.

Молекулярні механізми утворення фібрину та фібринолізу (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
137 3622
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

______________________________________________________________

ЛУГОВСЬКОЙ Едуард Віталійович

УДК 577.112: 612.115

Молекулярні механізми утворення фібрину та фібринолізу

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є монографія.

Робота виконана у відділах молекулярної імунології і структури та
функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий консультант –

Офіційні опоненти:

Провідна установа –

Захист відбудеться 24 січня 2005 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України, за адресою: 01601 Київ, вул. Леонтовича 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України, (Київ, вул. Леонтовича 9.)

Автореферат розісланий 22 грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Кірсенко О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми дисертації. У наш час головною причиною смертності
населення в індустріально розвинених країнах є захворювання, пов’язані з
порушеннями функціонування серцево-судинної системи. Зокрема, це такі
захворювання, як інфаркт міокарду, інсульт головного мозку, емболія
легеневих артерій, які супроводжуються чи є наслідком аномальної
активації системи зсідання крові. У крові людини функціонують дві
антагоністичні системи – зсідання крові та фібриноліз. Перша приводить
до утворення тривимірної сітки фібрину, яка є каркасом будь-якого
тромбу, а друга – до розщеплення фібрину та руйнування тромбу.
Центральним білком системи зсідання крові є фібриноген. У результаті
активації системи зсідання утворюється тромбін, який відщеплює від
фібриногену два фібринопептиди А та перетворює фібриноген у фібрин
дезАА, здатний до спонтанної полімеризації. Полімеризація фібрину
здійснюється за рахунок міжмолекулярної взаємодії комплементарних сайтів
молекули – центрів полімеризації, що утворені певними амінокислотними
залишками. На сьогоднішній день вважається доведеним, що перша стадія
полімеризації – побудова протофібрил із мономерних молекул фібрину дезАА
– відбувається завдяки взаємодії пари комплементарних центрів
полімеризації “А”–“а” [Laudano A.P., et al, 1978; Everse S.J., et al,
1998]. Після досягнення критичної довжини протофібрили асоціюють
латерально за участі специфічних центрів латеральної асоціації, які були
відкриті за допомогою рентгеноструктурного аналізу [Yang Z., et al,
2000]. На цій стадії значно прискорюється відщеплення тромбіном
фібринопептидів В, і молекули фібрину дезАА в складі протофібрили
перетворюються у фібрин дезААВВ із додатковою полімеризаційною
активністю, яка забезпечується взаємодією іншої відомої пари
комплементарних центрів полімеризації – “B”–“b” [Laudano A.P., et al,
1978; Everse S.J., et al, 1998]. Однак є експериментальні дані, які
свідчать про існування додаткових комплементарних центрів полімеризації
в центральному Е- та периферичному D- доменах фібрину [Siebenist K.R.,
et al, 1990; Moskowitz K.A., et al, 1994]. Паралельно з утворенням
протофібрил та фібрил відбуваються специфічні процеси їх галуження, які
й приводять до формування тривимірної фібринової сітки [Weisel J.W.,
1986]. Полімеризація фібрину є прикладом одного з найскладніших процесів
самозбирання надмолекулярних структур у живих організмах. Тому
дослідження даного процесу має фундаментальне значення. Враховуючи те,
що фібринова сітка є структурною основою будь-якого тромбу, дослідження
механізмів утворення фібрину та його руйнування є актуальною проблемою
клінічної медицини.

