.

Вікові особливості вільнорадикального окислення білків і ліпідів у мозку щурів з гіпотиреозом і вплив на них інтенсивного фізичного навантаження

Язык: украинский
Формат: курсова
Тип документа: Word Doc
178 3540
Скачать документ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В. Н. КАРАЗіНА

ХАДДАД АЙХАМ АЛІ

УДК: 616.441 – 008.64:612.66

ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ Вільнорадикального ОКИСЛЕННЯ БІЛКІВ І ЛІПІДІВ У МОЗКУ
Щурів З ГІПОТИРЕОЗОМ І ВПЛИВ НА НИХ ІНТЕНСИВНОГО ФІЗИЧНОГО НАВАНТАЖЕННЯ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти
Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Давидов Вадим В’ячеславович, Харківська
медична академія післядипломної освіти Міністерства охорони здоров’я
України, професор кафедри клінічної біохімії і судово-медичної
токсикології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Бабенко Наталія
Олексіївна, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна МОН
України, НДІ біології, завідувач відділу фізіології онтогенезу доктор
біологічних наук, професор. Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків, завідувач відділу
кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

Захист відбудеться 18.06.2008 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного
університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за
адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства
освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4.

Автореферат розісланий 17.05. 2008 року

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Дзюба В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У цей час серед населення різних країн світу й, у
тому числі України, має місце підвищення рівня захворюваності
гіпотиреозом (Караченцев Ю.И. і співавт., 2002, 2004; Caparevic Z. et
al., 2003; Караченцева И.Н., 2006; Monzani F. et al., 2006). Особливу
небезпеку гіпотиреоз становить у ранньому дитячому й підлітковому віці.
Це пов’язане з високим ризиком появи в дітей і підлітків глибоких
порушень із боку центральної нервової системи, а також виникненням
серйозних ускладнень у більш зрілому віці, у випадку несвоєчасної
діагностики даного захворювання (Зефирова Г.С., 1999; Браверман Л.Е.,
2000). Серед різноманітних проявів гіпотиреозу широке поширення має
ураження ЦНС, що проявляється у виникненні невротичних розладів (Larsen
P.R., 1996; Зефирова Г.С., 1999). Механізм їхнього виникнення при
гіпотиреозі дотепер не вивчений. Разом з тим, поява центральних порушень
припускає модуляцію інтегративної функції мозку в організмі й, тим
самим, сприяє порушенню функціонування інших внутрішніх органів і систем
органів, що у свою чергу, визначає велику клінічну симптоматику даного
захворювання (Зефирова Г.С., 1999; Браверман Л.Е., 2000).

Відповідно до сучасних уявлень, у ролі неспецифічної ланки розвитку
численних фізіологічних станів і патологічних процесів виступає
оксидативний стрес (Mazzetti I. et al., 2001; Cooper C.E. et al., 2002;
Ofran H. et al., 2004; Nayanatara A.K. et al., 2005; Dmitriev L.F.,
2007; Lovel M.A. et al., 2007; Pittagula M. et al., 2006; Flora S.J.,
2007). Разом з тим, відомості про стан вільнорадикальних процесів у
головному мозку при гіпотиреозі відрізняються суперечливістю (Venditti
P. et al., 1997; Gredilla R. et al., 2001; Varghese S. et al., 2001;
Brzezinska-Slebodzinska E., 2005). Усе вище викладене визначає високу
актуальність дослідження вільнорадикальних процесів у мозку при
гіпотиреозі. Всебічне вивчення цього питання відкриває перспективи в
пізнанні механізмів розвитку даного захворювання, а також розробці нових
підходів до його лікування й профілактики.

