НУЖИНА НАТАЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 612.43; 612.45; 591.147
Циркадна динаміка структурних змін гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної
системи та епіфіза птахів після введення мелатоніну та блокаторів
дофамінових рецепторів
03.00.11.– цитологія, клітинна біологія, гістологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2004
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса
Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор ДЗЕРЖИНСЬКИЙ Микола
Едуардович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідувач кафедри цитології, гістології та біології розвитку
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник
КВІТНИЦЬКА-РИЖОВА Тетяна Юріївна, Інститут геронтології АМН України,
завідувач лабораторії морфології і цитології
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
БОНДАРЕНКО Людмила Олександрівна, Інститут проблем ендокринної патології
ім. В.Я. Данилевського АМН України, завідувач лабораторії
хроноендокринології
Провідна установа: Національний аграрний університет КМ України, м.
Київ, кафедра гістології, цитології та ембріології
Захист дисертації відбудеться “16” лютого 2005 р. о 17 00 год. На
засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 26.001.38 при Київському
національному університеті імені Тараса Шевченка, ауд. 215.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний
факультет, Спецрада
Д 26.001.38
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул.
Володимирська, 58.
Автореферат розісланий 14.01.2005 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради О.В. Цимбалюк
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Проблема вивчення механізмів регуляції репродуктивної
системи, незважаючи на довготривале дослідження, залишається дуже
актуальною. Відомо, що репродуктивна функція у птахів реалізується
завдяки скоординованій роботі гіпоталамо-гіпофізарно-гонадного
комплексу. Разом із тим, гонадотропна функція гіпоталамуса перебуває під
модулюючим впливом моноамінергічних систем та позагіпоталамічних
структур головного мозку [Weesner G.D., 1992, Leret M.L., 1990].
Зокрема, узгодження активності репродуктивної системи з добовими й
сезонними змінами пов’язують з гормоном епіфіза мелатоніном [Арушанян,
1992]. Проте, на даний час з’ясовані не всі аспекти дії цього гормону на
структурно-функціональний стан гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи.
У більшості випадків введення мелатоніну пригнічує репродуктивну систему
піддослідних тварин [Olcese, 1995, Glass J.D., 1987]. Однак, в
літературі зустрічаються і протилежні дані [Пустовалов, 2003]. І зовсім
мало відомостей про те, яким чином здійснюється цей вплив.
Разом з тим, відомо, що певну роль в реалізації ефектів мелатоніну на
репродуктивну систему відіграє дофамін (ДА). Слід зауважити, що в
літературі є суперечливі та неоднозначні відомості стосовно регуляції
гіпоталамо-гіпофізарно-гонадного комплексу птахів дофамінергічною
системою мозку. Одні дослідники відводять ДА активуючу роль
[Е.В.Науменко з соавт., 1975], а інші – гальмівну [Tortonese DJ, 1995,
Lacau-Mengido I.M., 1993]. Відомо також, що ефекти ДА на репродуктивну
систему опосередковуються різними типами рецепторів; причому активація
кожного з цих рецепторів часто веде до різних наслідків [Bertrand F,
1999, Youngren, 1998]. Результати ж досліджень, присвячені з’ясуванню
ролі кожного з типів рецепторів, часто суперечливі.
Необхідність проведення комплексного дослідження регуляції мелатоніном
функціональної активності гіпоталамо-гіпофізарно-гонадного комплексу
птахів полягає ще і в тому, що переважна більшість наявних робіт
стосується ссавців. Тоді як кількість досліджень на птахах значно менша.
Зв’язок із науковими програмами. Робота виконана на кафедрі цитології,
гістології та біології розвитку в рамках комплексної наукової програми
Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Здоров’я
людини”. Назва науково-дослідної теми: “Вивчення ролі моноамінергічних
систем головного мозку в гіпоталамічному контролі стресорних реакцій у
наднирниковій та щитовидній залозах та епіфізарної регуляції гонад в
онтогенезі” (№ теми 01БФ033-02, № держреєстрації 0102 U 001161).
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідити циркадну
динаміку структурних змін гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи та
епіфіза птахів при введенні мелатоніну та блокаторів дофамінових
рецепторів.