Руйнування полімерного фібрину забезпечується, головним чином, завдяки
ферментативній дії плазміну. Цей фермент каталізує гідроліз фібрину до
розчинних продуктів. Серед останніх особливе місце займає D-димер, який
утворюється при розщепленні плазміном фібрину, стабілізованого фактором
XIIIa. Відомо, що концентрація D-димеру в плазмі крові суттєво
збільшується при емболії легеневих артерій, тромбозі глибоких вен,
ДВС-синдромі та багатьох інших захворювань [Rogers S., et al, 1986;
Nieuwenhuizen W., et al, 1997]. Тому кількісне визначення D-димеру в
плазмі крові є дуже важливим при діагностиці вказаних захворювань.
Кількісне визначення D-димеру в плазмі крові проводять за допомогою
різних імунохімічних методів із використанням моноклональних антитіл
(монАТ), які специфічно взаємодіють із D-димером. При цьому дані монАТ
не повинні реагувати з фібрин(оген)ом. Це можливо тільки за умови, якщо
епітопи для цих монАТ у молекулах D-димеру є експонованими, а у
фібриногені та фібрині закритими чи, навіть, відсутніми. Такі епітопи в
молекулі D-димеру є неоантигенними детермінантами, оскільки вони стають
доступними для взаємодії з монАТ тільки після плазмінового розщеплення
фібрину, стабілізованого фактором XIIIа. Тому визначення локалізації
неоантигенних детермінант є важливим для дослідження антигенної
структури D-димеру, а монАТ, епітопи для яких розташовані в таких
неоантигенних детермінантах, мають велике значення для розробки методів
кількісного визначення D-димеру.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалась за ДНТП “Біохімія тварин і людини” (шифр 2.28.4) за
бюджетними темами: 2.10.11 “Вивчення імунохімічної структури антигенів і
розвиток імунної відповіді на них” (1988-1993 рр.); 2.10.9 “Дослідження
імунохімічної структури антигенів і розвиток імунної відповіді на них.
Біохімічний та імунохімічний аналіз механізмів тромбоутворення”
(1993-1998 рр.); 2.2.1.9 (шифр 40101, номер держреєстрації 0199U000273):
“Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та
пептидів” (з 1999-2003 рр.) у відділах структури та функції білка та
молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН
України.

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження полягала в пошуку та
вивченні функціональної ролі раніше невідомих центрів полімеризації
фібрину і в створенні нової моделі формування тривимірної сітки фібрину
– каркаса тромбу. Метою було також одержання монАТ, специфічних до
головного продукту фібринолізу – D-димеру для дослідження його
антигенної структури та використання цих монАТ з метою кількісного
визначення D-димеру в плазмі крові людини.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Розробити метод кількісного визначення NH2-кінцевих амінокислотних
залишків білків для ідентифікації фібриногену, фібрину дезАА та дезААВВ.

2. Розробити метод одержання фібрину дезАА за допомогою тромбіну.

3. Дослідити природу міжмолекулярних взаємодій, які забезпечують процес
полімеризації фібринів дезАА та дезААВВ.

4. Одержати в ізольованому вигляді фрагмент В(15-118 фібрину, D-фрагмент
і D-димер фібрину.

5. Дослідити вплив фрагмента В(15-118 на процес полімеризації фібрину
дезАА та фібрину дезААВВ.

6. Дослідити комплексоутворення фрагмента В(15-118 із D-фрагментом та з
D-димером фібрину.

7. Одержати NH2-кінцеві дисульфідні вузли (N-ДСВ) фібрин(оген)у та
поліпептидні ланцюги, що складають ці фрагменти (А(1-51, В(1-118, (1-78;
А(17-51, В(15-118).

8. З метою виявлення невідомих центрів полімеризації в центральному
домені Е молекули фібрину одержати монАТ – інгібітори полімеризації
фібрину проти фрагментів N-ДСВ фібрин(оген)у. Встановити локалізацію
епітопів для цих монАТ.

9. З метою виявлення невідомих центрів полімеризації в периферичному
домені D молекули фібрину одержати монАТ – інгібітори полімеризації
фібрину проти D-димеру. Встановити локалізацію епітопів для цих монАТ.

10. На основі одержаних експериментальних результатів створити нову
модель полімеризації фібрину, яка б включала нові центри полімеризації.

11. Одержати монАТ проти кінцевого продукту фібринолізу – D-димеру
фібрину, які б специфічно взаємодіяли з D-димером без перехресної
реакції з фібриногеном та фібрином. Визначити локалізацію епітопів
(відповідно й неоантигенні детермінанти) для таких монАТ у D-димері.

12. На основі одержаних монАТ, специфічних до D-димеру, розробити метод
кількісного визначення цього фрагменту в плазмі крові людини з метою
моніторингу системи зсідання крові та фібринолізу.

Об’єкти дослідження: фібриноген, фібрин дезАА, фібрин дезААВВ, D-димер
фібрину.

Предмет дослідження: дослідження молекулярних механізмів полімеризації
фібрину та антигенної структури D-димеру фібрину.

