КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Сенчило Наталія Василівна
УДК 579.861.2 – 8.097+616. 981.25-07
Тейхоєва кислота стафілокока та її імунобіологічна активність
03.00.09. – імунологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ 2004
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі мікробіології та загальної імунології
біологічного факультету Київського національного університету імені
Тараса Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Позур Володимир Костянтинович,
Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, кафедра
мікробіології та загальної імунології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший
науковий співробітник, Гавриленко
Тетяна Іллівна, Інститут кардіології
імені М.Д. Стражеска АМН України,
керівник відділу імунології.
доктор біологічних наук, старший
науковий співробітник, Мінченко
Жанна Миколаївна, Науковий центр
радіаційної медицини АМН України
завідуюча лабораторією
імуногенетики
Провідна установа: Національний медичний університет
ім. О.О Богомольця МОЗ України, м.
Київ
Захист відбудеться „20” квітня 2004 р. о ____ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою:
03127, Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, ауд.. 434
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка: 01033, Київ-33, вул. Володимирська,
58.
Автореферат розісланий „19” березня 2004 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук
Молчанець О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Інфекційні захворювання людини та тварин
стафілококової етіології належать до одних із найбільш поширених та
небезпечних [Bone, 1999(. Захворювання, викликані Staphylococcus аureus,
мають високий ступінь летальності та різноманітні прояви у вигляді
сепсисів, пневмоній, гнійних захворювань шкіри. Успішність лікування
вказаних захворювань багато в чому залежить від своєчасної діагностики.
На жаль, запропоновані раніше методи діагностики стафілококового сепсису
недостатньо надійні внаслідок відносно низької чутливості і
специфічності. Тому розробка методів ранньої і надійної діагностики
стафілококової інфекції дуже актуальна на сьогодні.
Новітні дослідження імунобіологічних властивостей антигенів клітинної
стінки стафілокока (пептидоглікан, білок А, тейхоєва кислота) показали,
що макромолекулярна організація клітинної стінки, представників роду
Staphylococcus біосинтез і структура її полімерів більш складні, ніж це
уявляли раніше (Наумова, Шашков, 1997(.
Тейхоєві кислоти (ТК) належать до основних компонентів клітинної стінки
(складають 10-60% її маси) грампозитивних бактерій, зокрема
стафілококів, і мають різноманітну структуру. У зв’язку з потребами
ветеринарної та медичної практики особливу увагу привертає вплив цих
сполук на клітини, тканини та імунну систему теплокровних тварин і
людини.
Хоча відомо, що тейхоєві кислоти відіграють важливу роль у патогенезі
перебігу ряду інфекційних захворювань, їх вплив на різні ланки імунної
системи вивчено дуже фрагментарно. Зокрема, остаточно не з`ясовано, яким
чином ці кислоти пов’язані з регуляцією протипухлинної активності
природних кілерних клітин. Детальне вивчення закономірностей імунної
відповіді на тейхоєві кислоти, впливу останніх на неспецифічні фактори
резистентності, з`ясування ролі спадковості при формуванні подібних
реакцій необхідні для розробки методів спрямованої регуляції імунної
відповіді при стафілококових інфекціях.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у межах науково-дослідної теми кафедри мікробіології та
загальної імунології біологічного факультету Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за програмою “Здоров`я людини”:
“Модуляція та корекція імунної системи та імунного гомеостазу
біологічними та хімічними факторами”, (номер державної реєстрації
0197U003569).
Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було з`ясувати особливості
імунної відповіді на тейхоєву кислоту Staphylococcus аureus, встановити
роль спадкового фактору в формуванні імунної відповіді, а також
визначити діагностичні можливості розробленої тест-системи із
застосуванням ТК.
Для досягнення зазначеної мети були сформульовані такі задачі:
1. Отримати тейхоєву кислоту клітинної стінки Staphylococcus aureus та
дослідити її основні фізико-хімічні характеристики.