У зв’язку з цим поставлені наступні завдання:
З’ясувати морфо-функціональний стан гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної
системи самців японських перепелів (Coturnix coturnix japonica) після
введення мелатоніну в різні години доби.
Проаналізувати роль D1-, D2-дофамінових рецепторів в реалізації впливу
мелатоніну на гіпоталамо-гіпофізарно-гонадну систему протягом доби.
Провести морфометричний аналіз добових змін структури супрахіазматичного
ядра гіпоталамуса та епіфіза птахів на фоні модуляції активності
репродуктивної системи мелатоніном.
Дослідити роль дофамінергічної системи у функціонуванні епіфіза та
супрахіазматичного ядра гіпоталамуса.
Об’єкт дослідження: нейроендокринна регуляція статевого дозрівання
птахів.
Предмет дослідження: гістофізіологічна характеристика
гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної системи та епіфіза птахів в нормі та під
дією мелатоніну та блокаторів дофамінових рецепторів.
Методи дослідження: в роботі застосовано такі методи дослідження:
гістологічні (світлова та електронна мікроскопія) та морфометричні (для
кількісної оцінки морфологічних параметрів досліджуваних структур).
Наукова новизна одержаних даних. Вперше було зроблено порівняльну
характеристику впливу одноразового введення мелатоніну на репродуктивну
систему птахів вранці, вдень, ввечері та вночі. При цьому було
встановлено, що введення мелатоніну вранці, ввечері та вночі викликає
пригнічення гонад, а введення його вдень – стимуляцію гонад.
Підтверджено, що мелатонін опосередковує свій вплив на репродуктивну
систему птахів через дофамінергічну систему, однак вперше встановлено,
що цей вплив відрізняється в різний час доби. Встановлено, що вранці та
вдень мелатонін може опосередковувати свою дію як через D1-, так і через
D2 дофамінові рецептори. Тоді як, ввечері в реалізації гальмівного
впливу екзогенного мелатоніну на гонади беруть участь тільки D1
дофамінові рецептори. Також вперше виявлено, що зменшення сім’яних
канальців вночі після введення мелатоніну не опосередковано дофаміновими
рецепторами. Вперше був проведений морфометричний аналіз добових змін
супрахіазматичного ядра гіпоталамуса та епіфіза птахів та показано, що
активуючий вплив екзогенного мелатоніну на епіфіз ввечері
опосередкований переважно D1 дофаміновими рецепторами, а вночі –
D2-рецепторами.
Практичне значення отриманих даних. Отримані результати насамперед
поглиблюють розуміння механізмів нейроендокринної регуляції
репродуктивної системи з боку дофамінергічної системи головного мозку та
мелатоніну. Це може слугувати теоретичною передумовою для розробки
оптимальніших режимів розмноження та регуляції статевого дозрівання
сільськогосподарських птахів. Результати дослідження можуть бути
використані у порівняльних дослідженнях взаємодії епіфіза та
репродуктивної системи в різних класах хребетних тварин.
Матеріали даної дисертації впроваджені у спецкурси “Гістофізіологія
нейроендокринної системи” та “Біологія постембріонального розвитку”, що
читаються на кафедрі цитології, гістології та біології розвитку
біологічного факультету Київського національного університету імені
Тараса Шевченка.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проаналізована
спеціальна література по темі дисертації, проведена гістологічна та
морфометрична обробка матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманих
даних, а також написання роботи. Методика введення блокатора D1
дофамінових рецепторів в третій шлуночок мозку розроблялась спільно із
асистентом кафедри цитології, гістології та біології розвитку к.б.н.