Методи дослідження. Фібриноген виділяли методом фракційного висолювання
за допомогою Na2SO4. Фібрин дезАА одержували за розробленим нами
методом, використовуючи низькі концентраціі тромбіну, та зберігали в
0,02 М оцтовій кислоті. Фібрин дезААВВ одержували за допомогою
підвищених концентрацій тромбіну за методом Т.В. Варецької та зберігали
також у 0,02 М оцтовій кислоті. Кількісний аналіз NH2-кінцевих
амінокислот фібриногену, фібрину дезАА та фібрину дезААВВ проводили за
допомогою розробленого нами методу, який заснований на реакції Едмана.
N-ДСВ фібриногену та фібрину одержували шляхом гідролізу вихідних білків
бромціаном. Поліпептидні ланцюги N-ДСВ фібриногену (А(1-51, В(1-118,
(1-78) та фібрину (А(17-51, В(15-118, (1-78) виділяли шляхом відновлення
та карбоксиметилювання з подальшим розділенням методом рідинної
хроматографії високого тиску (HPLC). Фібринопептиди А (А(1-16) та В
(В(1-14) одержували з реакційної суміші фібриноген + тромбін за
допомогою розробленого нами методу з подальшим їх розділенням із
використанням HPLC. Ідентифікацію всіх вказаних фрагментів N-ДСВ
фібриногену та фібрину проводили автоматичним сіквенуванням за Едманом
та мас-спектрометрією. D-димер виділяли з плазмінового гідролізату
фібрину методом афінної хроматографії на фібрин-сефарозі, а D-фрагмент –
із плазмінового гідролізату фібриногену методом іонообмінної
хроматографії на CM-Sephadex G-50. Поліпептидні ланцюги (( та (, що
входять до складу D-димеру, після відновлення та карбоксилювання
D-димеру виділяли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі
(ПААГ) із додецилсульфатом натрію (ДС-Na) та подальшої елюції з гелю.
Чистоту всіх одержаних білкових препаратів визначали методом
електрофорезу в ПААГ із ДС-Na. Інгібіторну активність білкових продуктів
по відношенню до процесу полімеризації фібрину визначали за допомогою
турбідиметричного аналізу. Для одержання гібридом проводили злиття
клітин селезінки імунізованих мишей із клітинами мієломи в присутності
поліетиленгліколю. Моноклональні антитіла з культурального середовища
виділяли за допомогою афінної хроматографії на протеїн-G-сефарозі та на
фібриноген-сефарозі. Зв’язування монАТ з різними білковими продуктами
визначали за допомогою імуноферментного аналізу та імуноблотаналізу
(вестерн-блот аналізу).

Наукова новизна одержаних результатів.

Відкрито невідомі раніше центри полімеризації фібрину та створена нова
модель формування тривимірної сітки фібрину, яка є каркасом будь-якого
тромбу. Виявлено нову антигенну детермінанту в D-димері фібрину, яка
експонується в процесі фібринолізу.

2. Розроблено метод кількісного аналізу NH2-кінцевих амінокислот, який
дозволив диференціювати фібриноген, фібрини дезАА та дезААВВ.

3. Показано, що взаємодія центрів полімеризації при самозбиранні
фібрину дезАА здійснюється, головним чином, за рахунок електростатичних
і водневих взаємодій, а при самозбиранні фібрину дезААВВ додатково
включаються й гідрофобні взаємодії.

4. Вперше експериментально показано існування нековалентних взаємодій
між D-фрагментами, що свідчить про існування нековалентних взаємодій між
D-доменами в процесі побудови протофібрил фібрину.

Показано існування центру латеральної асоціації протофібрил фібрину в
NH2-кінцевій частині В(-ланцюга?фібриногену, який для свого
функціонування не потребує відщеплення фібринопептиду В.

Вперше показано, що в D-домені фібрину людини окрім центру “а” існує
інший, раніше невідомий центр полімеризації, який необхідний для
побудови протофібрил. Зазначений центр знаходиться в NH2-кінцевій
частині (-ланцюга D-домену фібрину.

Вперше показано, що у фрагменті В(134-190 (ймовірно в В(155-160)
D-димеру фібрину людини знаходиться невідома раніше антигенна
детермінанта, яка не експонована у молекулі фібриногену та з’являється в
процесі фібринолізу.

Показано, що одержані нами монАТ III-3b, специфічні до D-димеру фібрину,
можуть бути використані для кількісного визначення D-димеру в плазмі
крові людини з діагностичною метою.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Одержано
експериментальні дані, які свідчать про існування в молекулі фібрину
людини невідомих раніше центрів полімеризації, необхідних для побудови
протофібрил і для латеральної асоціації протофібрил фібрину. Ця
інформація стала основою для створення нової моделі полімеризації
фібрину та формування трьохвимірної сітки фібрину, яка є каркасом
будь-якого тромбу.

