Національна Академія Наук
України
Інститут фізіології ім. О.О.
Богомольця
Потапенко Євгеній Сергійович
УДК 616.092.18
Вплив змін лужно – кислотної рівноваги позаклітинного середовища на
функціонування кальцієвих депо нейронів заднього рогу спинного мозку
щурів
14.03.04 – Патологічна
фізіологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ –
2004
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи
Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Науковий керівник:
академік НАН України, доктор біологічних наук Костюк Платон Григорович
директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
зав. відділом загальної фізіології нервової системи (ЗФНС)
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук Соловйов Анатолій Іванович, головний науковий
співробітник Інституту фармакології та токсикології АМН України;
доктор біологічних наук Кришталь Микола Васильович, доцент кафедри
патологічної фізіології Національного медичного університету
ім.О.О.Богомольця.
Провідна установа:
Інститут ендокринології та обміну речовин ім.В.П.Коміссаренко НАН
України, м.Київ.
Захист відбудеться ”_22_”___червня___” 2004 р. о ”_14_” годині на
засіданні
Спеціалізованої вченої ради при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології
ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.
Київ, вул. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий ”_14___”__травня___” 2004 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук ________________
Сорокіна-Маріна З.О.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Роль внутрішньоклітинних вільних іонів кальцію
([Ca2+]i), як вторинного посередника, визначається його здатністю до
взаємодії з регуляторними білками клітини. Гомеостаз кальцію в клітині
забезпечується динамічною взаємодією структур плазматичної мембрани та
внутрішньоклітинних органел (мітохондрій, ендоплазматичного ретикулуму).
Відносний внесок цих структур та взаємодія між ними відрізняється в
клітинах різних типів та залишається в цілому маловивченою. Одним з
таких маловивчених типів клітин є нейрони заднього рогу спинного мозку
(DH нейрони). Ураження нервової системи виникають при багатьох
захворюваннях та можуть розвиватись у вигляді різноманітних нейропатій,
які супроводжуються порушеннями сенсорики у формі больових синдромів чи
втрати чутливості, що, в свою чергу, може призводити до інвалідізації
пацієнтів. Визначення етіології та дослідження патогенезу цих порушень є
надзвичайно важливою проблемою як для дослідників, так і для
практикуючих лікарів. Важливим фактором у розвитку патологій нервової
системи є зміна такого інтегрального показника гомеостазу організму, як
концентрація іонів водню (наприклад, кетоацидоз при цукровому діабеті),
що може призводити до порушень у функціонуванні pH – чутливих
Са2+-регулюючих систем. Дані про зміни у роботі ендоплазматичного
ретикулуму (ЕР) та мітохондрій DH нейронів при цих станах практично
відсутні. Розширення наших знань про регуляцію концентрації Ca2+ у
цитозолі ([Ca2+]i) в умовах позаклітинного алкалозу та ацидозу дозволить
покращити наше уявлення про зміни, які відбуваються у нервових клітинах
при різноманітних захворюваннях, що, в свою чергу, допоможе у пошуках
шляхів корекції цих порушень. Аналіз участі, відносного внеску та
взаємодії мітохондрій та ЕР, як основних учасників процесу підтримки
кальцієвого гомеостазу та його порушень при алкалозі та ацидозі, є
надзвичайно важливим та має незаперечний науковий інтерес та практичне
значення.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи
Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Молекулярні
механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур”.
Мета дослідження. Оцінка відносної участі кальційрегулюючих органел
(мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму) у кальцієвій сигналізації
та їхньої взаємодії у нейронах заднього рогу спинного мозку (вторинні
сенсорні нейрони) в контрольних умовах та при позаклітинній ацидіфікації
та алкалінізації.
Завдання дослідження.
Виявити зміни базального рівня [Ca2+]i в умовах позаклітинної
алкалінізації та ацидіфікації.
Визначити участь мітохондрій у формуванні кальцієвого сигналу,
викликаного деполяризацією та виведенням Ca2+ з кофеїн-чутливого депо
ендоплазматичного ретикулуму DH нейронів.
Визначити зв’язок між просторовим розташуванням мітохондрій та ЕР та
участю цих структур у формуванні кальцієвих транзієнтів.
Порівняти характеристики кальцієвих транзієнтів, викликаних
деполяризацією 50mM розчином KCl в нейронах заднього рогу спинного мозку
щурів в контрольних умовах та при позаклітинній алкалінізації та
ацидіфікації.
Визначити роль уніпортеру та Na+/Ca2+ обмінника мітохондрій у процесі
змін базального рівня [Ca2+]i в DH нейронах при позаклітинному алкалозі
та ацидозі.
Визначити роль кофеїн-чутливого депо ЕР у змінах базального рівня
[Ca2+]i в DH нейронах при позаклітинному алкалозі та ацидозі.
Охарактеризувати процес взаємодії мітохондрій та ЕР при виникненні змін
у базальному рівні [Ca2+]i в умовах позаклітинного алкалозу.
