.

Ранній ембріональний розвиток тварин in vivo і in vitro та біотехнологічні фактори його регуляції (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
192 5895
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ

БІЛОЦЕРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

МАДІЧ Алла Всеволодівна

УДК 636.082.22/28:57.08

Ранній ембріональний розвиток тварин in vivo і in vitro та
біотехнологічні фактори його регуляції

03.00.20.-біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

м. Біла Церква – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біології тварин Української академії
аграрних наук, м.Львів

Науковий консультант: – доктор сільськогосподарських наук, старший
науковий cпівробітник

Шаловило Степан
Григорович, головний науковий співробітник

Інституту біології тварин
УААН

Офіційні опоненти: – доктор сільськогосподарських наук,
професор, член-кореспондент

УААН, Безуглий Микола
Дмитрович, перший заступник міністра

аграрної політики України

– доктор
сільськогосподарських наук, професор

Шеремета Віктор
Іванович, директор навчально-наукового центру,

завідувач кафедри
генетики тварин і біотехнології Національного

аграрного університету
Кабінету Міністрів України

– доктор біологічних наук,
професор

Смолянінов Борис
Вікторович, завідувач кафедри фізіології і біохімії

сільськогосподарських
тварин Одеського державного аграрного

університету МАПУ

Провідна установа: Державний науково – дослідний контрольний
інститут ветеринарних

препаратів та кормових
добавок МАПУ, лабораторія контролю

препаратів при незаразних
захворюваннях, м.Львів

Захист дисертації відбудеться 20.05. 2004 р. о 14-30 год. на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д27.821.01 у Білоцерківському державному
аграрному університеті МАПУ за адресою: 09100, м. Біла Церква, Соборна
площа 8/1, в ауд. 14

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Білоцерківського
державного аграрного університету МАПУ.

Автореферат розісланий 16.04.2004 року.

Вчений секретар cпеціалізованої вченої ради

кандидат ветеринарних наук, доцент
Малина В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема розробки і удосконалення методів, які
забезпечують скерування клітинних процесів та механізмів формування
цілісних систем, просторових структур і морфогенезу в ланцюгу
ембріонального розвитку від яйцеклітини до сформованого плоду, лишається
актуальною для досліджень з біології раннього розвитку, генетики тварин,
клітинної і генної інженерії. Їх застосування вже сьогодні дозволяє
одержувати тварин бажаних генотипів, прискорено розмножувати потомство
генетично цінних особин, відтворювати генотипові копії бугаїв-плідників
та корів-рекордисток (Завадовський М.М., 1961; Зубець М.В. та інш.,
1995, 1997, 2000; Буркат В.П., 1997, 1998; Безуглий М.Д., 1995, 1997;
Глазко О.Є., 1995; Кузнєцов В.Є. та інш. 1997, 1998, 1999; Willadsen
S.M., 1989, 1999; Gandolfi F. et al, 1997, 2000, 2003; Bavister B. et
al, 1997, 2000; Betteridge K.J., 2000; Greve T. et al. 1998, 2002; Robl
J.M., 2003). Нагромаджені сучасні знання свідчать, що без розуміння
складних біологічних процесів оо- та ембріогенезу, внутрішніх факторів
системи ембріон-материнський організм не можна створити загальні моделі
їх формування, а отже і розробити сучасні біотехнології для регуляції
розвитку і підтримки оптимального функціонування біологічних об‘єктів
(Мартиненко Н.А., 1971; Квасницкий А.В.и др., 1988; Эрнст Л.К.и др.,
1982, 1992; Сергеев Н.И., 1990, 1992, 1995; Осташко Ф.І., 1992; Мадисон
В.В., 1998; Шеремета В.І., 1997; Шаловило С.Г., 1999; Смолянінов Б.В.,
1995, 2000; Гузєватий О.Є., 2000; Heyman Y., 1995, 1998; Parrish J.J.,
1986, 1989, 2001; Fukui Y. et al., 1989, 1990; Brem G. 1995, 2000; Evans
A.C. et al, 2000; Wierzchos E. 2002).