Одержано монАТ (III-3b) проти D-димеру фібрину людини, яке специфічно
взаємодіє з D-димером без перехресної реакції з фібриногеном і фібрином.
Показана принципова можливість використання монАТ III-3b для кількісного
визначення D-димеру в плазмі крові людини. МонАТ III-3b може бути
використане для створення імунотест-системи на D-димер, який має важливе
значення в діагностиці різних захворювань, що пов’язані з активацією
системи зсідання крові.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто розробив тактику
експериментальних досліджень, які були проведені для вирішення всіх
поставлених наукових задач. Брав безпосередню участь: при розробці
нового методу кількісного аналізу NH2-кінцевих амінокислот фібриногену,
фібрину дезАА та фібрину дезААВВ; в розробці нового методу одержання
фібрину дезАА за допомогою тромбіну; в пріоритетних фізико-хімічних
дослідженнях полімеризації фібриногену та двох форм фібрину; при
одержанні X-фрагмента фібриногену, який дав початок новому науковому
напрямку. Визначав інгібуючий вплив фібриногену на полімеризацію фібрину
дезАА та фібрину дезААВВ при різних значеннях іонної сили та рН. Брав
участь у проведенні всіх турбідиметричних досліджень інгібування
полімеризації фібрину за допомогою монАТ і їх Fab-фрагментів. Брав
безпосередню участь в одержанні всіх фрагментів фібриногену та фібрину,
які були використані як антигени при імунізації тварин і при локалізації
епітопів для одержаних монАТ в молекулі фібрину. Взяв активну участь при
формуванні нового напрямку в дослідженні механізмів полімеризації
фібрину за допомогою монАТ, який запропонував науковий консультант цієї
роботи, академік НАН України С.В. Комісаренко. Здобувач проводив наукове
керівництво при здійсненні запланованих експериментів, аналізував усі
одержані експериментальні дані та написав особисто майже всі вказані
публікації.

Апробація результатів дисертації. Експериментальні дані дисертації були
представлені на наступних конференціях:

Радянсько-американський симпозіум з хімії та фізики білка. – Рига,
1976, (усна доповідь).

ІVий Український біохімічний з’їзд, Дніпропетровськ. – 1982, (усна
доповідь).

VIIIth Symposium on chemistry of peptides and proteins. FRG-USSR,
Aachen. 29.09-03.10, 1991, (oral presentation session).

XIIIth International Fibrinogen Workshop, Manchester, UK., September
4-10, 1994, (oral presentation session).

XIIIth International Congress on Fibrinolysis and Thrombolysis,
Barcelona, Spain. 1996, Barcelona, Spain, (poster session).

The XVth International Fibrinogen Workshop, Cleveland, USA, August
13-15, 1998, (oral presentation session).

16th International Fibrinogen Workshop 2000, Leiden, The Netherlands,
August 23-26, 2000, (poster session).

XVIIIth Congress of The International Society on Thrombosis and
Haemostasis 2001, Paris, France, Juli 6-12, 2001, (poster session).

16th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis in
conjunction with the 17th International Fibrinogen Workshop, Munich,
Germany, September 08-13, 2002, (oral presentation session).

VIIIий Український біохімічний з’їзд, м.Чернівці, 1-3 жовтня 2002 р.,
(усна доповідь).

XIXth Congress The International Society on Thrombosis and Haemostasis,
Birmingham, UK. – July 12-18, 2003, (poster session).

18th International Congress on Thrombosis, Ljubljana, Slovenia, June
20-24, 2004, (poster session).

Публікації. За результатами, що представлені в дисертаційній роботі,
опубліковано 31 статтю у фахових виданнях та 12 тез у збірках
українських і міжнародних конференцій.

Структура дисертації. Дисертація у вигляді монографії складається з
передмови, семи глав, висновку, списку літературних джерел (670
найменувань). Монографія викладена на 13,41 обліково-видавничих аркушах
(224 сторінки). Монографія містить 1 таблицю та 41 рисунок.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В монографії висвітлено сучасні погляди на будову
молекули фібриногену, його перетворення в мономерний фібрин під дією
тромбіну, молекулярні механізми полімеризації фібрину та ферментативний
гідроліз полімерного фібрину плазміном.