Встановити внесок мітохондрій, ЕР та кальцієвих каналів цитоплазми у
зміни амплітуди та кінетичних характеристик кальцієвих транзієнтів,
викликаних деполяризацією 50mM розчином KCl в цих нейронах в умовах
позаклітинної ацидіфікації та алкалінізації.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше був досліджений характер
та кінетика участі мітохондрій та ЕР у кальцієвій сигналізації при
наявності різних джерел надходження Ca2+ до цитозолю. Дістало подальший
розвиток дослідження взаємодії між мітохондріями та ЕР та змін у їхньому
функціонуванні при позаклітинній алкалінізації і ацидіфікації. Нами
вперше був доведений вплив вивільнення Ca2+ з мітохондрій на виникнення
кальцій-індукованого Ca2+ вивільнення (CICR, calcium induced calcium
release) з ріанодинового депо ЕР.
Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати,
отримані в цій роботі, мають теоретичне та практичне значення.
Дослідження особливостей участі мітохондрій та ЕР у формуванні [Ca2+]i
сигналу та змін у їхньому функціонуванні в умовах позаклітинного
алкалозу та ацидозу в DH нейронах щурів дозволять розширити наше
уявлення про механізми Ca2+ гомеостазу в контрольних умовах та при
станах, що супроводжуються зсувами позаклітинного рН. Це, в свою чергу,
поліпшить наше розуміння патогенезу порушень з боку нервової системи при
різноманітних захворюваннях. Вивчення впливу різноманітних хімічних та
фармакологічних речовин на функціонування внутрішньоклітинних систем, що
підтримують кальцієвий гомеостаз, ставить питання про їхнє можливе
використання при корекції його порушень у клінічній практиці.
Особистий внесок здобувача. Експерименти з дослідження участі кальцієвих
депо в регуляції [Ca2+]i у DH нейронах, змін у функціонуванні цих депо
при позаклітинному алкалозі та ацидозі, а також їхньої взаємодії,
проводились автором особисто. Експерименти з використанням
електронмікроскопічних методів дослідження просторового розташування
мітохондрій та ЕР відносно один одного та плазматичної мембрани
проводились спільно з аспіранткою відділу цитології Інституту фізіології
ім. О. О. Богомольця Гірник О. В. Обробка та статистичний аналіз
результатів проводились автором особисто.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались
на: 1-му білатеральному Богомолець–Ненцкі симпозіумі, Сулейов, Польща,
2001; 3–му форумі Федерації Європейських Нейронаук, Париж, Франція,
2002; щорічній конференції Товариства Нейронаук, Орландо, США, 2002;
2–му білатеральному Богомолець–Ненцкі симпозіумі, Київ, 2002; 3–й
конференції українського біофізичного товариства, Львів, 2002;
конференції фізіологічного товариства Угорщини “Оксидативний стрес та
клітинна сигналізація”, Будапешт, Угорщина, 2003; VI конгресі нейронаук
IBRO, Прага, Чехія, 2003, а також на семінарах сектору молекулярної
фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця, Київ, Україна у
2001–2003 роках.
Публікації. Результати досліджень опубліковані у п’яти наукових статтях
та п’яти тезах конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень,
обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 217
найменувань. Робота викладена на 145 сторінках та ілюстрована 33
рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтована актуальність дослідження відносної участі
кальційрегулюючих органел (мітохондрій та ЕР) у [Ca2+]i сигналізації та
їхньої взаємодії у DH нейронах в контрольних умовах та при
позаклітинній ацидіфікації та алкалінізації, сформульована мета та
задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну
цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів
дисертації.
Розділ 1 ”Огляд літератури” присвячений висвітленню відомих аспектів
процесу кальцієвого гомеостазу у нервових клітинах, взаємодії між
кальцієвими депо та кальцієвими каналами плазмалеми. Охарактеризовані
нейрони заднього рогу спинного мозку та структури, що приймають участь у
[Ca2+]i сигналізації, а також їхні фармакологічні властивості.
Висвітлені особливості функціонування цих структур в умовах зсувів
позаклітинної концентрації H+ та розглянуті стани, що до них призводять.
Критично проаналізовано протиріччя в результатах наукових робіт та
обґрунтовано актуальність дослідження впливу змін кислотно-лужної
рівноваги позаклітинного середовища на функціонування кальцієвих депо в
нейронах заднього рогу спинного мозку щурів.
Для досягнення поставленої мети у розділі 2 ”Матеріали та методи
дослідження” описано використання наступних методичних підходів:
виділення гостроізольованих нейронів заднього рогу спинного мозку щура;
флуоресцентний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів
Ca2+;
метод електронної мікроскопії ділянки тканин тонких зрізів спинного
мозку, що відносяться до заднього рогу спинного мозку;
статистична обробка отриманих результатів з використанням стандартних
методів аналізу.
Виділення гостроізольованих нейронів заднього рогу спинного мозку щура.
В дослідах використовувались 11-денні самці білих щурів лінії Вістар.
Процедура декапітації щура проводилась у відповідності з вимогами НАН
України по використанню експериментальних тварин. Після виділення
поперекового відділу спинного мозку та видалення його оболонок
проводилось нарізання тонких поперечних зрізів (300мкм) за допомогою
вібратому (Campden Instruments LTD, Велика Британія). Вирізані ділянки
заднього рогу піддавались послідовній ферментній обробці у розчині ACSF,
що містив 0,2мг/мл пронази Е (Calbiochem, США) на протязі 12 хвилин та
0,05мг/мл протеази Х типу (Sigma, США) на протязі 10 хвилин. Окремі
клітини отримувались за допомогою м’якого піпетування з використанням
піпеток різного діаметру на протязі декількох хвилин.