Актуальним є використання різних видів тварин як моделей
ембріогенетичних досліджень, що зумовлює одержання нових теоретичних
даних з вивчення закономірностей та видових особливостей оо- і
ембріогенезу ссавців. Особливого значення набуває застосування ряду
методів клітинної інженерії у біотехнології відтворення і селекції
великої рогатої худоби і овець, яке передбачає суттєвий комерційний
інтерес. У цьому аспекті створення оптимальних умов для розуміння
механізмів дозрівання, запліднення ооцитів, розвитку химерних
ембріональних конструкцій і ранніх ембріонів тварин з групи бластомерів
з використанням фідерних культур ембріонального і маткового походження в
умовах in vitro є надзвичайно важливим.

Через новизну проблеми та недосконалість окремих методів, їх
застосування обмежується в конкретних моделях. До них відносять
блокування мітотичного дроблення ембріонів на ранніх стадіях, низьку
ефективність приживлення і розвитку половинок, чверток ембріонів та
химерних конструкцій у тварин-реципієнтів, чутливість генетичного
апарату ооцитів та ембріонів тварин до дестабілізуючої дії факторів,
пов‘язаних з культивуванням у синтетичних середовищах,
мікроманіпуляціями, заморожуванням та трансплантацією. Загальним для
всіх методів є пошук оптимальних умов для розвитку ооцитів і ембріонів
тварин in vivo та in vitro під впливом біотехнологічних факторів та
шляхів їх удосконалення, оскільки кінцевий етап і логічне завершення
досліджень – одержання нащадків з бажаними фенотипічними ознаками і
генотипом. Мінливість ефективності використання ембріобіотехнологічних
методів для практичних цілей тваринництва вимагає подальших розробок.

Зв‘язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота
виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Львівського
філіалу Інституту розведення і генетики тварин УААН за завданнями:
“Розробити нові біотехнологічні методи прискореного розмноження
високоцінних сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації
UA01001476Р); “Вдосконалити і впровадити системи застосування
молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних
методів у селекції сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації
0196U016325); та Інституту біології тварин УААН за завданнями: “Вивчити
молекулярні механізми регуляції обмінних процесів у репродуктивних
органах самиць, ооцитах і ембріонах та розробити способи стимуляції
процесів відтворення у корів і свиноматок. Удосконалити склад
інкубаційних середовищ для запліднення in vitro” (№ держреєстрації
0198U009013); “Розробити методи стимуляції ембріонального розвитку
тварин із застосуванням клон-технологій” (№ держреєстрації 0198U003431)
упродовж 1991-2002 рр.; підтримана договорами з Інститутом розведення і
генетики тварин УААН та Харківським біотехнологічним центром УААН.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було теоретичне та
експериментальне обґрунтування впливу ендо- і екзогенних факторів на
процеси оо- та ембріогенезу модельних і сільськогосподарських тварин в
умовах in vivo i in vitro, розробка й удосконалення біотехнологічних
способів їх регуляції, одержання життєздатних ембріональних форм і
нащадків з ознаками клону, химер та від запліднення in vitro.

Для реалізації мети досліджень були поставлені наступні завдання:

1. Визначити й охарактеризувати видові морфологічні особливості
доімплантаційних ембріонів норок і песців, механізми ранньої клітинної
диференціації та розвитку.

2. Розробити морфологічну шкалу оцінки доімплантаційних ембріонів норок.

3. Встановити фактори ембріонального оточення, які впливають на
доімплантаційний розвиток хутрових тварин.

4. Розробити спосіб гормональної корекції овуляторної функції неплідних
норок. Дослідити у них формування ембріонально- маткового сигналу на
ранніх стадіях ембріогенезу під дією ендо- і екзогенних гормонів.

5. Оптимізувати існуючі і розробити нові методичні підходи створення
агрегаційних та ін‘єкційних химер норок і корів з доімплантаційних
ембріонів синхронних і асинхронних стадій розвитку, з використанням
ефекту електростимуляції.

6. Удосконалити мікроманіпуляційний метод одержання ідентичних тварин з
обмеженою кількістю у клоні. Встановити ефективність використання
фідерних клітин ембріонального і маткового походження для регуляції
ембріонального розвитку половинок і чверток розморожених ембріонів
корів.