Варенюком І.М. Планування експерименту, інтерпретація наукових положень
і висновків проведено спільно з науковим керівником. У проведенні
хронічного експерименту брали участь співробітники кафедри цитології,
гістології та біології розвитку.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до
дисертації, доповідались на XLI Міжнародній науковій конференції
студентів, аспірантів та молодих вчених “Студент і науково-технічний
прогрес” (м. Новосибірськ, 2003), на конференції
професорсько-викладацького складу біологічного факультету Київського
національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, 2003), на
міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів і
молодих вчених “Шевченківська весна. Сучасний стан науки: досягнення,
проблеми і перспективи розвитку” (м. Київ, 2003), на конференції
професорсько-викладацького складу біологічного факультету Київського
національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, 2004), на
міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів і
молодих вчених “Шевченківська весна. Сучасний стан науки: досягнення,
проблеми і перспективи розвитку” (м. Київ, 2004), на VI Міжнародній
науково-практичній конференції морфологів України (м. Львів, 2004).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт, із них: 4 статті у
наукових фахових часописах та збірках наукових праць і 4 тези доповідей
до наукових конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу,
переліку умовних скорочень, 4 розділів (з яких 1 розділ присвячений
огляду літератури, 1 – викладу матеріалів та методів досліджень і 2 –
опису результатів дослідження та їх обговоренню), висновків та списку
літератури. Робота викладена на 163 сторінках; вона ілюстрована 76
рисунками, серед яких є діаграми, схеми, мікрофотографії. Список
літератури включає 331 джерело, серед яких 38 – з України та країн СНД і
293 – з інших зарубіжних країн. Дисертація містить 2 додатки.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження
Відповідно до мети та завдань дослідження експеримент було проведено на
160-ти 5-тижневих самцях японських перепелів (Coturnix coturnix
japonica). Птахів утримували в умовах одного віварію на стандартному
раціоні. Світловий режим: 14 годин – світло (з 7 до 21 години), 10 годин
– темрява (з 21 до 7 години).
У ході експерименту було створено 28 піддослідних груп, у кожній з яких
було по 4-6 птахів. Птахам одноразово вводили в той або інший час доби
мелатонін (вранці – о 7оо, вдень – о 13оо, ввечері – о 19оо або вночі –
о 1оо) після того чи іншого препарату. В кожен з чотирьох періодів доби
птахи були поділені на 7 груп залежно від препарату, який вводився:
1) Фізіологічний розчин (доза – 30 мкг/100 г маси тіла) (контроль). 2)
Мелатонін (доза – 10 мкг/100 г маси тіла). 3) R(+)-SCH-23390 гідрохлорид
(блокатор D1 дофамінових рецепторів (доза – 0,8 мкг/100 г маси тіла)).
4) R(+)-SCH-23390 гідрохлорид та мелатонін (в тих самих дозах). 5)
Галоперидол (блокатор D2 дофамінових рецепторів (доза – 30 мкг/ 100 г
маси тіла)). 6) Галоперидол та мелатонін (в тих самих дозах). 7)
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид потім галоперидол, а потім мелатонін (в тих
самих дозах).
Мелатонін вводився перорально. Галоперидол вводили внутрішньом’язово,
тоді як R(+)-SCH-23390 гідрохлорид вводили в порожнину третього шлуночка
мозку за допомогою стереотаксичного прилада СЭЖ-3. Для чистоти досліду
птахам 1, 2, 3 і 4 груп внутрішньом’язово вводили фізіологічний розчин
(в дозі 30 мкг/100 г маси тіла), а також птахам 1, 2, 5 і 6 груп
фізіологічний розчин вводили в порожнину третього шлуночка мозку (в дозі
0,002 мл/ на птаха).
Через 2 години після введення мелатоніну птахів декапітували.
Для ультраструктурних досліджень додатково був проведений дослід на 24
самцях 5-тижневих японських перепелів, яких утримували за аналогічних
умов, що були описані вище. В ході експерименту було створено 8
піддослідних груп, в кожній з яких було по 3 тварини. Птахам одноразово
вводили вдень – о 13оо або ввечері – о 19оо мелатонін після того чи
іншого препарату. В кожен з двох періодів доби птахи були поділені на
1-4 групи описані вище.
Після декапітації птахів гіпоталамічну область мозку, аденогіпофіз,
епіфіз та гонади фіксували для подальшої гістологічної обробки. Фіксація
матеріалу здійснювалась у рідині Буена (гіпоталамічна область мозку,
епіфіз та сім’яники), та в 10%-ному формаліні (аденогіпофіз). Після чого
його заливали за стандартною методикою в парафін і виготовляли на
санному мікротомі фронатальні серійні зрізи гіпоталамічної області мозку
та зрізи сім’яників завтовшки 5 – 6 мкм, а аденогіпофіза та епіфіза –
завтовшки 3 – 4 мкм.