Флуоресцентний метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів
Ca2+. Свіжоізольовані DH нейрони інкубували протягом 30 хв. при
температурі 37?С в розчині, що містив 10мкМ Indo-1AM. Після цього
клітини тричі відмивались чистим зовнішньоклітинним розчином і
залишались в темряві при кімнатній температурі на 30-40 хвилин для
деестерифікації Indo-1AM. Збудження флуоресцентного зонду здійснювалось
при довжині хвилі 360нм за допомогою відповідного фільтру. Реєстрація
емісії проводилась у двох діапазонах: 395-410нм (F400) та 490-510нм
(F500) за допомогою фотопомножувачів. Сигнали з фотопомножувачів
подавали на вхід аналогового ділителя DIV100 (Burr Broun, США), який в
реальному масштабі часу обчислював співвідношення флуоресцентних
сигналів на двох довжинах хвиль: R=F400/F500. Це співвідношення є
пропорційним до [Ca2+]i, та не залежить від концентрації зонду в
клітині. Для обчислення [Ca2+]i нами використовувалась формула
Грінкевича:
[Ca2+]i = Kd B (R – Rmin)/(Rmax – R),
де Kd-константа дисоціації індикатору з Ca2+; B-коефіцієнт, що
визначається оптичними характеристиками установки та дорівнює відношенню
F5000/F500s (F5000-інтенсивність флуоресценції Indo-1 за відсутності
Ca2+, F500s–інтенсивність флуоресценції Indo-1 при насичуючій
концентрації Ca2+.
Електронмікроскопічне дослідження. Для електронної мікроскопії ділянки
тканин тонких зрізів спинного мозку, що відносяться до заднього рогу,
фіксувались у розчині 3% глутаралдегіду та 4% параформальдегіду у 0,1М
фосфатному буфері (рН 7,4) на протязі 1 години. Після цього тканини
промивались фосфатним буфером та фіксувались в осмії на протязі 1
години. Після трьох подальших промивок у фосфатному буфері зразки були
дегідратовані методом серійної промивки у розчинах з концентрацією
етанолу, що зростала, проходячи через градуйований ацетон–суміш EPON та
залишалась у ньому на ніч. Потім зразки були імплантовані до желатинових
капсул. Тонкі секції (1–2мкм) були пофарбовані у водному уранілацетаті
та цитраті свинцю. Отримані секції досліджувались за допомогою
електронного мікроскопу JEM-100C.
Електрофізіологічні вимірювання. Фізіологічний розчин, що
використовувався для виділення спинного мозку та отримання ізольованих
клітин заднього рогу містив (у мМ): NaCl 125; KCl 5; CaCl2 2,5; MgSO4
1,5; NaHCO3 25; KH2PO4 1,6; глюкоза 10, рН 7,35, при постійному
оксигенуванні сумішшю 5%CO2+95%O2. Базовим позаклітинним розчином, що
використовувався для перфузії експериментальної камери та приготування
всіх інших позаклітинних розчинів був модифікований розчин Тироде
наступного складу (у мМ): NaCl 140, KCl 2, MgCl2 2, CaCl2 2, HEPES 10,
глюкоза 10, рН 7,35. Деполяризуючий розчин містив (у мМ): NaCl 92, KCl
50, MgCl2 2, CaCl2 2, HEPES 10, глюкоза 10. Безкальцієвий фізіологічний
розчин отримували шляхом заміни CaCl2 у базовому розчині на MgCl2, а
також додаванням хелатора Ca2+–EGTA у концентрації 2мМ. Для відтворення
позаклітинного алкалозу та ацидозу проводилась ізоосмолярна заміна у
модифікованому розчині Тироде NaCl на NaOH та HCl відповідно. Значення
рН позаклітинного розчину при алкалозі та ацидозі складали 8,8 та 6,0
відповідно. Іndo-1АМ була отримана від компанії Molecular Probes,
(Eugene, США), всі інші солі та реагенти – від компанії Sigma-Aldrich
Chemie GmbH. (Deisenhofen, ФРН). Всі числові значення результатів
досліджень приводились у вигляді середнього значення(середньоквадратичне
відхилення (SEM). Після кожного результату приводиться значення числа
експериментів (n), яке є кількістю досліджених клітин. Достовірність
статистичних відмінностей для двох груп результатів експериментів
визначалась за допомогою Ст’юдент-тесту (Т-тесту). Критерієм
достовірності відмінностей було вибране значення P0,05). Це свідчить про те,
що у проміжок часу, який відповідає максимальній амплітуді кальцієвого
транзієнту накопичення Ca2+ мітохондріями через механізм
уніпортеру ще не надто потужне. Натомість, деполяризація на фоні
ТРР+ призводила до достовірних змін у фазі спаду [Ca2+]i транзієнтів
(t0,5). Так, якщо у контролі ця величина складала 3,8(0,4сек, то на
фоні ТРР+ 2,8(0,2сек (n=8, Р0,05) при рН позаклітинного
середовища 7,35 та 8,8 відповідно. Час від початку деполяризації до
максимуму амплітуди транзієнта – 4,5(0,38с та 4,8(0,37с (n=16, Р>0,05)
відповідно. T0,5 транзієнту становив 3,7(0,54с та 4,4(0,56с (n=16,
Р>0,05) відповідно. Таким чином, алкалінізація не змінює ефективність
активації Са2+ каналів плазмалеми.
