛ? 10,0 мкм 18,16±
3,05 16,4±
6,21 19,92±
6,48 25,5±
8,85
КЛ? 8 ЕБ 25,84±
2,26 26,7±
3,27 22,95±
4,10 27,5±
4,92
Інтактні лімфоцити І 530 нм 1,57±
0,17 1,38±
0,36 1,41±
0,20 2,49±
1,02
І 640 нм 0,76±
0,14 0,52±
0,10 0,49±
0,11 0,72±
0,4
Індекс стимуляції (І 530 нм + І 640 нм) у РБТЛ на: ФГА 187,43±
24,77 174,59±
49,83 197,04±
52,39 204,5±
74,16
Т 98,99±
16,18 39,49±
9,59* 73,52±
10,84 173,63±
45,15
ГМ 152,46±
33,00 103,80±
25,39 130,11±
32,46 112,93±
20,02
Примітка: * – показники, які достовірно відрізняються від даних групи
контролю.
У короткострокових і тривалих дослідах in vitro та при обстеженні осіб
різних клінічних груп (in vivo) встановлена імуногенезна значимість
кожного з класів активованих лімфоцитів, яка допомогла сформулювати
імуногенезну гіпотезу з динаміки активованих лімфоцитів у внутрішньому
середовищі організму (рис. 2).
Відповідно до нашої гіпотези цитогенетичні та цитоморфометричні класи
активованих лімфоцитів більше відбивають проліферативні реакції клітин у
лімфоїдних органах. Так, лімфоцити після антигенної і/або мітогенної
стимуляції активуються і проліферують від 4-х до 6-10 разів у залежності
від імунологічної ситуації. При цьому в них руйнуються асоціації
акроцентриків за рахунок реорганізації хромосом ядра і зменшується
діаметр клітини, тому що за короткі інтерфази цитоплазма в
новоутворених лімфоцитах не встигає відновлюватися. Тому пул
післяпроліферативних лімфоцитів буде характеризуватися як КЛ 0+2 ААХ і
КЛ? 6,0 мкм.
Цитоморфометричний КЛ? 6,0 мкм складає високодиференційований активно
мігруючий пул клітин внутрішнього середовища. Малий розмір новоутворених
лімфоцитів біологічно доцільний: тим самим полегшуються процеси
міграції, зокрема, крізь цитоплазму клітин високого ендотелію
посткапілярних венул лімфоїдних органів. При підвищенні напруги
імунітету в периферичній крові підвищується доля великих лімфоцитів (КЛ?
10,0 мкм) з ознаками незрілості, бластної трансформації.
Цитогенетичний КЛ 0+2 ААХ об’єднує як малі, так і частину середніх,
великих лімфоцитів у зв’язку з тим, що асоціації акроцентриків
руйнуються вже через 3 мітози, а напружені (посилені) реакції імунітету
супроводжуються зрушенням лімфоцитарної формули крові вліво, тобто
виходом у рециркуляцію незрілих клітин. Вони за діаметром можуть
складати пул середніх (частково) і великих (в основному) лімфоцитів.
Високоавідні розеткові (КЛ? 8 ЕБ) відбивають стадії активації і ступінь
диференціації лімфоцитів. Люмінесцентні (І 640 нм і І 530 нм) відбивають
усі стадії імуногенезу, але в основному його початкові стадії:
активацію, бласттрансформацію і проліферацію. Пул КЛ? 8 ЕБ та І 640 нм і
І 530 нм дуже мінливий, тому що початкові стадії імуногенезу короткі за
часом. Негативний кореляційний зв’язок між КЛ? 8 ЕБ і РБТЛ
(КЛ? 10,0 мкм), люмінесцентними показниками підтверджує функціональну
природу рецептора до ЕБ і процеси інтеркаляції АО з нуклеїновими
кислотами.
Основна функція СD2 структури полягає в проведенні активуючого сигналу
в цитоплазму клітини і забезпеченні процесів адгезії і міграції
Т-лімфоцитів. Тому щільність даної структури на мембрані клітини
підвищується після антигенної і мітогенної стимуляції. Вона також
наростає у малих лімфоцитах у ході їх міграції в організмі.У
бласттрансформованих і проліферуючих лімфоцитів щільність СD2-структури
знижується, оскільки вона виконала свою функцію. Тому облік авідності
Т-лімфоцитів до ЕБ дозволить перевести метод Е-РУК із розряду кількісних
у розряд функціональних тестів, що значно підвищить його інформативну
значимість.