7. Підібрати оптимальні умови для одержання первинної культури фідерних
клітин яйцепроводів і матки з достатнім проліферативним ростом і
функціональною активністю, дослідити її вплив на дозрівання ооцитів
корів in vitro.

8. Встановити й охарактеризувати відмінності впливу різних біологічно-
активних речовин на морфологічні показники якості ооцитів хутрових і
сільськогосподарських тварин. Удосконалити середовище для дозрівання
ооцитів корів і овець in vitro.

9. Удосконалити метод дозрівання і запліднення in vitrо ооцитів овець.
Одержати трансферабельні ембріони та нащадків від трансплантації
розвинутих in vitro ембріонів.

Об‘єкт дослідження: процеси ооцитарного та ембріонального розвитку
тварин в умовах in vivo i in vitro.

Предмет дослідження: ооцити та ембріони норок, песців, шиншил, овець,
корів, репродуктивні органи самиць, біотехнологічні фактори.

Методи дослідження: зоотехнічні; ветеринарні; морфологічні;
гістоморфометричні; фізико-біохімічні; біотехнологічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розглянутий комплексний
вплив біотехнологічних факторів і методів на доімплантаційний розвиток
ембріонів тварин за умов in vivo і in vitro. Доведено доцільність
застосування хутрових тварин як лабораторних моделей для
ембріогенетичних досліджень. Розроблено і запропоновано морфологічну
шкалу оцінки ембріонів норок доімплантаційних стадій, вивчено видові
особливості їх ембріонального розвитку, зокрема регуляторні механізми
первинної диференціації бластомерів; запропоновано застосування на
норках методу оцінки якості сперми за інтенсивністю її дихання.
Встановлено біологічний годинник ембріонального розвитку песців.
Удосконалено метод хірургічного вимивання ранніх ембріонів норок та
песців попередньо визначених стадій розвитку від евтаназованих та живих
донорів з використанням загальної анестезії, одержано приплід після
хірургічної трансплантації ембріонів норок. Розроблено спосіб
гормональної корекції овуляторної функції норок. Дістали подальший
розвиток дослідження морфофункціонального стану матки тварин з різною
ембріопродуктивністю на ранніх стадіях ембріонального розвитку. Вперше
встановлено, що присутні у репродуктивних органах норок специфічні білки
мають мітогенну дію, регулюють ембріональний розвиток і диференціацію
бластомерів.

Удосконалено методи реконструкції ембріональних клітин норок і корів.
Вперше одержано химерні зародки норок з ембріонів різного віку і
нащадки-мозаїки від їх пересадки. Після застосування методу
електростимуляції на химерних ембріонах корів і їх трансплантації
одержано телята. Удосконалений і дістав подальший розвиток метод
мікроманіпуляцій для одержання ембріональних клонів трансферабельних
стадій з чверток деконсервованих ембріонів корів. Внаслідок цього
розроблені теоретичні і практичні підходи для відновлення ембріогенезу з
групи бластомерів, одержано телят.

Розроблено науково-обґрунтовані підходи до регуляції інтенсивності росту
фідерних ізольованих епітеліальних клітин яйцепроводів та ендометрію
корів, що здатні підтримувати ооцитарний і ембріональний розвиток поза
організмом, гормональними препаратами і ростовими факторами. Одержано
фідерну клітинну культуру зі стійким проліферативним ростом і збільшено
кількість морфологічно якісних, здатних до подальшого розвитку ооцитів
та половинок ембріонів корів.