Матеріали та методи досліджень. Фібриноген одержували з плазми крові
людини методом фракційного висолювання сульфатом натрію [Варецька Т.В.,
1960]. Фібрин дезАА одержували за розробленим нами оригінальним методом,
використовуючи низькі концентрації тромбіну. При цьому домішки фібрину
дезААВВ видаляли з препарату фібрину дезАА у вигляді твердої фази за
фізико-хімічних умов середовища, при яких фібрин дезАА залишався в
розчині [Lougovskoi E.V., Gogolinskaya G.K., 1999]. Фібрин дезААВВ
одержували за допомогою підвищених концентрацій тромбіну за методом
В.О. Бєліцера та Т.В. Варецької [Belitser V.A., Varetskaja T.V., 1968].
Препарати фібринів дезАА та дезААВВ зберігали в 0,02 М оцтовій кислоті.
Кількісний аналіз NH2-кінцевих амінокислот фібриногену, фібрину дезАА та
фібрину дезААВВ проводили за допомогою розробленого нами методу, який
був заснований на реакції Едмана, та включав тонкошарову хроматографію
фенілтіогідантоїнових похідних амінокислот [Луговськой Е.В., та спів.,
1975]. Активний плазмін (КФ.3.4.21.7.) одержували шляхом активації
плазміногену стрептокіназою (Varidase RN, “Lederle”, Німеччина). D-димер
виділяли з плазмінового гідролізату, прошитого фактором XIIIа (КФ
2.3.2.13) фібрину, методом афінної хроматографії на фібрин-сефарозі
[Marder V.J., 1976]. Для одержання гібридом проводили злиття клітин
селезінки імунізованих мишей із клітинами мієломи (X63-Ag8.6.5.3, “Flow
Laboratories”, Англія) в присутності поліетиленгліколю [Koehler G.,
Milstein C., 1975]. Моноклональні антитіла з культурального середовища
виділяли за допомогою афінної хроматографії на фібриноген-сефарозі та
Protein G сефарозі (“Pharmacia”, Швеція). Зв’язування монАТ із різними
білковими продуктами визначали за допомогою непрямого імуноферментного
аналізу та імуноблотаналізу [Tsang V.C.W., 1983]. Для одержання
Fаb-фрагментів монАТ II-4d та II-3b проводили гідроліз монАТ папаїном
(КФ.3.4.22.2.) (“Sigma”). З одержаних гідролізатів Fаb-фрагменти
виділяли за допомогою двох послідовних афінних хроматографій: спочатку –
на Protein G Sepharose (“Pharmacia”, Швеція), з якою зв’язувались тільки
Fc-фрагменти монАТ, а потім – на фібриноген-сефарозі. D-фрагмент
виділяли з плазмінового гідролізату фібриногену методом іонообмінної
хроматографії на CM-Sephadex G-50 (“Pharmacia”, Швеція). Ланцюги ( та
((, що входять до складу D-димеру, виділяли з препарату суміші
відновлених і карбоксиметильованих поліпептидних ланцюгів D-димеру за
допомогою електрофорезу в 10,5%-му ПААГ з 0,1% ДС-Na та подальшої елюції
їх із ПААГ за розробленою нами методикою. Для видалення ДС-Na з
одержаних таким чином препаратів (- та ((-ланцюгів проводили їх
переосадження з ацетону [Lugovskoy E.V., et al, 2002]. Субфрагмент D46
виділяли з плазмінового гідролізату D-фрагмента, а TSD-субфрагмент – із
хімотрипсинового (КФ.3.4.21.1.) гідролізату D-фрагмента за допомогою
електрофорезу в 10,5%-му ПААГ з 0,1% ДС-Na та подальшої елюції з ПААГ за
розробленою нами методикою [Lugovskoy E.V., et al, 2004]. Чистоту всіх
одержаних білків та їх фрагментів перевіряли за допомогою електрофорезу
в ПААГ з ДС-Na [Schaegger H., Von Jagow G., 1987].

Дослідження полімеризації мономерного фібрину desAABB та фібрину,
одержаного в системі фібриноген + тромбін (у присутності чи у
відсутності монАТ II-4d, монАТ II-3b, їх Fаb-фрагментів), проводили за
допомогою турбідиметричного методу [Hantgan R., 1980]. При цьому
визначали значення таких параметрів: лаг-періоду, який відповідає часу
утворення протофібрил; тангенсу кута нахилу дотичної до початкової
найбільш крутої ділянки кривої світлорозсіювання, який відповідає
швидкості латеральної асоціації протофібрил; зміни світлорозсіювання
розчину за певний час. Дослідження полімеризації мономерного фібрину
desAABB у присутності чи у відсутності монАТ та їх Fаb-фрагментів
проводили також за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії
(електронний мікроскоп H-600, “Hitachi”, Japan). Дослідження зв’язування
D-фрагмента та його імунних комплексів [D-фрагмент – монАТ] з
іммобілізованим Gly-Pro-Arg-Pro-пептидом проводили, використовуючи
Gly-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Glu-сефарозу, яка була люб’язно надана
професором Р. Дулитл (The Center for Molecular Genetics, University of
California, San Diego, USA).