ВИСНОВКИ
У дисертації зроблено узагальнення зрушень частот активованих лімфоцитів
у культурі (in vitro) і в динаміці захворювання різних груп обстежених
(in vivo), що дало можливість розробити новий напрямок у імуногенезному
(патогенетичному) пдході до вивчення стану імунної системи, а саме –
аналіз інтенсивності імуногенезу та міграції активованих лімфоцитів у
внутрішньому середовищі організму.
1. Виділені й охарактеризовані відносно пролонговані залишкові ознаки
активації на циркулюючих в організмі людини лімфоцитах: частота
асоціацій акроцентричних хромосом, розмір клітин, авідність до
еритроцитів барана, інтенсивність люмінесценції з акридиновим оранжевим.
2. Розроблена і апробована група імуногенезних (патогенетичних) методів:
цитогенетичний, заснований на аналізі частоти КЛ 0+2 ААХ;
цитоморфометричний, заснований на аналізі частоти КЛ? 6,0 мкм і частини
КЛ? 10,0 мкм, а також за відносним і абсолютним індексом розмірності;
авідний розетковий із еритроцитами барана, заснований на аналізі рівня
КЛ? 8 ЕБ і відносного та абсолютного індекса авідності ;
люмінесцентний із застосуванням акридинового оранжевого, заснованого на
аналізі рівня І 640 нм.
3. Встановлена імуногенезна (патогенетична) значимість класів
активованих лімфоцитів:
цитогенетичні КЛ 0+2 ААХ характеризують усі постпроліферативні
лімфоцити;
цитоморфометричні КЛ? 6,0 мкм – постпроліферативні диференційовані
лімфоцити з високою міграційною здатністю; частину
КЛ? 10,0 мкм із ознаками бластності внаслідок напруги імунітету як
показник зрушення лімфоцитарної формули крові вліво;
авідний розетковий КЛ? 8 ЕБ – стадії активації Т-лімфоцитів до вступу їх
у проліферативну стадію;
люмінесцентний із застосуванням акридинового оранжевого, заснованого на
аналізі рівня І 640 нм – усі стадії імуногенезу, на яких спостерігаються
метаболічні зрушення нуклеїнових кислот.
4. У стимульованих ФГА лімфоцитарних культурах перші піки активованих
лімфоцитів спостерігаються через 31 годину для авідних розеткових
класів, через 55 годин – для люмінесцентних показників, РБТЛ була
максимальною через 72 години, тоді як частота КЛ? 6,0 мкм і КЛ 0+2 ААХ –
через 96 годин; у процесі культивування мали місце хвилеподібні зміни
показників як відображення гетерогенного вступу лімфоцитів у мітотичний
цикл.
5. Встановлені збіги корелятивних взаємозв’зків у культурі (in vitro) і
крові обстежених (in vivo) між частотою цитогенетичних,
цитоморфометричних і люмінесцентних класів активованих лімфоцитів.
Відсутність такого зв’язку для авідних розеткових класів свідчить про
короткостроковість наростання щільності CD2 структури в мітотичному
циклі імуногенеза (до М-стадії) і зниження її в G0-стадії при підготовці
лімфоцитів до міграції з лімфоїдних органів.
6. В експериментах з порівняльного аналізу кількісних показників частот
популяцій і субпопуляцій лімфоцитів крові, фенотипованих моноклональними
антитілами (CD3‚ CD4‚ CD8‚ CD16‚ CD20), із частотою активованих
лімфоцитів, маркованих запропонованими методами, виявлена позитивна
кореляція тільки між відносними показниками CD16 і КЛ? 10,0 мкм, що
збігається з відомими морфологічними та функціональними ознаками
натуральних кілерів, які мають морфологію великих гранулярних лімфоцитів
і здійснюють ефекторні реакції без попередніх проліферативних стадій
імуногенезу.
7. Виявлений ефект перерозподілу пулу активованих лімфоцитів із
периферичної циркуляції (кров) у патологічний осередок (плевральний
ексудат); причому кратність збільшення у 1,5-2 рази не була пов’язана з
етіологією плевритів (запального або канцерогенного), а більше відбивала
стереотипну імунологічну реакцію на ступінь порушення антиген
структурного гомеостазу; в процесі міграції цитогенетичні класи КЛ 0+2
ААХ позитивно корелювали з цитоморфометричними КЛ? 6,0 мкм і КЛ? 10,0
мкм, а також авідними розетковими КЛ? 8 ЕБ.