Зрізи гіпоталамуса фарбували крезиловим фіолетовим по Нісслю. Активність
нейроцитів дрібноклітинних ядер визначали за величиною клітинних ядер,
кількістю та розмірами гранул нейросекрету у цитоплазмі. Зрізи
аденогіпофіза фарбували альціановим синім, реактивом Шиффа та оранжем
“G” за Herlant. Зрізи сім’яників та епіфіза фарбували гематоксиліном
Бемера та еозином. На зрізах гіпоталамуса вимірювали діаметр ядер
нейросекреторних клітин АЯ та СХЯ, на зрізах аденогіпофіза – площу
перетину ядер гонадотропоцитів, на зрізах епіфіза – площу перетину ядер
пінеалоцитів, на зрізах сім’яників вимірювали діаметр сім’яних
канальців, та оцінювали активність сперматогенного епітелію.
Гістологічні препарати аналізували на світлооптичному мікроскопі за
допомогою окуляр-мікрометра МОВ-1-15х, та пакета програм для морфометрії
Promorph-Paradise (НВК “Єва”, Київ). Мікрофотографії досліджених тканин
робили за допомогою цифрової відеокамери Olympus та мікроскопа B(41
Olympus.
Для електронномікроскопічного аналізу брали епіфіз, який обробляли по
Уіклі. Фіксовані та зневоднені шматочки тканини заключали в суміш
епону-812, аралдиту та DDSA. Потім з цих блоків прицільно виготовляли
ультратонкі зрізи, які контрастувалися водним розчином уранілацетату та
нітрату свинцю по Рейнольдсу. Відконтрастовані зрізи досліджувалися за
допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-125 К.
Статистичну обробку здійснювали методами варіаційної статистики за
допомогою програмного забезпечення STATISTICA 5,0 for Windows.
Порівнювали контрольні групи з піддослідними групами. Групи, яким
вводили мелатонін разом з блокаторами дофамінових рецепторів, ми також
порівнювали з групами, яким вводили лише мелатонін у відповідний період
доби. Вірогідність різниці між такими групами оцінювали за t-критерієм
Ст’юдента. Вірогідною вважали різницю між порівнюваними серіями досліду
при Р
†
????†
?
?
Mа кількість рибосом знаходилася у вільному стані, що є свідченням
посилення синтезу речовин для власних потреб, а не на експорт. Такі дані
можуть свідчити про активацію мелатоніном епіфіза вдень.
Разом з цим при введенні вдень мелатоніну на фоні блокади D1 дофамінових
рецепторів ми теж отримали підвищення активності пінеалоцитів епіфіза,
але проявляється воно по-іншому. Так, з одного боку виявлялися ядра у
стані високої активності, а з іншого – помірна кількість мітохондрій,
значно розширені порожнини перинуклеарного простору та цистерн ЕПР, що
свідчить про накопичення в них секреторного матеріалу і низьку
активність процесів виділення. Таким чином, стимуляція епіфіза в даній
групі відбувається переважно на рівні синтезу та накопичення секрету,
поряд з пригніченням процесів виділення синтезованих речовин. Подібну
картину в ЕПР ми спостерігаємо також у контрольній денній групі.
Оскільки морфометричні дані отримані при введенні мелатоніну на фоні
блокади D1 дофамінових рецепторів не відрізняються від таких у групі з
введенням самого мелатоніну, то можна зробити висновок, що дані ефекти
спричинені самим мелатоніном, а D1 дофамінові рецептори при цьому не
задіяні.
Зовсім протилежний ефект викликає введення лише R(+)-SCH-23390
гідрохлориду. При такому впливі спостерігається пригнічення не лише
нейроцитів СХЯ гіпоталамуса, а і пінеалоцитів епіфіза, при чому останній
ефект також підтверджується на ультраструктурному рівні. Оскільки у
цитоплазмі пінеалоцитів поряд з помірно розвинутими органелами
виявлялися також мітохондрії з спіралеподібно закрученими структурами та
лізованими кристами, що вказує на дегенеративні зміни в епіфізі після
введення блокатора D1 дофамінових рецепторів в цей час доби.