8ae( * ” ? ( * ????&?????$?* F p 0:0o0R2P3o4,6,768*:F>®D:IAN?OIQNR?UD[H\??UUUUUUUUIIIIII?III
&
&
&
@Аплікація 30мМ кофеїну на протязі 5 секунд (після попередньої
деполяризації) викликала транзієнтне підвищення рівня [Ca2+]i на
223(39нМ (n=9). Така сама аплікація кофеїну в умовах, коли клітина на
протязі 2 хвилин знаходилась у алкалінізованому розчині, викликала
транзієнт з амплітудою 134(14нМ (n=9, P0,05).
Разом з тим, t0,5 при цьому збільшувався з 8,9(1,2сек у контролі до
11,4(1,1сек при ацидозі (n=14, Р0,05).
Обговорення результатів. Запропонована робота присвячена комплексному
вивченню Ca2+ сигналізації у DH нейронах, зокрема оцінці кінетичних
характеристик процесів, пов’язаних з участю мітохондрій та EР в
регуляції Ca2+ гомеостазу у клітинах при наявності різних джерел
надходження Ca2+ до цитозолю у контрольних умовах, а також зміни при
позаклітинній алкалінізації та ацидіфікації. У дослідженнях з
використанням блокаторів мітохондріального Ca2+ захвату реєструвались
значні порушення у кінетиці виведення цитозольного Ca2+ після його
попереднього підвищення при надходженні з позаклітинного середовища.
Разом з тим, участь мітохондрій у формуванні Ca2+ сигналу в умовах, коли
джерелом його підвищення було вивільнення з депо EР, залишалась
недослідженою. Питання впливу просторового розташування мітохондрій та
EР на Ca2+ сигналізацію вивчається на протязі останніх кількох років, в
основному, на секреторних клітинах та міозитах, та знаходиться у стадії
початкових досліджень. Враховуючи подібність амплітуди та кінетики
деполяризаційних Ca2+ транзієнтів, а також величини базального [Ca2+]i
від одного нейрона до іншого, можна говорити про наявність у них
потужних та точних механізмів, направлених як на формування Ca2+
сигналу, так і на підтримання базального рівня [Ca2+]i. Аплікация СССР
призводить до значного підвищення [Ca2+]i, що вказує на існування
градієнту концентрації Са2+ на внутрішній мембрані мітохондрій, та
свідчить про те, що мітохондріальна концентрація кальцію ([Ca2+]m) у
спокої вища за цитозольну. Активне захоплення Ca2+ мітохондріями
починається з 8–ї секунди від початку деполяризації, досягаючи
максимальної потужності на 12–13 секунді, що відповідає періоду
зростання [Ca2+]i транзієнту та верхній частині фази спаду, проявляючи
властивості потужного Ca2+ депо. Робота мітохондрій під час фази росту
транзієнту призводить до деякого зниження його амплітуди, а у фазі
спаду–до прискорення повернення [Ca2+]i до базального рівня. Вивільнення
[Ca2+]i з мітохондрій за допомогою механізму Na+/Ca2+ обмінника починає
переважати його захват уніпортером в середньому на 26–28 секунді, коли
рівень [Ca2+]i знижується до 9–11% від його максимального значення
(відповідало перевищенню базового рівня на 50–60нМ) та значною мірою
визначає час, необхідний для повернення [Ca2+]i до базального рівня.
Потужність роботи обмінника залежала від концентрації [Ca2+]m що, в свою
чергу, залежала від роботи уніпортеру. Остаточне повернення [Ca2+]i до
базального рівня відбувалось лише через кілька хвилин після початку
деполяризації, що вказує на те, що робота Na+/Ca2+-обмінника значно менш
потужна, ніж уніпортеру мітохондрій. Перед початком деполяризації, а
також після закінчення деполяризації та повернення [Ca2+]i до базального
рівня мітохондрії знаходяться у напівзаповненому стані. Експерименти з
використанням блокатору РТР-циклоспоріну А показали незначну роль цього
механізму у процесі виведення Ca2+ з мітохондрій. Іншим джерелом Ca2+
сигналу може бути його вивільнення з депо EР. Блокування уніпортеру за
допомогою СССР у випадку кофеїн–індукованих Ca2+ транзієнтів виявило
дещо іншу кінетику участі мітохондрій у цьому процесі. Значне збільшення
амплітуди кофеїн–індукованих Ca2+ транзієнтів на фоні СССР (на 55%)
свідчить про активне акумулювання Ca2+ мітохондріями під час зростання
[Ca2+]i. Участь уніпортеру мітохондрій у формуванні кофеїн–індукованого
Ca2+ сигналу починалась з 3–ї секунди та досягала максимуму на 5–7
секунді від початку аплікації кофеїну. Процес вивільнення [Ca2+]m до
цитозолю Na+/Ca2+ обмінником починає переважати процес його захвату
уніпортером на 22–23 секунді, коли рівень [Ca2+]i знижується до 17–19%
від максимального значення. Тобто, участь мітохондрій у формуванні
кофеїн–індукованого кальцієвого сигналу починалась значно раніше, ніж у
випадку з входом Ca2+ з позаклітинного середовища. Це могло бути
пов’язане з особливостями просторового розташування мітохондрій та EР у
цитозолі. Електронна мікроскопія ділянок тканин тонких зрізів DH
показала, що відносна щільність мітохондрій у цитозолі була
0,72(0,04мкм–2, достовірно перевищуючи її у примембранному шарі
(0,55(0,05мкм–2). Також відмічена наявність щільного взаєморозташування
мітохондрій та трубочок EР. Таким чином, при вході Ca2+ до клітини з
позаклітинного середовища, концентрація, необхідна для включення
уніпортеру мітохондрій, досягається значно пізніше, ніж при вивільненні
Са2+ з депо EР внаслідок активації ріанодинових рецепторів. В останньому
випадку він відносно швидко досягає мітохондрій, практично одразу та у
великій кількості захоплюється ними за допомогою механізма уніпортеру та
виводиться назовні Na+/Ca2+-обмінником (рис.22). При вивченні впливу
позаклітинної алкалінізації та ацидіфікації на кальцієвий
Рис. 22. Схема, пояснююча механізм виникнення цитозольних кальцієвих
сигналів при позаклітинній алкалінізації. Розшифровка скорочень наведена
у тексті.