Розроблено, запропоновано і експериментально перевірено ефективне
“Середовище для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro”, яке
забезпечує одержання морфологічно якісних, дозрілих ооцитів, здатних
запліднитися і розвинутися в ембріони трансферабельних стадій поза
організмом. Наукова новизна підтверджена рішенням про видачу
деклараційного патенту. Вперше в Україні одержані ембріони овець від
дозрівання і запліднення ооцитів in vitro та життєздатний приплід від
трансплантації таких ембріонів.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено морфологічну шкалу
оцінки доімплантаційних ембріонів норок та спосіб зменшення кількості
неплідних самиць під час гону, який забезпечує одержання додаткового
приплоду від норок з порушеннями репродуктивної функції. Удосконалено
мікроманіпуляційні методи бісекції, агрегації і мікроін‘єкції
ембріональних клітин хутрових і сільськогосподарських тварин і
оптимізовано умови їх розвитку in vitro, що дозволяє збільшити кількість
морфологічно якісних і трансферабельних ембріонів з половинок і чверток
деконсервованих зародків корів і зумовлює одержання груп ідентичних
телят. Розроблено високоефективне “Середовище для дозрівання in vitro
ооцитів корів і овець”, яке забезпечує одержання дозрілих поза
організмом ооцитів від живих тварин або після їх забою. Матеріали
дисертаційної роботи увійшли до методичних рекомендацій “Інтенсифікація
хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів
відтворення”, затверджених НТР Головного управління сільського
господарства і продовольства Львівської облдержадміністрації 15 жовтня
2003 року (протокол №2).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблена дослідницька
програма; проведені більшість досліджень; огляд і аналіз першоджерел
літератури; розроблено теоретичні обґрунтування щодо механізмів
регуляції оо- і ембріогенезу у ссавців; виконано фотографії. Зроблено
статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опубліковані
результати досліджень. За участю наукового консультанта розроблено схему
й методику виконання досліджень з використанням сучасних
біотехнологічних методів. Лапароскопічне одержання ооцитів овець
проводили спільно зі співробітниками кафедри розведення овець і кіз під
керівництвом проф. Е.Вешхося (Краківська аграрна академія ім. Х.
Коллонтая, Польща); трансплантацію ембріонів корів- за участю науковців
лабораторії біотехнології відтворення Інституту біології тварин УААН;
загальну анестезія і хірургію хутрових тварин – за участю спеціалістів
кафедри загальної хірургії Львівської національної академії ветеринарної
медицини ім.С.З.Гжицького, за що автор висловлює їм щиру подяку. Із
спільних наукових дослідів і публікацій дисертант використав, за згодою
співавторів, лише свою частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації і
результати досліджень доповідалися на міжнародних та республіканських
науково-практичних конференціях і з‘їздах: The 1-st Polish-Ukrainian
Scientific Conference ”Animal Sciences in the XXI centure” (Краків,
Польща, 2001), The 4-th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell
activation: biological signals and their target enzymes“ (Вроцлав,
Польща, 2002), Міжнародна конференція присвячена пам‘яті професора
І.В.Шостаковської (Львів, 2002), “Біотехнологія в розведенні і
відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин” (Харків,
1993), “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні
сільськогосподарських тварин” (Асканія-Нова, 1997), “Сучасні проблеми
ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва
(Львів, 1997), “Селекційно-генетичні та біотехнологічні методи
консолідації новостворених порід і типів сільськогосподарських тварин”
(Київ, 1999), “Проблеми неінфекційної патології тварин” (Біла Церква,
1998), “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних
розробок у генетико –селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998), “Проблеми
ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (Київ, 1999),
“Наукові основи сучасних технологій виробництва продукції тваринництва”
(Харків 2003), обговорювалися на засіданнях вченої ради та
координаційних нарадах Інституту розведення і генетики УААН
(1991-1998рр), Інституту біології тварин УААН (1999-2002), наукових
семінарах співробітників Інституту біології тварин УААН.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 43 наукові роботи, з яких
14 одноосібних; зокрема 25 робіт у наукових фахових виданнях, 3 – у
наукових журналах і збірниках, 12 – у матеріалах і тезах конференцій та
симпозіумів, 1 довідник, 1 рекомендації, одержано 1 патент на винахід.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, 4 розділів,
висновків, практичних пропозицій, 7 додатків, списку літературних
джерел, який охоплює 530 найменувань, з яких 367 іноземних. Текст
дисертації викладений на 356 сторінках, включає 48 рисунків і 37
таблиць.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальна частина роботи виконана на норках, песцях, шиншилах,
великій рогатій худобі, вівцях; 1137 ооцитах і 272 доімплантаційних
ембріонах в умовах господарств „Гряда” Жовківського, „Бартатівське”
Городоцького, „Галичхутро” Сокальського, селянської спілки “Кам‘янка”
Кам’янко-Бузького районів Львівської області та лабораторії клітинної
інженерії Львівського філіалу Інституту розведення і генетики тварин
УААН та Інституту біології тварин УААН. Дослідження проводили за
загальною схемою (рис.1).