2. Вивчити динаміку гуморальної імунної відповіді на тейхоєву кислоту
Staphylococcus aureus у піддослідних мишей різних генетичних ліній.
3. Виявити вплив тейхоєвої кислоти на функціональну активність
макрофагів та природних клітин-кілерів мишей.
4. Визначити вплив тейхоєвої кислоти на функціональний стан щитоподібної
залози мишей при стафілококовій інфекції.
5. Розробити тест–систему на основі імуноферментного аналізу із
застосуванням тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus для діагностики
захворювань стафілококової етіології.
Об`єктом дослідження були тейхоєва кислота та антитіла проти неї.
Предметом дослідження були антигенні та імуногенні властивості тейхоєвої
кислоти.
Матеріали і методи дослідження: за допомогою методу екстракції із
інтактних клітин одержано препарати тейхоєвої кислоти клітинної стінки
Staphylococcus aureus (штам Wood 46); застосовували традиційні
імунохімічні методи, зокрема імуноферментний аналіз; метод приготування
кон`югату пептиду з овальбуміном; іонообмінну хроматографію, а також
цитологічні та мікроскопічні методи.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показана здатність
тейхоєвої кислоти викликати явище “метаболічного вибуху” в
перитонеальних макрофагах мишей.
Внаслідок аналізу оригінальних експериментальних даних вперше виявлено,
що тейхоєва кислота за низьких і середніх концентрацій стимулює, а за
високих – інгібує цитолітичну активність природних кілерних клітин
мишей. Вперше проведений порівняльний аналіз модулюючого впливу
тейхоєвої кислоти та стандартного стимулятора лімфоїдних ліній – форбол
мирістат ацетату (ФМА) на вказані клітини. При сумісній дії цих речовин
встановили їх дозозалежний інгібуючий вплив.
Досліджено динаміку гуморальної імунної відповіді на тейхоєву кислоту
стафілокока у мишей різних генетичних ліній. У мишей лінії BALB/C
виявлено низький рівень відповіді, а лінії С57BL – високий. Показано
наявність взаємозв`язку між імунною і ендокринною системами, зокрема
встановлено роль щитоподібної залози у розвитку імунної реакції
піддослідних мишей на введення тейхоєвої кислоти.
Обґрунтованість і достовірність наукових положень, висновків і
рекомендацій. Результати дисертаційної роботи одержані з використанням
сучасних методичних підходів і статистичного аналізу, що зумовлює високу
вірогідність наведених в дисертації наукових положень, висновків і
рекомендацій.
Практичне значення роботи.
Розроблено тест-систему на основі імуноферментного методу для виявлення
антитіл проти тейхоєвої кислоти у сироватці крові хворих на ендокардит
стафілококової етіології, яка може бути застосована для ранньої
діагностики вказаного захворювання. Дані про різноспрямованість реакцій
щитоподібної залози мишей різних генетичних ліній на введення тейхоєвої
кислоти можуть бути застосовані при розробці методів лікування
аутоімунних захворювань, а про імуногенність цієї кислоти – для
вдосконалення серологічної діагностики стафілококових захворювань
людини.
Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою.
Інформаційний пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схеми
експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та
інтерпретацію здійснено особисто автором. Підготовка публікацій за
отриманими результатами, а також представлення результатів на наукових
конференціях здійснені за участю наукового керівника.