Фізико-хімічна характеристика центрів полімеризації фібрину, що
послідовно утворюються при активації фібриногену тромбіном. Раніше було
відомо, що в міжмолекулярній побудові фібрину беруть участь
електростатичні та водневі зв’язки. У попередній роботі ми припустили,
що в цьому процесі мають брати участь і гідрофобні взаємодії. Тоді нам
вперше вдалося довести це при дослідженні мутності згустків, що
сформувалися в результаті полімеризації фібрину дезААВВ у присутності
різних концентрацій NaCl (від 0,15 М до 2,0 М) та інших солей. У даній
роботі нами були продовжені ці дослідження. Була виміряна швидкість
полімеризації фібрину дезААВВ у широкому діапазоні концентрацій NaCl та
інших солей. Виявилось, що різні солі, які володіють ефектом
висолювання, при збільшенні їх концентрації спочатку гальмують
полімеризацію, а при досягненні певної концентрації починають
прискорювати полімеризаційний процес (рис. 1). При цьому сила
прискорюючої дії солі повністю відповідала силі її висолюючої дії, яка
завжди спрямована на неполярні речовини, в даному випадку – на
гідрофобні бокові групи амінокислотних залишків фібрину. Таким чином,
було підтверджено наш попередній висновок, що прискорюючий ефект різних
солей при полімеризації фібрину дезААВВ обумовлений міжмолекулярними
взаємодіями гідрофобних бічних груп амінокислотних залишків.

Далі нами була досліджена фізико-хімічна природа та механізм
функціонування центрів полімеризації фібрину, що формуються після
відщеплення фібринопептидів А та В. Для цього необхідно було мати два
препарати фібрину: desAA та desAABB. Першою нашою задачею було навчитися
ідентифікувати фібриноген і ці форми фібрину. Для цього ми розробили
метод кількісного визначення NH2-кінцевих амінокислотних залишків
фібриногену та фібрину, який свого часу був пріоритетним у Радянському
Союзі. Метод був заснований на реакції Едмана та включав тонкошарову
хроматографію фенілтіогідантоїнових похідних NH2-кінцевих амінокислотних
залишків із подальшою їх елюцією та детекцією при 269 нм. При
послідовному перетворенні фібриногену у фібрин дезАА та далі – у фібрин
дезААВВ – набори NH2-кінцевих амінокислотних залишків змінюються таким
чином: 2Ala/2Tyr ( 2Gly/2Tyr ( 4Gly/2Tyr.

Препарат мономерного фібрину дезААВВ дотепер одержували за методом
Т.В.Варецької. Препарат фібрину дезАА в лабораторній практиці зазвичай
отримували з застосуванням ферментів із отрути змій, які відщеплюють
специфічно тільки фібринопептиди А. Проте як цей процес, так і сам
кінцевий препарат не є фізіологічними. Нам вдалось одержати фібрин дезАА
оригінальним способом за допомогою тромбіну. Для цього за методом
Дж.Шейнова ми одержали спочатку при знижених концентраціях тромбіну
фібрин дезАА з 5% – 10% домішкою фібрину дезААВВ. Далі ми провели
порівняльний аналіз полімеризації цього препарату фібрину дезАА з
домішкою фібрину дезААВВ і чистого препарату фібрину дезААВВ при різних
значеннях іонної сили та рН (рис. 2). Було знайдено, що, якщо перевести
фібрин дезАА з домішкою дезААВВ із кислого середовища в буфер із рН 6,2
та іонною силою 0,4, то в тверду фазу переходять лише домішки фібрину
дезААВВ, тоді як фібрин дезАА повністю залишається в розчині. Після
центрифугування було одержано практично 100%-ий препарат фібрину дезАА,
який за результатами аналізу NH2-кінцевих амінокислотних залишків
(2Gly/2Tyr) та за даними електрофорезу з (-меркаптоетанолом ?був
позбавлений фібринопептидів А, але зберігав фібринопептиди В.