гомеостаз DH нейронів були зареєстровані значні зміни у функціонуванні
кальцієвих каналів плазмалеми, мітохондрій та EР. Першим завданням було
визначити залежність рівню базального [Ca2+]i від рН позаклітинного
середовища. Була показана наявність принципових відмінностей у змінах
базального рівня [Ca2+]i в залежності від зсуву позаклітинного рН в
сторону ацидозу чи алкалозу. Так, при алкалозі спостерігались значні та
складні за кінетикою зсуви базальної концентрації [Ca2+]i. Двофазне
підвищення базального [Ca2+]i у вигляді початкового піку та наступного
плато відбувались лише при перезаповненні кальцієвих депо за допомогою
гіперкалієвої деполяризації. Зниження рН позаклітинного розчину
викликало достовірне зниження базового [Ca2+]i на протязі всього часу
дії закисленого розчину. Приблизно у 70% клітин цьому зниженню
передувало короткочасне та незначе за амплітудою підвищення [Ca2+]i.
Обидва ці ефекти могли бути повторно викликані в одному й тому
самому нейроні та могли бути пов’язані як зі змінами у
надходженні Са2+ з позаклітинного середовища через іонні канали
плазмалеми чи іонообмінники, так і зі змінами його накопичення чи
вивільнення внутрішньоклітинними депо. Умовою підвищення [Ca2+]i при
алкалінізації міг бути попередній вхід цих іонів з позаклітинного
середовища в результаті деполяризації цитоплазми нейрона. Такий вхід не
міг бути безпосереднім джерелом цього підвищення в зв’язку з тим, що
зростання базального [Ca2+]i у цитозолі зберігалось також в умовах
проведення вимірювань у безкальцієвому розчині. Було зроблене припущення
про те, що безпосередньою причиною зареєстрованих змін є порушення у
функціонуванні внутрішньоклітинних Са2+ депо, основними з яких є EР та
мітохондрії. Для визначення того, яка з цих структур відповідальна за
зміни базального [Ca2+]i, були досліджені зміни описаних ефектів при
блокуванні іонообмінних механізмів. Аплікація кофеїну у контрольних
умовах та на фоні позаклітинного алкалозу показала значне та достовірне,
але зворотнє зниження амплітуди Са2+ транзієнтів у другому випадку.
Попереднє завантаження ретикулуму Ca2+ є необхідною передумовою
виникнення фази підвищення [Ca2+]i при алкалозі (фази швидкого
зростання). Повторні аплікації розчину Тироде з рН=8,8 без попереднього
перезаповнення EР призводили до швидкого зникнення цього ефекту.
Преаплікація іономіцину у безкальцієвому розчині також призводила до
зникнення впливу алкалінізації на базальну концентрацію Са2+ . На
відміну від алкалінізації, на зміни базального [Ca2+]i при ацидіфікації
не впливало експериментальне спустошення депо EP. Здатність останнього
акумулювати та вивільняти Са2+ також достовірно не змінювалась. Для
визначення можливої участі уніпортеру мітохондрій іонообмінна функція
останнього блокувалась за допомогою СССР. Такий вплив усував характерне
для ацидозу падіння базального [Ca2+]i, що вказує на участь мітохондрій
у цьому процесі. Аналогічна дія СССР на фоні алкалозу викликала більш
складний ефект. Характерне для алкалозу підвищення рівня [Са2+]i не
зникало, проте, воно значно змінювало свою характерну кінетику у вигляді
транзієнтного піку та подальшого плато. Початкове швидке підвищення
[Са2+]i зникало, амплітуда плато значно зменшувалась (до 17,0±2нМ), а
саме плато ставало нерегулярним, повертаючись до базального рівня на
протязі 30–60 секунд, незважаючи на продовження алкалінізації. Типові
для алкалозу зміни базального [Са2+]i відновлювались після відмивки
клітин у розчині з фізіологічним рН. Таким чином, в обох випадках
мітохондрії грають певну роль у змінах базального [Са2+]i, але у випадку
алкалозу їх участь опосередкована якимось проміжним механізмом.