Перевірку самців норок на якість сперми здійснювали взяттям мазків з
піхви самиць та визначенням інтенсивності дихання сперміїв за
знебарвленням метиленової синьки. Самиць норок контрастних генотипів
живою масою 0,9-1,1 кг, песців 5,5-6,5 кг, шиншил 450 г використовували
як донорів ооцитів і ембріонів під час природного гону. Кількість
послідовних мітотичних циклів у зиготах норок визначали відрахуванням
годин дроблення (16-20 годин) від дня осіменіння в 2-у охоту, песців –
емпірично. Одержання ранніх ембріонів норок здійснювали на 3-5-й день,
морул – на 6-7-й, бластоцист та реекспандованих бластоцист- на 8-9-й
день (Максимовский Л.Ф., 1994), песців після 1-го спаровування на 8-11-й
день. Вимивання ембріонів виконували за методом Л.В.Козикової (1988);
М.Манка (1990) фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) Дюльбекко з 0,4%
сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (БСА) або 10% фетальної
сироватки телят (ФСТ) та 40 мкг/мл гентаміцину. Після промивання
репродуктивні органи евтаназованих тварин вимірювали за розмірами,
яєчники аналізували на наявність жовтих тіл, підраховували кількість
фолікулів, ембріони оцінювали морфологічно, класифікували за стадіями
розвитку. Зародки норок інтактними або після агрегації половинок
хірургічно трансплантували у верхівки рогів маток білатерально, по 3-4
ембріони, реципієнтам контрастного генотипу. Належність приплоду до того
чи інакшого генотипу визначали за забарвленням хутра.

Для стимуляції репродуктивної функції норок застосовували комплексний
гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок”
В.Ю.Шавкуна, О.Б.Андрушка (ДП 44006А №7А01К67/02), який містив
гонадотропний гормон, естрадіол-17(, вітаміни, амінокислоти, донатори
SH-груп, мікроелементи та енергетичні субстанції, у сумарній дозі 24 ІО
гонадотропіну (ГСЖК) на 1 кг живої маси (3 ін‘єкції в дозі 8 ІО через 1
добу): самицям з ознаками “тихої” охоти на 5, 6 та 7-й дні після не
результативних спроб до спаровування, а тим, що не проявили ознак
еструсу – в кінці періоду гону. Тварини, які прийшли в спонтанний гін,
слугували як контроль. На 6-й день після коїтусу здійснювали контрольний
забій норок з кожної групи.

В яєчниках визначали кількість жовтих тіл та фолікулів, оцінювали
морфологічну якість і стадію розвитку ооцитів та ембріонів, виготовляли
гістологічні зрізи з верхівок рогів матки (3 мм від істмусу),
забарвлювали гематоксиліном та еозином (Афанасьєв Ю.И. и др.1967). За
рештою тварин спостерігали до щеніння, аналізували за кількістю
нащадків.

Концентрацію білка в лізатах тканин яєчників, яйцепроводів, рогів маток
норок і шиншил та у вимивному середовищі з них на ранніх стадіях оо- і
ембріогенезу (природний гін) визначали за G.Peterson (1977), розділяли
на фракції в блоках градієнтного (5-17%) поліамідакрилового гелю (ПААГ)
за U.Laemmli (1970); O.Lowry et al. (1995) і зафарбовували сріблом (Gorg
A. et al, 1985), порівнювали з білковим спектром сироватки крові.
Кількість окремих білків на електрофореграмах визначали за допомогою
комп‘ютерної програми „Image Tool”. Про молекулярну масу (Мм) окремих
білкових фракцій судили за даними електрофорезу з використанням 9
маркерів з Мм 6,5 кДа; 14,4; 21,5; 31; 45; 66; 97; 116; 200 кДа (“Broad
Range Markers”, США). Екстракцію ліпідів проводили сумішшю
хлороформ-метанол (1:1) (Штоль М.Л., 1970). Ліпіди розподіляли на класи
методом тонкошарової хроматографії. Кількість нейтральних ліпідів
визначали біхроматним методом, фосфоліпідів – за вмістом ліпідного
фосфору реакцією з 10%-им розчином фосфомолібденової кислоти в етанолі.