З’явилася можливість прямого порівняння полімеризації двох тромбінових
препаратів фібрину з метою з’ясування природи та ролі центрів
полімеризації, які експонуються після відщеплення фібринопептидів А та
В. Порівняльне дослідження полімеризації фібрину desAA та desAABB при
різних концентраціях сечовини, різних значеннях іонної сили та різних рН
показало, що полімеризація фібрину desAA набагато сильніше залежить від
цих параметрів, тобто в міжмолекулярній побудові фібрину desAA більшу
роль виконують іонні та водневі взаємодії в порівнянні з фібрином
desAABB. Таким чином, після відщеплення від фібриногену тромбіном
фібринопептидів А експонуються центри полімеризації, які забезпечують, в
основному, електростатичні та водневі взаємодії між молекулами фібрину.
Далі було знайдено, що чутливість фібрину desAA до активуючого ефекту
солей виражена значно слабше, ніж для desAABB. Концентрації NaСl, що
підвищують мутність гелів та прискорюють полімеризацію, у випадку
фібрину desAA набагато вищі порівняно з фібрином desAABB (рис. 3). Було
зроблено висновок, що міжмолекулярні гідрофобні взаємодії при
полімеризації фібрину значно посилюються після відщеплення
фібринопептидів В.

Нові центри полімеризації у D- та Е-доменах фібрину. До недавнього часу
вважалося, що полімеризація фібрину здійснюється двома парами
комплементарних центрів “А”-“а” та “B”-“b”, які забезпечують
міжмолекулярні контакти центрального Е- та периферичного D-доменів
фібрину. Проте є дані, які свідчать на користь існування й інших пар
комлементарних центрів, що забезпечують процес полімеризації. Наприклад,
пептиди GPRР та GНRP, які імітують центри “А” та “В” в Е-домені фібрину,
зв’язуються з комплементарними їм центрами “a” та “b” в D-домені фібрину
з афінністю 1·104 М-1, тоді як міжмолекулярні взаємодії навіть фібрину
дезАА здійснюються з набагато більшою афінністю – 1·107 М-1. Цей факт
вказує на наявність взаємодій і інших пар центрів, що приводять до
такого збільшення спорідненості між молекулами фібрину. Один із таких
центрів, за багатьма даними, може знаходитись у фрагменті фібрину
В(15-53, а комплементарний йому центр – у D-домені фібрину.

Нашою основною концепцією, яка сформувалася після аналізу багатьох
літературних даних, було те, що кожна стадія полімеризації фібрину
здійснюється не однією парою комплементарних центрів, а, як мінімум,
двома парами. Під центром полімеризації ми розуміємо групу
амінокислотних залишків, розташованих послідовно в поліпептидному
ланцюзі молекули фібрину або зближених у просторі за рахунок третинної
структури, які беруть участь у міжмолекулярному зв’язуванні фібрину.

Для пошуку нових центрів полімеризації в D-домені фібрину, при
використанні одержаного нами D-димеру як антигену Колесніковою І.М. із
співр. були одержані 16 гібридом, що продукували монАТ різної
специфічності до D-димеру. З них були обрані дві, які синтезували
антитіла, здатні специфічно гальмувати процес полімеризації фібрину.
Турбідиметричний аналіз показав, що монАТ з умовною назвою II-4d та його
Fab-фрагмент інгібують полімеризацію на 100% при еквімолярному
співвідношенні їх до фібрину. Друге антитіло II-3b інгібує полімеризацію
фібрину на 60%, а його Fab-фрагмент – на 100% при тому ж молярному
співвідношенні до фібрину. Таке інгібування полімеризації означає, що
епітопи для даних антитіл в молекулі фібрину, з якими зв’язуються монАТ
та їх Fab-фрагменти, розташовані поряд або безпосередньо в центрах
полімеризації фібрину. Для того, щоб з’ясувати, яку саме стадію
полімеризації інгібують дані антитіла, були проведені
електронно-мікроскопічні дослідження В.І.Чернишовим зі співр. Ці
дослідження показали, що, коли фібрин полімеризувався у відсутності
антитіл, спостерігалося утворення спочатку типових протофібрил і далі –
поперечно-посмугованих фібрил. Коли ж у полімеризаційному середовищі
були присутні антитіла II-4d або їх Fab-фрагменти, фібрин залишався в
мономерному стані. У присутності Fab-фрагментів антитіл II-3b фібрин
також залишався лише в мономерному стані. Таким чином, було зроблено
висновок, що антитіла II-4d та II-3b інгібують стадію утворення
протофібрил із молекул мономерного фібрину.