Беручи до уваги сучасні уявлення про фізіологічну роль оксидативного
стресу і його участі у формуванні адаптивних реакцій в організмі
(Vendemiale G. et al., 1999; Schoneich C. et al., 2006), великий інтерес
становить також і з’ясування ефекту прооксидантних факторів на стан
вільнорадикальних процесів у мозку при гіпотиреозі. Подібні фактори
проявляються в організмі в умовах впливу на нього стресорів різної
природи, і, у тому числі, при інтенсивному фізичному навантаженні (ІФН)
(Leeuwenburgh C. et al., 2001; Sureda A. et al., 2005; Pittagula M. et
al., 2006). Зміна ефекту прооксидантних факторів на стан
вільнорадикальних процесів у клітинах, сприяє модуляції їхньої стійкості
до несприятливих

зовнішніх впливів. У цьому зв’язку, новим перспективним напрямком у
з’ясуванні причин формування невротичних розладів при гіпотиреозі, є
вивчення за його наявності особливостей реалізації прооксидантної дії
ІФН на мозок.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках держбюджетної теми “Вивчити вікові особливості
метаболічної адаптації до дії ушкоджуючих факторів окисного стресу“ (N
державної реєстрації 0102U002283).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення вікових
особливостей формування оксидативного стресу в великих півкулях
головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом і з’ясування
впливу на них інтенсивного фізичного навантаження.

Для реалізації поставленої мети були визначені наступні завдання:

У мітохондріальній, мікросомальній і постмітохондріальній фракції
великих півкуль головного мозку в дорослих статевозрілих (12-ти
місячних) щурів і тварин пубертатного віку (1,5-місячних) з
експериментальним гіпотиреозом після ІФН і без нього:

Визначити особливості накопичення продуктів вільнорадикального окислення
ліпідів і білків;

Оцінити ефективність функціонування ферментів першої лінії
антиоксидантного захисту;

Вивчити швидкість індукованого перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) й
вільнорадикального окислення білків.

Об’єкт дослідження – вільнорадикальні процеси й ферменти першої лінії
антиоксидантного захисту в мозку при експериментальному гіпотиреозі в
щурів різного віку в нормі й при інтенсивному фізичному навантаженні.

Предмет дослідження – рівень накопичення продуктів вільнорадикального
окислення білків і ліпідів, швидкість індукованого вільнорадикального
окислення білків і ліпідів, активність ферментів першої лінії
антиоксидантного захисту в субклітинних фракціях великих півкуль
головного мозку.

Методи дослідження – спектрофотометрія у видимій і ближній
ультрафіолетовій зоні спектра (визначення активності ферментів і вмісту
продуктів вільнорадикального окислення); спектрофлюорометрія (вимір
концентрації основ Шиффа); диференціальне центрифугування
(фракціонування гомогенатів півкуль головного мозку), імуноферментний
аналіз (визначення вмісту гормонів щитовидної залози й тиреотропного
гормону в крові), статистичний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів визначається тим, що в
дисертаційній роботі вперше встановлені вікові особливості використання
ліпідів і білків субклітинних фракцій великих півкуль головного мозку в
процесах вільнорадикального окислення, а також зміни у цих процесах у
щурів з експериментальним гіпотиреозом, що піддавалися інтенсивному
фізичному навантаженню й без нього. Показано, що в мозку дорослих
статевозрілих щурів і тварин пубертатного віку при гіпотиреозі
формується стан оксидативного стресу. Це зрушення має неспецифічний
характер і в більшій мірі проявляється в дорослих щурів.

Важливу роль у виникненні оксидативного стресу в мозку щурів з
гіпотиреозом відіграє підвищення інтенсивності процесів
радикалоутворення в мітохондріях. Воно не пов’язане зі зміною стану в
них ферментативної системи першої лінії антиоксидантного захисту. Більше
того, характер зрушень із боку активності каталази й супероксиддисмутази
(СОД), що виникають у дорослих щурів при експериментальному гіпотиреозі,
припускає формування умов для підвищення ефективності функціонування
першої лінії антиоксидантного захисту й, тим самим, обмежують ефект
посиленого радикалоутворення в мітохондріях при оксидативному стресі.

Особливе значення у виникненні оксидативного стресу в мозку дорослих
щурів при гіпотиреозі, здобуває підвищення чутливості мембран мікросом
до дії прооксидантів. Подібне зрушення не характерне для тварин
пубертатного віку, тому що ліпіди й білки досліджених субклітинних
фракцій мозку в них проявляють підвищену стійкість до вільнорадикального
окислення, навіть в умовах додаткового прооксидантного впливу ІФН.