Автор щиро вдячний співробітникам відділу молекулярної імунології
Інституту біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України к.б.н. Д. В. Колибі і
к.б.н. С. І. Романюк за допомогу в адаптації імуноферментного методу
для дослідження динаміки гуморальної імунної відповіді мишей різних
генотипів. Сироватки крові хворих на інфекційний ендокардит були
отримані з Інституту грудної хірургії ім. М. Амосова НАН України, за що
автор висловлює подяку д.м.н. А. М. Воробйовій. Сироватки хворих на
гнійний гострий гайморит та отит були отримані з ЛОР відділення дитячої
лікарні № 1 м. Києва за що автор дякує к.б.н. Т. В. Марушко.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були
представлені на всеукраїнській конференції студентів та аспірантів
“Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2002); 8-му
українському біохімічному з`їзді (Чернівці, 2002); науковій конференції
студентів, аспірантів та молодих учених з молекулярної біології і
генетики (Київ, 2001); науковій конференції молодих вчених Київського
національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2000).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 9 наукових праць, з
яких 5 – статті у фахових журналах, 1 – окрема глава монографії
“Тейхоєві кислоти бактерій та їхні біологічні властивості“, 3 –
матеріали конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 141 сторінці
машинописного тексту і складається з розділів “Вступ“, “Огляд
літератури“, “Матеріали й методи досліджень“, “Результати досліджень та
їх обговорення“, “Висновки “, “Список використаних джерел“, який містить
160 посилань. Робота містить 9 таблиць та 16 рисунків, 1 формулу.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з 5 підрозділів, які містять аналіз
літературних даних про структуру тейхоєвих кислот, їх біологічні функції
та антигенні властивості, перспективність застосування цих сполук у
діагностиці захворювань стафілококової етіології.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Тейхоєва кислота була виділена з клітинної стінки Staphylococcus aureus
штаму Wood-46 за методикою А. Р. Арчібальда [1975]. Очистку препарата
проводили за допомогою іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі
[Шашков, 1997]. Тестування фракцій проводили за аналізом вмісту фосфору
і світлопоглинанням при довжині хвилі 260 нм. Подальший аналіз
препаратів тейхоєвої кислоти проводили за допомогою методів кислотного
гідролізу та тонкошарової хроматографії [Стрешинская, Козлова, 1996].
Кисневозалежний метаболізм фагоцитуючих клітин визначали шляхом
постановки тесту відновлення нітросинього тетразолію згідно методики
[Muller, Rolland, 1989]. При дослідженні впливу тейхоєвої кислоти на
протипухлинну цитолітичну активність природних кілерних клітин та
специфічну протипухлинну активність лімфоцитів об`єктом дослідження була
фракція лімфоцитів селезінки мишей [Фільчаков, 1998].
Цитотоксичний тест проводили в круглодонних планшетах для імунологічних
досліджень за методикою А. П. Шпакової [2000].
Антисироватки одержували шляхом три- та п`ятиразової імунізації мишей
ліній BALB/C та C57BL тейхоєвою кислотою та кон`югатом тейхоєва кислота
– овальбумін в дозі 50 мкг на тварину за розробленою нами схемою. Кров у
тварин забирали через 7 діб після першої, третьої та п`ятої імунізації,
потім – через 14 діб і на 21-шу добу після імунізації. Титр і
специфічність імунних сироваток визначали методом ELISA. Дослідження
динаміки гуморальної імунної відповіді і визначення специфічних антитіл
до тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus у сироватці крові хворих на
інфекційний ендокардит, гайморит та отит також проводили за допомогою
імуноферментного аналізу [Єгоров, 1991].
Розробку тест-системи на основі імуноферментного аналізу [Єгоров, 1991]
проводили у наведеній нижче модифікації.
Для розробки діагностичної тест-системи було опрацьовано оптимальні
умови його проведення: оптимальні концентрації антигену, буферні розчин
для його адсорбції, кількість антигену, що вносили в лунку (50 та 100
мкг). Було апробовано фосфатний та Na-бікарбонатний буферні розчини;
концентрації антигену становили 1, 5 та 10 мкг/мл.