Можна було припустити, що монАТ II-4d, II-3b та їх Fab-фрагменти при
приєднанні до молекули фібрину порушують функціональну активність
відомого центру “a” в D-домені фібрину, який, як відомо, разом із
комплементарним йому центром “А” в Е-домені бере участь у побудові
протофібрил. Для перевірки цього припущення ми дослідили здатність
центру “a” D-фрагмента, що знаходився в складі імунного комплексу з
монАТ-інгібіторами, зв’язуватися з імобілізованим пептидом
Глі-Про-Арг-Про, який імітує комплементарний центр “А”. Виявилося, що як
сам D-фрагмент, так і його імунні комплекси з монАТ-інгібіторами
зберігали здатність приєднуватися до імобілізованого пептиду (рис. 4).
Таким чином, центр полімеризації, який блокується
антитілами-інгібіторами та їх Fab-фрагментами, не співпадає з відомим
центром “a”.

Конкурентний імуноферментний аналіз показав, що епітопи для обох
антитіл-інгібіторів не співпадають один з одним. Результати, одержані за
допомогою імуноблотаналізу, показали, що епітопи для монАТ II-4d та
II-3b знаходяться в ((?ланцюгу?D-димера. Обидва антитіла реагували лише
з одним продуктом хімотрипсинового гідролізату D-фрагмента з
молекулярною масою приблизно 28 кДа. Даний продукт відповідає
TSD-субфрагменту, який, як відомо, включає N-кінцеві частини (-, ?-?та
?-ланцюгів D-фрагмента [Medved L.V., et al, 1982]. Після відновлення
(-меркаптоетанолом?TSD-субфрагмента обидва антитіла реагували лише з
поліпептидним ланцюгом, який мав молекулярну масу 16 кДа (рис. 5). З
урахуванням попередніх імуноблотів і будови TSD-субфрагмента цей ланцюг
є NН2-кінцевим фрагментом (-ланцюга?D-фрагмента.

Таким чином, можна стверджувати, що епітопи для монАТ II-4d та II-3b, а
отже, і невідомий центр полімеризації знаходяться в NH2-кінцевій частині
(-ланцюга?D-домену фібрину. Цей центр (назвемо його умовно “с”) не
співпадає з відомим центром полімеризації “a”, що знаходиться в
СООН-кінцевій частині (-ланцюга D-домену. Це означає, що побудова
протофібрил фібрину здійснюється не тільки за рахунок міжмолекулярної
взаємодії відомої пари центрів “A”-“a”, але й за рахунок, як мінімум, ще
однієї пари комплементарних центрів. Центр, комплементарний центру “с” у
D-домені фібрину, слід було шукати в Е-домені фібрину. Висока міжвидова
гомологія та експериментальні результати, які були одержані іншими
авторами, дозволяють нам припустити, що такий центр (назвемо його “С”)
знаходиться в амінокислотній послідовності В(15-53?фібрину, а саме у
фрагментах В(27-31 та/або В(41-45 (рис. 6).

Ми одержали три монАТ до N-ДСВ фібрину, епітопи для яких розташовані у
фрагменті В(15-53. Ці антитіла разом із їх Fab-фрагментами на 90-100%
інгібують полімеризацію фібрину. Попередній аналіз експериментальних
даних дозволяє сподіватися, що після локалізації епітопів для цих монАТ
за допомогою синтетичних пептидів ми зможемо локалізувати центр “С”.

Раніше нами було досліджена інгібіторна активність фрагмента В(15-118,
який був виділений нами з N-ДСВ фібрину і містив фрагмент В(15-53. Було
показано, що при 12оС навіть десятикратний молярний надлишок В(15-118
відносно фібрину інгібує його полімеризацію. Логічно було б припустити,
що цей фрагмент, який представляє частину Е-фрагмента та містить центр
полімеризації “В” (В(15-17), буде з’єднуватися з D-фрагментом, і що в
цьому з’єднані буде брати участь, як мінімум, пара комплементарних
центрів “В” та “b”. Утворення такого комплексу було показано нами за
допомогою нативного електрофорезу. Гель-фільтрація (HPLC) комплексу
В(15-118 із D-фрагментом при температурі 12оС показала, що профіль
елюції містив два піки (рис. 7).

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020