Мікроманіпуляції з ембріонами норок і корів виконували за допомогою
механічних маніпуляторів, мікроін’єкторів („Leitz”, Німеччина;
„Біоприлад”, Росія), мікроскопів МБС-10 та МБИ-15, відслідковували на
моніторі. Химерні ембріони норок моделювали з груп бластомерів, що
належали ембріонам контрастних генотипів синхронних і асинхронних стадій
розвитку (Манк М., 1991). Їх хірургічно трансплантували
самицям-реципієнтам і одержували приплід. Химерні ембріони корів
одержували мікроін’єкцію групи бластомерів з половинок розморожених 6-ти
денних морул симентальської породи у бластопорожнину нативних ембріонів
чорно-рябої породи (Кузнєцов В.Є.., 1991). Внутрізональну адгезію
мембран бластомерів в химерних ембріонах дослідних груп здійснювали
електричним імпульсом (одним або декількома) напругою 15, 20, 25 В з
експозицією дії 160-200 мкс у 5%-му розчині сахарози (Лісін В.І., 1997;
2000). Для цього використовували прилад для електрозлиття („Біоприлад”,
Росія) і два платинові електроди 30 і 60 мкм (Шигімага В.О., 1997).
Химерні ембріони корів трансплантували по одному телицям-реципієнтам.

Для відновлення мітотичного дроблення в половинках розморожених 7-денних
морул корів чорно-рябої породи використовували фідерні клітини
ембріонального (трофобласт) і маткового (епітеліальні клітини)
походження. Половинки дослідних груп культивували з кластерами
трофобластичних клітин розморожених і культивованих бластоцист (Манк М.,
1990), з розрахунку 4 трофобластичні везикули на 1 половинку у 1 мл
середовища ДМЕМ; або епітеліальними клітинами матки корів (Voelkel C.A.,
1984) у кількості 100 мкл суспензії клітин і 3-4- половинки у 1мл
середовища ТС-199. Половинки контрольних груп культивували без фідерних
клітин. Через 4 і кожні 12 годин культивування розвиток всіх половинок
оцінювали за морфологією, здійснювали повторний мікрохірургічний поділ,
залишали парами у власній прозорій оболонці і трансплантували
телицям-реципієнтам на 6-й день статевого циклу, або продовжували
культивувати in vitro.

У дослідженнях з дозрівання in vitro ооцитів тварин різних розмірів і
морфології їх культивували у 100 мкл середовища ТС-199, DM-335 (“Gibco”)
або ДМЕМ з 25 Мм HEPES, 0,4% БСА, антибіотиками та 10 мкг/мл
фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) і 1 мкг/мл естрадіолу -17? (песці);
10 мкг/мл ФСГ і 1 або 4 мкг/мл естрадіолу -17? та 0,2 мкг/мл
преднізолону (норки, шиншили); 10 мкг/мл ФСГ, 1 мкг/мл естрадіолу -17?,
0,2 мкг/мл преднізолону та 10, 20 і 50 мкг/мл лізину (корови, вівці).
Ооцити тварин морфологічно оцінювали за інтенсивним блиском кумулюсу при
поляризації світла, описували характер грануляції ооплазми, стан
дисоціації кумулюсу: песців за X.H. Wen (1994), норок за
Л.Ф.Максимовським и др. (1996), корів і овець – за Г.В.Стефановичем
(1988). Фолікулярні ооцит-кумулюсні комплекси (ОКК) норок культивували
нативними або після зберігання їх в азоті протягом 1 та 3 діб. Їх
заморожували надщвидким методом у вітрифікаційному середовищі, яке
містило 4,5М етиленгліколя, 3,4М диметилсульфоксиду (ДМСО), 5,56 мМ
глюкози, 0,33 мМ Na-пірувату та 0,4 % БСА у ФСБ Дюльбекко за методикою
для вітрифікації ооцитів м‘ясоїдних (Luvoni G., 2000). Ооцити корів
одержували аспірацією фолікулів після забою, дозрівали на клітинному
субстраті фідерних клітин з яйцепроводів і матки корів у середовищі ДМЕМ
з 25 Мм HEPES, 0,4% БСА, 40 мкг/мл гентаміцину, 0,1% розчином глюкози,
Nа –піруватом (контроль) та з 8, 10 і 12 мкг/мл ФСГ; 1; 2 і 4 мкг/мл
естрадіолу-17( та 0,2; 0,4 і 0,6 мкг/мл преднізолону у дослідних групах.
Оцінювали морфологічну якість ооцитів корів, проліферативний ріст та
функціональну активність епітеліальних клітин з яйцепроводів корів під
дією 20 мкг/мл інсуліну та 10 нг/мл епідермального ростового фактора
(ЕФР) та за умов сумісного впливу цих чинників. ОКК овець одержували
лапароскопічно вiд асканійських кросбредних вiвцематок, стимульованих в
анестральний період (Ledda S. et al., 1999), дозрiвали in vitro у
модифікованому нами “Середовищі для дозрівання in vitro ооцитів корів і
овець”. Дозрілі ооцити запліднювали розмороженою спермою баранів породи
сафолк польської селекції, капацитованою у середовищі TALP (розчин
Тіроде з альбуміном, лактатом і піруватом) з 5,0 мкг/мл гепарину
(Parrish J.J.et al, 1988). Середовище для запліднення (Fert-TALP)
виготовляли на основі середовища ДМЕМ з додаванням 5,0 мкг/мл гепарину
та 5 мМ/мл кофеїну. Презумптивні зиготи культивували у середовищі ДМЕМ
упродовж 48 годин, хірургічно трансплантували реципієнту [Cергеев Н.И.,
1998], одержували приплід. Результати документували відповідними актами
і фотографіями.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Видові особливості доімплантаційного ембріонального розвитку