Отже можна вважати, що ДА активує епіфіз та СХЯ вдень при малій
кількості ендогенного мелатоніну, здійснюючи свій вплив через D1
дофамінові рецептори. Тоді як в ефектах екзогенного мелатоніну D1
дофамінові рецептори не задіяні, а незначна гальмівна дія опосередкована
D2 рецепторами. Оскільки в активуючій дії мелатоніну ДА не бере участі,
то ми припускаємо, що мелатонін безпосередньо активує СХЯ та епіфіз.
Вечірнє введення мелатоніну здійснювало гальмівний ефект на активність
гонад (табл. 2). Введення мелатоніну на тлі блокади D2-рецепторів
галоперидолом або самого галоперидолу викликало зниження активності
гонадотропоцитів у вечірні години порівняно з контролем, відповідно в
гонадах у цей період доби зменшується діаметр сім’яних канальців. Таку
реакцію з боку гіпофізарно-гонадного комплексу на введення мелатоніну на
тлі блокади D2-рецепторів можна пояснити як ефект самого ДА, оскільки ці
результати не є достовірними відносно групи птахів, яким вводили
мелатонін. Також реакція цих органів на введення лише галоперидолу, або
лише R(+)-SCH-23390 гідрохлориду імовірно є наслідком гальмівної дії ДА
на гонадну систему не лише через D2-рецептори, а і через D1-рецептори. В
АЯ гіпоталамуса при цьому зростає активність нейросекреторних клітин, що
можна пояснити дією механізму зворотних зв’язків.
Таблиця 1. Морфометричні параметри гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної
системи, нейронів супрахіазматичного ядра гіпоталамуса та епіфіза
японських перепелів у різних серіях експерименту
умови експерименту площа перетину ядер пінеалоцитів епіфіза, мкм2
діаметр ядер нейронів СХЯ гіпоталамуса, мкм діаметр ядер нейронів АЯ
гіпоталамуса, мкм площа перетину ядер гонадотропоцитів аденогіпофіза,
мкм2 діаметр сім’яних канальців, мкм
ранкове введення препаратів
фізіологічний розчин 19,8±0,7 7,2±0,2 7,7±0,1 10,2±0,3 84±3
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид 18,8±0,4 7,0±0,1 6,7±0,1* 8,1±0,2* 76±2*
галоперидол 19,0±0,6 9,2±0,1* 7,8±0,1 8,6±0,2 79±2
мелатонін 19,1±0,2 8,0±0,1* 7,9±0,2 9,1±0,4 53±1*
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + мелатонін 19,4±0,6 8,2±0,1* 7,2±0,1*^
8,3±0,1*^ 76±2*^
галоперидол + мелатонін 19,2±0,5 8,2±0,1* 9,1±0,1*^ 8,0±0,2*^ 107±4*^
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + галоперидол + мелатонін 18,2±0,5 7,0±0,1^
6,6±0,1^ 8,5±0,2*^ 95±3*^
денне введення препаратів
фізіологічний розчин 18,8±0,3 7,7±0,1 7,9±0,1 9,1±0,3 96±2
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид 17,6±0,4* 7,3±0,1* 7,1±0,1* 7,9±0,2* 88±3
галоперидол 19,5±0,5 9,0±0,1* 7,7±0,1 7,6±0,1* 102±2
мелатонін 20,3±0,4* 8,6±0,1* 7,4±0,1* 10,7±0,1* 130±7*
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + мелатонін 21,5±0,5* 8,6±0,1* 7,4±0,1*
8,8±0,1^ 77±2*^
галоперидол + мелатонін 19,7±0,4 9,4±0,1*^ 9,8±0,2*^ 8,9±0,3^ 64±2*^
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид + галоперидол + мелатонін 19,8±0,3* 8,3±0,1*
6,9±0,1^ 8,8±0,3^ 93±3^
* – Р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