8. Наростання рівня зрушень показників частот активованих лімфоцитів у
динаміці лікування було найбільше вираженим у групі дітей з
алергопатологією респіраторного тракту в порівнянні з гострими
пневмоніями і гострими бронхітами. Подальша лімфопенія класів
активованих лімфоцитів серед дітей зазначених груп диктує необхідність
подовженого динамічного спостереження з використанням методів
імунокорекції.
9. Встановлено характерні зрушення рівнів класів активованих лімфоцитів
у периферичній крові та їх чутливості до ФГА, а також сенсибілізації до
антигенів тимуса і головного мозку, що пов’язано з особливостями
патогенеза різних типів затримки внутрішньоутробного розвитку
новонароджених (гіпотрофічного, гіпопластичного, диспластичного,
недиференційованого) і участю в ньому імунної системи; це дозволяє
проводити направлену імунокорекцію. У новонароджених із затримкою
внутрішньоутробного розвитку на фоні тимомегалії, особливо при Т3, має
місце напруження морфогенетичної функції імунної системи з вираженою
активацією сенсибілізованих лімфоцитів до тимуса, що може дати привід
для призначення замісної терапії гормонами тимуса.
Список опублікованих праць за темою дисертації
Фролов О. К., Омельянчик Л. О., Новосад Н. В., Федотов Є. Р., Грицаєнко
Ю. М., Лупиніс О. В., Копійка В. В. Новий напрямок патогенетичного
аналізу імунної системи ссавців // Вісник Запорізького державного
університету. Серія “Фізико-математичні науки. Біологічні науки”. –
1999. – №2. – С. 242-248.
Фролов О. К., Федотов Є. Р., Лупиніс О. В., Копійка В. В., Лагрон В. А.
Динаміка активованих лімфоцитів в пролонгованих культурах лімфоцитів,
стимульованих мітогенами та антигенами // Вісник Запорізького державного
університету. Серія “Фізико-математичні науки. Біологічні науки”. –
1999. – №2. – С. 248-254.
Фролов О. К., Федотов Є. Р., Копійка В. В. Розробка та впровадження
основних принципів патогенетичного аналізу // Вісник Запорізького
державного університету. Серія “Фізико-математичні науки. Біологічні
науки”. – 2001. – №1. – С. 218-222.
Копійка В. В. Цитоморфометричні та розеткові показники лімфоцитів крові
новонароджених дітей із відставанням розвитку // Вісник Запорізького
державного університету. Серія “Фізико-математичні науки. Біологічні
науки”. – 2003. – №1. – С. 151-156.
Копійка В. В. Динаміка імунологічних показників під час лікування
бронхолегеневої патології дітей промислового міста // Питання
біоіндикації та екології. – Запоріжжя: ЗДУ, 2004. – Вип. 9. – №1. – С.
118-127.
Фролов О. К., Федотов Є. Р., Копійка В. В., Фролова Л. О. Патогенетичний
аналіз імунної системи: основні принципи // Експериментальна та клінічна
фізіологія і біохімія. – 2004. – №3. – С. 14-21.
Пат. 48845 А Україна, МПК G01N33/48. Спосіб оцінки реакції бластної
трансформації лімфоцитів у культурі клітин: Пат. 48845 А Україна, МПК
G01N33/48 Фролов О. К. (Україна), Федотов Є. Р. (Україна), Копійка В. В.
(Україна); Запорізький державний університет. – №2002010024; Заявл.
03.01.2002; Опубл. 15.08.2002; Бюл. Пром. власн. – №8. – С. 4.146.
Пат. 62690 А Україна, МПК G01N1/28, G01N1/30. Спосіб фарбування мазків
венозної крові: Пат. 62690 А Україна, МПК G01N1/28, G01N1/30 Фролов О.
К. (Україна), Федотов Є. Р. (Україна), Копійка В. В. (Україна), Фролова
Л. О. (Україна); Запорізький державний університет. – № 2003044023;
Заявл. 30.04.2003; Опубл. 15.12.2003; Бюл. Пром. власн. – №12. – С.
4.201.