хутрових тварин

Хутрові тварини були використані як моделі для розробки і вдосконалення
окремих біотехнологічних прийомів і методів. Сперму 48 самців норок, яку
оцінили як „сумнівна” у піхвових мазках, додатково перевіряли методом
визначення інтенсивності дихання сперміїв за знебарвленням метиленової
сині. Сперма активністю 7–9 балів знебарвлювалася впродовж 15-20 хв, 5–6
балів – 25 –30 хв, рідка, малоактивна сперма нижче 5 балів – 45-50 хв.
Добру якість сперми підтверджено у 83,3% самців (pxz|’o,

h

E

0

a

a

–j

`„A

??????

?

j

t

?

?

?

?

,

@

`„A

@Їх знову піддали бісекції методом внутрішньозональної сепарації
бластомерів на дві чвертки без підсадки в окремі прозорі оболонки і
трансплантували 20 телицям-реципієнтам зі спонтанною охотою, по дві
чвертки в один матковий ріг. Тільність від трансплантації чверток
розморожених морул, яку визначали за результатами перегулів, наприкінці
другого місяця становила 15% (3 з 20), виключно за рахунок реципієнтів
дослідної групи. Були одержані дві пари ідентичних близнюків: телички і
бички; і 1 бичок (18,8% приживлення).

Епітеліальні клітини маткового походження використовували для
рекомпактизації і стимуляції розвитку in vitro 22-х половинок
розморожених 7-денних морул корів дослідної групи упродовж трьох діб. Їх
пари склали контрольну групу (табл.5).

Таблиця 5 – Життєздатність половинок розморожених морул корів in vitro
за умов культивування з клітинами епітелію і без них

Групи Половинок Життєздатних половинок після культивування, год.

4 12 24 36 48 60 72

Дослідна, n

% 22 20

90,9 16

72,7 13

59,1 13

59,1 10

45,5 7

31,8 6

27,3

Контрольна, n

% 22 20 90,9 12

54,5 7

31,8 5

22,7* 3

13,6 1

4,5 1

4,5

Всього, n

% 44 40

90,9 28

63,6 20

45,4 18

40,9 13

29,5 8

18,2 7

15,9

Примітка: *- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної
групи.

Життєздатність та розвиток in vitro половинок залишалися задовільними
впродовж перших 12 год за умов культивування їх з клітинами епітелію у
дослідній групі (72,7%) в порівнянні з їх парами у контрольній (54,5%).
Через 36 год життєздатність половинок морул контрольної групи дедалі
зменшувалась, а дослідної лишалася на одному рівні з вірогідною різницею
між групами (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020