Виявлено, що в дорослих статевозрілих щурів і тварин пубертатного віку з
експериментальним гіпотиреозом обмежений прояв прооксидантної дії на
мозок інтенсивного фізичного навантаження. В основі формування цього
зрушення лежить компенсаторне підвищення ефективності функціонування
систем антиоксидантного захисту в мітохондріях мозку в умовах
недостатності щитовидної залози. Виникнення оксидативного стресу в мозку
й обмеження ефективності впливу на нього прооксидантних факторів,
визначають появу функціональних порушень із боку ЦНС при гіпотиреозі.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати розширюють
сучасну уяву про особливості вільнорадикального окислення ліпідів і
білків субклітинних фракцій мозку в умовах впливу на організм
несприятливих зовнішніх факторів. Вони розкривають механізми виникнення
порушень із боку ЦНС при гіпотиреозі й указують на існування вікових
особливостей їхньої появи в періоді статевого дозрівання. Результати
проведених досліджень створюють теоретичні передумови для розробки нових
підходів до лікування й профілактики порушень із боку ЦНС при
захворюваннях, пов’язаних з недостатністю щитовидної залози, спрямованих
на нормалізацію в ній стану вільнорадикальних процесів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконане під
керівництвом доктора медичних наук, професора В.В. Давидова, з яким
автор має загальні публікації. Результати, представлені в рукопису,
отримані автором самостійно. Дисертантом особисто проведені
експериментальні дослідження, статистична обробка й аналіз отриманих
результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи повідомлені
на міжнародній науковій конференції студентів і молодих учених
“Актуальні питання в сучасній медицині” (Харків, 2007); конференції
молодих учених, присвяченої пам’яті професора В.П. Вендета “Актуальні
проблеми біохімії та біотехнології–2007” (Київ, 2007); міжнародної
науково-практичної конференції ”Теоретические и прикладные проблемы
социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер
жизни общества“ (Курск, 2007); на 5-й національній науково-практичній
конференції з міжнародною участю “Активные формы кислорода, оксид азота,
антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленск, 2007); на
науково-практичній конференції ”Внесок молодих учених у розвиток
медичної науки й практики” (Харків, 2007); на ІІ Міжнародній конференції
молодих учених “Биология: От молекулы до биосферы” (Харьков, 2007 г.);
на науково-практичній конференції молодих учених: “Медична наука:
сучасні досягнення й інновації” (Харків, 2007); на науково-практичній
конференції з міжнародною участю: “Ендокринна патологія у віковому
аспекті ” (Харків, 2007).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладені в 11
наукових публікаціях – 4 статтях у журналах, рекомендованих ВАК України
й 7 – у збірках тез доповідей конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Робота викладена на 189 сторінках
машинописного тексту й складається із вступу, огляду літератури, методів
дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів,
висновків і списку цитованої літератури, що включає 280 найменувань.
Робота ілюстрована 16 таблицями й 23 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури містить аналіз сучасного стану питання про молекулярні
механізми формування оксидативного стресу і його значення в адаптації
організму до несприятливих зовнішніх впливів і розвитку патологічних
процесів. Особлива увага приділяється розгляду даних літератури про
особливості перебігу вільнорадикальних процесів у тканинах внутрішніх
органів при гіпотиреозі й інтенсивному фізичному навантаженню.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження виконане на 144
щурах-самцях лінії Вістар, які втримувалися в умовах віварію Харківської
медичної академії післядипломної освіти й забезпечувалися стандартним
раціоном харчування. Тварин ділили на дві вікові групи: дорослі
статевозрілі – 10 – 12 місяців (маса 240 – 360 г) і молоді, що
перебувають у періоді статевого дозрівання – 1,5 місяця (маса 80- 90 г).
Кожну групу ділили на чотири підгрупи: 1 – інтактні, 2 – щури, які
піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню (плаванню до “відмови”),
3 – тварини, у яких відтворювався експериментальний гіпотиреоз, 4 – щури
з експериментальним гіпотиреозом, яких піддавали інтенсивному фізичному
навантаженню.

Для відтворення експериментального гіпотиреозу тваринам
внутрішньоочеревинно вводився антитиреоїдний препарат мерказоліл з
розрахунку 1 мг препарату на 100 г маси тварини. Препарат розчинявся в
ізотонічному розчині хлористого натрію. Введення проводилося щодня
протягом 15 днів (Krasilnikova O.A. et al., 2002).