Першопричиною таких змін у функціонуванні мітохондрій можуть бути зміни
у H+ градієнті на їх внутрішній мембрані в сторону зменшення (при
алкалозі) або збільшення (при ацидозі). Відомо, що зміни позаклітинної
концентрації Н+ швидко призводять то відповідних змін у їх
внутрішньоклітинній концентрації в результаті проникнення через
канали плазмалеми та іонообмінники, які, в свою чергу, приймають
участь у Са2+ сигналізації. Таким чином, у випадку ацидозу здатність
мітохондрій акумулювати та утримувати Са2+ потенціюється, а у випадку
алкалозу пригнічується. В останньому випадку Са2+ вивільнюється до
цитозолю, а їх потік взаємодіє з EР, стимулюючи вивільнення Са2+ з його
депо через механізм CICR. Іншими словами, мова йде про наявність
індукованого мітохондріями вивільнення Са2+ до цитозолю (Mitochondrial
Induced Calcium Release, MICR). Це підтверджується
електронмікроскопічними даними про просторове розташування мітохондрій
та EР у цих нейронах. Деполяризаційні Са2+ транзієнтіи, викликані на
фоні позаклітинної алкалінізації не зазнавали достовірних змін у
амплітуді та кінетиці. Таким чином, алкалінізація не змінює але, навіть,
потенціює активацію Са2+ каналів під час гіперкалієвої деполяризації
(як наслідок підвищення фіксованого негативного заряду на поверхні
плазмалеми та підсилення електричної збудливості). На фоні позаклітинної
ацидіфікації амплітуда [Са2+]i транзієнтів різко (але зворотньо)
зменшувалась. Цей ефект може бути певною мірою обумовлений зниженням
заряду на поверхні плазматичної мембрани та її електричної збудливості.
Іншою характерною ознакою впливу ацидозу було значне уповільнення фази
спаду транзієнтів, що перетворювалась на подовжене плато. Різниця у
кінетиці спаду транзієнтів повністю зникала при блокуванні уніпортеру
мітохондрій. В той же час преаплікація кофеїну не впливала на різницю у
кінетичних характеристиках деполяризаційних Са2+ транзієнтів, викликаних
у контролі та при позаклітинному ацидозі. Зсуви кислотно–лужної
рівноваги внутрішнього середовища організму, що виникають як у
фізіологічних, так і у патологічних умовах, є потужним фактором, що
викликає зміни сигнальної функції нейронів, що мають складний характер
та обумовлені взаємодією цілого ряду внутрішньоклітинних механізмів.
ВИСНОВКИ
Методом флуоресцентної кальційметрії в гостроізольованих нейронах
заднього рогу спинного мозку щурів досліджені зміни внутрішньоклітинної
концентрації вільних іонів кальцію при зсувах рН позаклітинного
середовища від 7,35 до 6,0 та 8,8.
При досліджені базового рівня внутрішньоклітинного вільного кальцію в
цих нейронах при зсувах рН позаклітинного середовища були зареєстровані
зворотні його зміни у вигляді двофазного підвищення при алкалозі, що
складалось з фази швидкого росту та подовженого у часі плато, та
короткочасного транзієнтного підвищення та наступного зниження нижче
базового рівню при ацидозі.
Порівняння Ca2+ транзієнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією
мембрани нейронів в контрольних умовах та на фоні позаклітинної
ацидіфікації показало значне (статистично достовірне) зниження їх
амплітуди в останньому випадку.
Після припинення позаклітинної ацидіфікації відбувалось відновлення
амплітуди транзієнтів, але спостерігалось значне збільшення часу,
необхідного для повернення [Ca2+]i до базового рівня. Натомість, на фоні
та після позаклітинної алкалінізації не відмічались достовірні зміни у
амплітуді та кінетиці деполяризаційних кальцієвих транзієнтів.
Аналіз впливу мітохондрій на зміни кінетики спаду деполяризаційних
транзієнтів після позаклітинної ацидіфікації показав значне збільшення
їх активності, що виражалось у посиленому захопленні іонів кальцію з
цитозолю під час деполяризації та, відповідно, до більш потужного їх
виведення до цитозолю після закінчення деполяризації. Разом з тим, не
було зареєстровано достовірних змін у роботі кальцієвого депо
ендоплазматичного ретикулуму в цих умовах.
Дослідження участі ендоплазматичного ретикулуму у змінах базального
рівню внутрішньоклітинного вільного кальцію в цих нейронах при
позаклітинній алкалінізації показало наявність ефекту його спустошення.
Попередження акумуляції іонів кальцію мітохондріями перешкоджає
виникненню характерних змін базального рівню [Ca2+]i в умовах
позаклітинної алкалінізації. Вхід іонів кальцію з позаклітинного
середовища не є безпосередньою причиною змін базального рівня
внутрішньоклітинного вільного кальцію при алкалозі, але є їхньою
необхідною передумовою.
Показані відмінності в участі мітохондрій у модуляції двох різних за
походженням типів кальцієвих сигналів. Показаний вплив просторового
взаєморозташування мітохондрій, ріанодинових рецепторів
ендоплазматичного ретикулуму та кальцієвих каналів плазмалеми на
кальцієву сигналізацію у нейронах заднього рогу спинного мозку.