Фролов А. К., Федотов Е. Р., Лупинос О. В., Копейка В. В., Куличенко
Г.В., Грицаенко Ю. М. Функциональная характеристика иммунной системы по
уровню новообразования и миграции активированных лимфоцитов в организме
// Імунологія та алергологія. – 1999. – №3.- С. 80.
Фролов О. К., Федотов Є. Р., Копійка В. В., Куліченко Г. В. Механізми
імунологічної регуляції антиген-структурного гомеостазу на ранніх етапах
онтогенезу // Тр. 4-го Міжнародного симпозіуму “Биологические механизмы
старения”. – Харьков: Техно-АРТ, 2000. – С. 61.
Фролов А.К., Федотов Е.Р., Копейка В. В., Грицаенко Ю.М. Основные
принципы патогенетического анализа иммунной системы // Аллергология и
иммунология.-2000.- Т. 1, №2.-С. 126.
Фролов А. К., Федотов Е. Р., Копейка В. В., Фролова Л. А. Определение
уровня миграции лимфоцитов при патогенетическом анализе иммунной системы
// Імунологія та алергологія. – 2000. – №2-3. – С. 69.
Фролов О. К., Федотов Є. Р., Копійка В. В. Принципи патогенетичного
аналізу участі імунної системи в гомеостазі // Фізіологічний журнал. –
2002. – Т. 48, №2. – С. 101.
Фролов А. К., Ткаченко Ю. П., Копейка В. В., Федотов Е. Р., Леженко
Г. А. Состояние и прогноз морфогенетической функции иммунной системы у
новорожденных с задержкой внутриутробного развития // Імунологія та
алергологія. – 2002. – №2. – С. 49-50.
Фролов О. К., Ткаченко Ю. П., Леженко Г. О., Копійка В. В., Федотов Є.
Р., Лоза В. А. Оцінка морфогенетичної функції імунної системи
новонароджених із затримкою внутрішньочеревного розвитку //
Перинатологія та педіатрія. – 2003. – №4. – С. 115.
Копійка В. В., Фролов О. К., Федотов Є. Р., Фролова Л. О. Новоутворення
та міграція активованих лімфоцитів у внутрішньому середовищі організму –
новий напрямок оцінки стану імунної системи // Тр. Міжнародної наукової
конференції “Каразінські природознавчі студії”. – Харків: Харківський
національний університет ім. В. Н. Каразіна, 2004. – С. 263-264.
АНОТАЦІЯ
Копійка В. В. Характеристика активованих лімфоцитів у експерименті та
клініці. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03. 00. 09 – імунологія. – Київський національний
університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2004.
Дисертація присвячена розробці та впровадженню нового напрямку оцінки
стану імунної системи людини – аналізу інтенсивності імуногенезу та
міграції активованих лімфоцитів у внутрішньому середовищі організму. В
роботі за допомогою досліджень у короткострокових та тривалих культурах
лімфоцитів виявлено, що на циркулюючих лімфоцитах залишковими ознаками
їх попереднього імуногенезу в лімфоїдних органах є: частота асоціацій
акроцентричних хромосом, розмір клітин, авідність Т-лімфоцитів до
еритроцитів барану, інтенсивність люмінесценції лімфоцитів,
флуорохромованих акридиновим оранжевим. На основі виявлених активаційних
ознак розроблені відповідні методи: 1) цитогенетичний;
2) цитоморфометричний; 3) авідний розетковий; 4) люмінесцентний із
застосуванням акридинового оранжевого. Імуногенезна характеристика
окремих імуногенезних методів доведена кореляційними зв’язками їх
показників в культурі лімфоцитів (in vitro) і в крові обстежених (in
vivo), включно із застосуванням моноклональних антитіл до панспецифічних
(CD3, CD4, CD8, CD16, CD20) і стадіоспецифічних (CD25) мембранних
структур.
Ключові слова: імунітет, імуногенезний напрямок, цитогенетичний метод,
цитоморфометричний метод, авідний розетковий метод, люмінесцентний метод
із застосуванням акридинового оранжевого.
АННОТАЦИЯ
Копейка В. В. Характеристика активированных лимфоцитов в эксперименте и
клинике. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03. 00. 09.- иммунология. – Киевский национальный
университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2004.