Ефективність відтворення експериментального гіпотиреозу контролювалася
шляхом визначення в крові концентрації тиреоїдних гормонів (тироксину,
трийодотироніну) і тиреотропіну. Дослідження проводилися з використанням
наборів для імуноферментних досліджень фірми “DAI” (США) на
імуноферментному аналізаторі “HUMAREADER” (Німеччина).

З метою відтворення моделі інтенсивного фізичного навантаження щури
піддавалися плаванню до “відмови” у круглих пластикових ємностях
діаметром 40 см. Через годину після плавання тварини піддавалися
евтаназії, відповідно до умов евтаназії, зазначених в методичних
рекомендаціях МОЗ України та загальних етичних принципів проведення
експериментів на тваринах, узгоджених з положеннями “Європейської
конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для
експериментальних та інших наукових цілей”.

З півкуль головного мозку за допомогою скляного гомогенізатора
Поттера-Ельвегейма готувалися 10 % гомогенати на 0,32 М сахарозі (рН
7,4). Отримані гомогенати піддавалися фракціонуванню за допомогою методу
диференціального центрифугування з метою одержання мітохондріальної,
мікросомальної і постмітохондріальної фракцій.

У субклітинних фракціях півкуль головного мозку проводилося визначення
концентрації карбонільованих білків і продуктів вільнорадикального
окислення ліпідів (основ Шиффа і дієнових кон’югатів). Вимір вмісту
карбонільованих білків (КБ) проводився за методом Дубиніної Є.Є. (2000).
У розрахунках використовувався коефіцієнт молярної екстинкції, що
відповідає 2,1 . 104 М-1 . см-1. Визначення основ Шиффа (ШО) проводилося
за допомогою флюорометричного методу (Rice-Evans C.A. et al., 1991). В
основу виміру концентрації дієнових кон’югатів (ДК) був покладений
спектрофотометричний метод Стальної І.Д. (1977). При розрахунках змісту
дієнових кон’югатів використовувався коефіцієнт молярної екстинкції, що
відповідає 2,2 . 105 М-1 . см-1. .

У мітохондріальній і мікросомальній фракції півкуль головного мозку
досліджувалася швидкість індукованого ПОЛ та індукованого
вільнорадикального окислення білків. Для цього 0,1 мл досліджуваної
проби субклітинної фракції змішували з 1,5 мл 0,015 М фосфатного буфера
(рН 7,4). Після трихвилинної преінкубації при 37 °С, у реакційну суміш
вносили 0,2 мл 0,01 М солі Мора й 0,2 мл 1 М перекису водню. Проби
інтенсивно перемішували й інкубували протягом 10 хвилин при 37 °С. Після
цього реакція зупинялася за допомогою додавання трихлоруксусної кислоти
до кінцевої концентрації 5 %. Проби центрифугували 15 хвилин при 3000
об/хв. В отриманому в такий спосіб осаді вимірювали вміст
карбонільованих білків (Дубиніна Є.Є., 2000), а в супернатанті –
ТБК-реактивних речовин. Визначення концентрації ТБК-реактивних речовин
проводилося по реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою. У розрахунках
використовували коефіцієнт молярної екстинкції малонового діальдегіду,
що відповідає 1,53 . 105 М-1 . см-1 (Esterbauer H. et al., 1990).

Для оцінки стану першої лінії антиоксидантного захисту в
мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях півкуль головного мозку
вимірялася активність каталази (Барабой В.А. й ін., 1991) і
супероксиддисмутази (Костюк В.А., 1990).

Вимір вмісту білка в аналізованих пробах визначали за Lowry O. et al.
(1955).

Отримані результати піддавалися статистичній обробці з використанням
непараметричного методу Wilcoxon-Mann-Whitney. Розходження між даними
вважалися достовірними при Р 0,05). Однак в 1,5-місячних щурів при цьому виявляється виражена
тенденція до її підвищення, що обумовлює в них зростання індексу
співвідношення каталаза/СОД на 122 % у порівнянні з інтактними щурами
даної вікової групи. Беручи до уваги, сучасні уявлення про тісну
функціональну взаємодію ферментів першої лінії антиоксидантного захисту
в клітині (Мурадян Ф.Х. та ін., 2003; Baud О. et al., 2004), можна
припустити, що в подібній ситуації в щурів пубертатного віку при
гіпотиреозі виникають передумови для зниження ефективності
функціонування першої лінії антиоксидантного захисту в цитозолі нервових
клітин.