Отримані результати свідчать про важливе значення взаємодії між
внутрішньоклітинними кальцій–регулюючими структурами – мітохондріями та
ендоплазматичним ретикулумом у внутрішньоклітинній кальцієвій
сигналізації у нейронах DH в контрольних умовах та при зсувах рН
позаклітинного середовища. Порушення такої взаємодії може бути причиною
змін у проведенні сенсорних сигналів до вищерозташованих мозкових
структур при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями
кислотно–лужної рівноваги внутрішнього середовища організму.
Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації.
Кругликов І.А., Шутов Л.П., Шишкін В.О., Костюк О.П., Потапенко Є.С.,
Войтенко Н.В. Порушення внутрішньоклітинних механізмів сенсорних
нейронів при експериментальному цукровому діабеті. Фізіологічний журнал
2001, т.47, №5, ст.18-25.
Kruglikov I., Shutov L., Potapenko E., Voitenko N., Kostyuk P.
Metabotropic purinoreceptors in rat dorsal horn neurones: predominant
dendritic location. Neuroreport 2001, v.12(16), p.3503-3507.
Shishkin V., Potapenko E., Kostyuk E., Girnyk O., Voitenko N., Kostyuk
P. Role of mitochondria in intracellular calcium signalling in primary
and secondary sensory neurones of rats. Cell Calcium 2002, v.32, p.
121-130.
П. Костюк, Е. Потапенко, И. Сирык. Щелочно-кислотное равновесие и
функция нервной клетки. Весці Нацыянальнай Акадэміі Навук Беларусі 2003,
т.3, ст.34-39.
Kostyuk P., Potapenko E., Siryk I., Voitenko N., Kostyuk E.
Intracellular calcium homeostasis changes induced in rat spinal cord
neurons by extracellular acidification. Neurochemical Research 2003,
v.28(10), p.1543-1547.
Тези доповідей:
Potapenko E., Shishkin V., Voitenko N., Kostyuk P. Intracellular
mechanisms responsible for elimination of Ca2+ from cytosol in rat
dorsal horn neurons: changes under inflammation. Sulejow 2001.
Kostyuk P. G., Potapenko E. S., Shishkin V. A., Hirnyk O. V.
Mitochondria as an important component of the intracellular messenger
systems. Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems. Kyiv
2001; p.8.
Potapenko E., Shishkin V., Kostyuk P., Voitenko N. Kinetic and spatial
separation of Ca2+ accumulating structures in primary and secondary
structures of rats. Forum of Federation of European Neurosciences. Paris
2002.
E. Potapenko., P. Kostyuk., I. Siryk., E. Kostyuk. Intracellular calcium
homeostasis changes induced in rat spinal cord neurons by extracellular
acidification. Physiological Society Spring Workshop “Receptors and Cell
Signalling in Oxidative Stress”, Budapest 2003.
E. S. Potapenko., I. V. Siryk., N. V. Voitenko., E. P. Kostyuk., P. G.
Kostyuk.. Alkalinization-induced changes in intracellular calcium in rat
spinal cord neurons. Sixth IBRO World Congress of Neuroscience. Prague
2003.
Анотації
Потапенко Є.С. Вплив змін лужно–кислотної рівноваги позаклітинного
середовища на функціонування кальцієвих депо нейронів заднього рогу
спинного мозку щурів.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за
спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. Інститут фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2004.
Дисертацію присвячено дослідженню кальцієвої сигналізації в нейронах
заднього рогу спинного мозку щурів в умовах фізіологічного
позаклітинного рН, а також при його зсувах в сторону алкалозу та
ацидозу. Показано, що характер кальцієвого сигналу значною мірою
визначається джерелом його походження та залежить від просторового
розташування мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму відносно одне
одного та цитоплазми. У випадку алкалозу спостерігались складні зміни у
кальцієвій сигналізації, обумовлені виходом Ca2+ з мітохондрій та
ефектом кальцій–індукованого вивільнення Ca2+ з ендоплазматичного
ретикулуму. При ацидозі спостерігалось значне пригнічення роботи
потенціал-керованих кальцієвих каналів. Аналіз впливу мітохондрій на
зміни кінетики спаду деполяризаційних транзієнтів після позаклітинної
ацидіфікації показав значне збільшення їх активності, що виражалось у
посиленому захопленні Ca2+ з цитозолю під час деполяризації та до більш
потужного їх виведення до цитозолю після її закінчення. Отримані
результати свідчать про важливе значення взаємодії між мітохондріями та
ендоплазматичним ретикулумом у внутрішньоклітинній кальцієвій
сигналізації в контрольних умовах та при зсувах рН позаклітинного
середовища.
Ключові слова: нейрони заднього рогу спинного мозку, мітохондрії,
ендоплазматичний ретикулум, рН.
Potapenko Е.S. Influence of asid-base equilibrium changes of
extracellular medium for functioning of calcium stores in rat spinal
cord dorsal horn neurons.- Manuscript.
Thesis for a candidate’s degree by speciality 14.03.04 – patological
physiology. – Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy
of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.
This dissertation is devoted to investigation of calcium signalling in
rat spinal cord dorsal horn neurons under physiological pH of
extracellular medium and under its acid-base shifts. It was shown that
kinetic of calcium signal a considerable degree depend on its extraction
and spatial location of mitochondria and endoplasmic reticulum from each
other and cytoplasm. Complex changes of calcium signalling due to Ca2+
extrusion from mitochondria and calciun induced calcium release from
endoplasmic reticulum under alkalosis conditions are to be observed.