Диссертация посвящена разработке и внедрению нового направления оценки
состояния иммунной системы человека – анализу интенсивности иммуногенеза
и миграции активированных лимфоцитов во внутренней среде организма. В
работе с помощью исследований в краткосрочных и длительных культурах
лимфоцитов выявлено, что на циркулирующих лимфоцитах остаточными
признаками их предшествующего иммуногенеза в лимфоидных органах
являются: частота акроцентрических хромосом, размер клеток, авидность
Т-лимфоцитов к эритроцитам барана, интенсивность люминесценции
лимфоцитов, флуорохромированных акридиновым оранжевым. На основе
выявленных активационных признаков разработаны соответствующие методы:
1) цитогенетический, который по частоте классов лимфоцитов без
ассоциаций и с двумя ассоциациями акроцентрических хромосом позволяет
охарактеризовать все постпролиферативные Т- и В-лимфоциты (в зависимости
от применяемого митогена); 2) цитоморфометрический, который по частоте
лимфоцитов с диаметром до 6,0 микрометров характеризует пул
постпролиферативных Т-, В-, О-лимфоцитов; по частоте лимфоцитов с
диаметром клетки 10,0 и более микрометров – натуральные киллеры и
недифференцированные Т- и В-лимфоциты вследствие лимфоцитарного сдвига
влево; а также по индексу размерности, интегрирующему соотношение
размерных классов лимфоцитов; 3) авидный розеточный, который по частоте
высокоавидных (присоединивших 8 и более эритроцитов барана) лимфоцитов
позволяет тестировать лимфоциты, которые прошли стадию внутри- или
внеорганной активации иммуногенеза; а также по индексу авидности,
выявляющему соотношение авидных классов
Т-лимфоцитов; 4) люминесцентный с применением акридинового оранжевого,
который по интенсивности люминесценции в спектре 640 нм позволяет
тестировать все недавно образованные лимфоциты. Иммуногенезная
характеристика отдельных иммуногенезных методов подтверждена
корреляционными связями их показателей в культуре лимфоцитов (in vitro)
и в крови обследованных (in vivo), включая применение моноклональных
антител к панспецифичным (CD3, CD4, CD8, CD16, CD20) и
стадиоспецифическим (CD25) мембранным структурам. Органная и системная
популяционная, субпопуляционная интенсивность миграции активированных
лимфоцитов тестируется по динамике направления снижения или увеличения в
крови активированных лимфоцитов. Предложенное направление и
иммуногенезные методы прошли апробацию при клинических исследованиях
(взрослые – больные с экссудативным плевритом разной этиологии, дети с
бронхолегочной патологией, новорожденные с задержкой внутриутробного
развития).
Ключевые слова: иммунитет, иммуногенезное направление, цитогенетический
метод, цитоморфометрический метод, авидный розеточный метод,
люминесцентный метод с применением акридинового оранжевого.
SUMMARY
Kopijka V. V. Characteristic of activative lymphocytes in experiment and
clinic. – Manuscript.
The dissertation on the competition for the candidate’s degree on
biological sciences, speciality 03. 00. 09 – immunology. – Kyiv National
University after T. G. Shevchenko, Kyiv, 2004.
The dissertation is devoted to elaboration and introduction of the new
trend in estimating the state of human immune system – to the analysis
of a intensity immunogenesis and to migration of the activative
lymphocytes in an inside medium of an organism. In short-term and
long-term cultures of the lymphocytes, owing to the investigations, it
was discovered that in circulating lymphocytes the residual signs of
their previous immunogenesis in lymphoid organs are: the frequency of
acrocentric chromosomes associations, the size of cells, T-lymphocytes
avidity to the sheep’s erythrocytes, luminescence intensity of
lymphocytes fluorochromed with acridine-orange. On the basis of
activative signs found during the investigations, the appropriate
methods were worked out: 1) cytogenetic; 2) cytomorphometric;
3) avidin-rosette; 4) luminescent – the usage of acridine-orange. The
immunogenesis characteristic of separate immunogenesis methods is
proved with correlative links of their indices in the culture of the
lymphocytes (in vitro) and in blood of the examined patients (in vivo),
from using monoclonal antibodies to panspecific (CD3, CD4, CD8, CD16,
CD20) and stadiospecific (CD25) membranous structures.
Key words: immunity, immunogenesis trend, cytogenetic method,
cytomorphometric method, avidin-rosette method, luminescent method with
the application of acridine-orange.
PAGE 29
%
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