Результати проведених досліджень указують на те, що в дорослих
статевозрілих щурів при експериментальному гіпотиреозі формуються
передумови для підвищення ефективності функціонування першої лінії
антиоксидантного захисту в мітохондріях і, тим самим, обмеження в них
ушкоджуючих ефектів посиленого радикалоутворення при оксидативному
стресі. У тварин пубертатного віку при гіпотиреозі виникають умови для
порушення функціонування даної ферментативної системи в цитозолі
нервових клітин. Однак, незважаючи на це, у них не відбувається
посилення проявів оксидативного стресу в мозку. Більше того, в
1,5-місячних щурів з гіпотиреозом подібного зрушення не виникає навіть
після додаткового впливу інтенсивного фізичного навантаження. Причиною
того може бути зниження ролі СОД і каталази в захисті нервових клітин
від вільнорадикального ушкодження в пубертатному віці. Цілком ймовірно,
на цьому етапі онтогенезу в захисті мозку від оксидативного стресу
зростає значення інших антиоксидантів, до числа яких, цілком ймовірно,
включають глютатіон. Отримані результати дають підстави для висновку про
те, що виникнення оксидативного стресу в мозку щурів при
експериментальному гіпотиреозі не пов’язане зі зміною стану
ферментативної системи першої лінії антиоксидантного захисту в нервових
клітинах. З огляду на це, можна припустити існування
причинно-наслідкових відносин між його появою й посиленням процесів
радикалоутворення в нервових клітинах, у зв’язку з підвищенням їхньої
чутливості до дії прооксидантів. Для перевірки цього припущення було
проведене дослідження чутливості субклітинних фракцій мозку щурів з
гіпотиреозом до дії прооксидантів.

Проведені дослідження показали, що в субклітинних фракціях мозку
1,5-місячних і 12-місячних тварин значно розрізняється базальний рівень
індукованого ПОЛ й вільнорадикального окислення білків (рис. 2). При
цьому швидкість індукованих вільнорадикальних процесів у щурів
пубертатного віку вище, ніж у статевозрілих. Існування подібних вікових
зрушень визначає виникнення вік-залежних особливостей у їхній модуляції
при гіпотиреозі. У дорослих тварин з експериментальним гіпотиреозом, на
тлі підтримки вихідного рівня індукованого вільнорадикального окислення
білків у мітохондріальній і постмітохондріальній фракції мозку, виникає
істотне гальмування швидкості накопичення КБ370 у мікросомальній
фракції. У той же час у мікросомальній фракції мозку в них підвищується
швидкість індукованого ПОЛ на 146 %, у порівнянні з вихідною величиною
(рис. 3). У щурів пубертатного віку в мітохондріальній і мікросомальній
фракції мозку при гіпотиреозі зменшується швидкість індукованого
вільнорадикального окислення білків і ліпідів.

picscalex970100090000037800000002001c00000000000400000003010800050000000
b0200000000050000000c02e5016907040000002e0118001c000000fb021000070000000
000bc02000000cc0102022253797374656d0001690700003d4f0000985c110004ee83396
8bb09060c020000040000002d01000004000000020101001c000000fb02ceff000000000
0009001000000cc0440001254696d6573204e657720526f6d616e0000000000000000000
000000000000000040000002d010100050000000902000000020d000000320a2d0000000
1000400000000006907e40120bb1600040000002d010000030000000000

Рис. 2. Швидкість індукованого ПОЛ (у нмоль ТБК-реактивних речовин / хв
. мг білка) і індукованого накопичення карбонільованих білків (у нмоль
КБ/ хв . мг білка) у мітохондріальній (А) і мікросомальній (Б) фракції
півкуль головного мозку інтактних щурів різного віку. Примітки: 1)
і-КБ363 та і-КБ370 – швидкість накопичення карбонільованих білків,
максимум поглинання фенілгідразонів яких становить 363 або 370 нм
відповідно; 2) * – Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020