Significant depression of voltage-operated calcium channels under
acidosis conditions also to be observed. Analysis of mitochondria
influence on changes in kinetic of depolarizational calcium transients
after extracellular acidification shown are considerably increase in
their activity which express in strengthening of Ca2+ capture from
cytosol under depolarization and its raising back to the cytosol after
end of depolarization. It has been concluded, that interaction between
mitochondria and endoplasmic reticulum have an extremely importance for
the intracellular calcium signalling under physiological pH of
extracellular medium and under its acid-base shifts.
Keywords: spinal cord dorsal horn neurons, mitochondria, endoplasmic
reticulum, рН.
Потапенко Е.С. Влияние изменений щелочно–кислотного равновесия
внеклеточной среды на функционирование кальциевых депо нейронов заднего
рога спинного мозга крыс.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по
специальности 14.03.04 – патологическая физиология. Институт физиологии
им. А.А. Богомольца НАН Украини, Киев, 2004.
Диссертация посвящена комплексному изучению кальциевой сигнализации в
нейронах заднего рога спинного мозга крыс, в частности, оценке
кинетических характеристик процессов, связанных с участием митохондрий и
эндоплазматического ретикулума в регуляции кальциевого гомеостаза в
клетках при наличии различных источников поступления ионов кальция в
цитозоль в условиях физиологического рН внеклеточной среды, а также при
его сдвигах в сторону алкалоза и ацидоза. При помощи метода
внутриклеточной кальцийметрии были изучены кинетические характеристики
работы унипортера, пор с переходной проницаемостью и Na+/Ca2+ обменника
митохондрий в зависимости от источника повышения концентрации
цитозольного кальция. Анализ полученных результатов показал значительные
отличия в кинетике работы унипортера митохондрий в зависимости от
источника повышения концентрации ионов кальция в цитозоле. Было
проведено электронмикроскопическое изучение вышеназванных нейронов для
определения зависимости отличий кинетических характеристик работы
внутриклеточных депо от пространственного взаиморасположения митохондрий
и эндоплазматического ретикулума друг относительно друга, а также
относительно цитоплазматической мембраны. Задержка в работе митохондрий
во время входа кальция из внеклеточной среды в сравнении с таким при
кофеин–индуцированном высвобождении кальция из рианодинового депо
эндоплазматического ретикулума определяется их низкой плотностью в
примембранной области цитоплазмы а также близким взаиморасположением
митохондрий и трубочек эндоплазматического ретикулума, что облегчает
захват митохондриями Ca2+, который висвобождается из ретикулума под
действием кофеина.
Показаны изменения в кальциевой сигнализации данных нейронов при сдвигах
рН внеклеточной среды в сторону алкалоза и ацидоза. Было показано, что
при алкалозе отсутствуют достоверные изменения в амплитуде и кинетике
деполяризационных кальциевых транзиентов. Вместе с тем происходил
значительный и сложный по форме, но обратимый рост базальной
концентрации внутриклеточных ионов кальция в виде двуфазного повышения,
которое состояло из фазы быстрого роста и долгодлящегося плато. Такие
изменения наблюдались лишь в случае предварительного перезаполнения
кальциевого депо эндоплазматического ретикулума и были обусловлены
выходом кальция из депо митохондрий (вследствие возможного снижения
протонного градиента на их внутренней мембране при снижении концентрации
протонов в цитозоле) и возникающим затем эффектом
кальций-индуцированного кальциевого высвобождения из рианодинового депо
эндоплазматического ретикулума.
Установлено, что при ацидозе происходит достоверное изменение базального
уровня свободного цитозольного кальция в виде кратковременного
транзиентного повышения и последующего снижения ниже базального уровня.
На фоне внеклеточного ацидоза наблюдалось значительное угнетение входа
ионов кальция из внеклеточной среды через потенциал-управляемые каналы.
Также наблюдались значительные изменения в кинетике фазы спада
деполяризационных кальциевых транзиентов в условиях предварительной
внеклеточной ацидификации. Было показано влияние митохондрий на
изменения кинетики спада деполяризационных гиперкалиевых транзиентов
после внеклеточной ацидификации, которое проявлялось в виде
значительного увеличения активности механизма митохондриального
унипортера в этих условиях. Это приводило к усиленному захвату Ca2+ из
цитозоля во время деполяризации и более мощному его выведению в цитозоль
после ее окончания. В то же время, опустошение рианодинового депо
эндоплазматического ретикулума при помощи преаппликации кофеина не
влияло на разницу в кинетических характеристиках деполяризационных Са2+
транзиентов, вызванных в контрольных условиях и при внеклеточном
ацидозе.
Полученные результаты свидетельствуют о важном значении взаимодействия
между митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом, а также их
пространственного взаиморасположения во внутриклеточной кальциевой
сигнализации в контрольных условиях и в условиях изменений рН
внеклеточной среды. Нарушение такого взаимодействия в условиях шифта рН
внеклеточной среды при патологических состояниях, которые сопровождаются
нарушениями кислотно–щелочного равновесия внутренней среды организма
может быть причиной изменений в проведении сенсорных сигналов к
вышерасположенным мозговым структурам.
Ключевые слова: нейроны заднего рога спинного мозга, митохондрии,
эндоплазматический ретикулум, рН.
PAGE 1
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