Імуноферментний аналіз проводили у 96-ти лункових плоскодонних
планшетах. Антиген вносили в концентрації 5 мкг/мл у фосфатному буфері,
рН=7,4 по 100 мкл в лунку та інкубували протягом години при 37(С. Вільні
місця зв`язування на планшетах блокували 1%-вим розчином бичачого
сироваткового альбуміну (БСА) в фізіологічному розчині NaCl,
забуференому фосфатами (ЗФР), рН=7,4 впродовж години при 37(С. Після
кожної інкубації планшети чотири рази відмивали 0,1%-вим розчином
твіну-20 в ЗФР, рН=7,4 при перемішуванні. Потім вносили досліджувані
сироватки крові, розведені у твін-фосфатному буфері (ТФБ) – 0,05%-вому
розчині твіну-20 у ЗФР, по 100 мкл у лунку та інкубували впродовж години
при 37(С. На наступному етапі планшети відмивали, в описаному вище
режимі, та вносили кон(югат антитіл проти імуноглобулінів людини,
мічений пероксидазою хріну, у робочому розведенні 1:800 (в ТФБ) по 100
мкл в лунку. Планшет інкубували протягом 2 год при 37 SYMBOL 176 \f
“Symbol” \s 14 ° С та знову відмивали. Далі для проявлення реакції
вносили розчин хромоген-субстрату по 100 мкл в лунку, що містив 0,5
мг/мл ортофенілендіаміну і 0,013% перекису водню. Зупиняли реакцію
внесенням 2М H2SO4 по 50 мкл в лунку. Реакцію реєстрували, вимірюючи
оптичну густину розчину, за довжини хвилі 492 нм на приладі MR-508
Microelisa Auto Reader, Dynatech Product.
Для оцінки ефективності і специфічності розробленої діагностичної
тест-системи було проаналізовано 60 зразків сироваток крові хворих на
гнійний гострий гайморит та отит (30 осіб) і ендокардит (30 осіб). Для
контролю дослідили зразки сироваток 30 здорових людей. Стафілококову
етіологію захворювання встановлювали на основі клінічних спостережень,
даних анамнезу і підтверджували виділенням клітин Staphylococcus aureus
з урахуванням його патогенних властивостей. Функціональний стан
щитоподібної залози оцінювали за методом [Киримов, 1994].
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
1. Вплив тейхоєвої кислоти на метаболічну активність перитонеальних
макрофагів мишей in vitro.
При дослідженні впливу тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus на
макрофаги перитонеального ексудату мишей in vitro нами встановлено, що
обробіток фагоцитуючих клітин черевної порожнини інтактних мишей
тейхоєвою кислотою у концентрації 50 мкг/мл підсилював метаболічну
активність макрофагів у нестимульованому НСТ-тесті, збільшуючи
активність, приблизно, вдвічі, порівняно з контролем. Нижчі концентрації
кислоти (5 та 0,5 мкг/мл) вірогідно підвищували активність макрофагів
перитонеального ексудату мишей порівняно з дозою 50 мкг (прямий
дозозалежний ефект) (табл. 1.).
Таблиця 1
Дія тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus на функціональну активність
макрофагів мишей in vitro.
Примітка * – вірогідно при р ?oL
?
?
?
гуморальної імунної відповіді на тейхоєву кислоту.
Нами встановлено, що тейхоєва кислота стимулювала утворення антитіл
переважно у мишей лінії C57BL після три- та п(ятиразової імунізації. Так
титр антитіл після триразової імунізації на 7-му добу становив 1:200, на
14- ту - зростав до 1: 800, а на 21-шу - спадав до 1:100 (рис. 2а).
Повторна імунізація викликала істотне підвищення титру (рис.2б). Після
п(ятиразової імунізації на 7-му добу цей показник становив 1:200; через
14 діб він зростав до 1:1600, що можна пояснити феноменом імунної
пам(яті, в основі якого лежить здатність лімфоїдних клітин до підсиленої
реакції на даний антиген при повторному контакті з ним; на 21-шу добу
він становив 1:100.
а
б
Рис. 2. Динаміка рівня специфічних антитіл у сироватці крові після
триразової (а) та п`ятиразової (б) імунізації мишей ліній C57BL та
BALB/C тейхоєвою кислотою стафілокока в дозі 50 мкг.
При дослідженні імунної відповіді у мишей лінії ВАLB/C не вдалося
виявити високих титрів антитіл, специфічних до тейхоєвої кислоти, навіть
після 5-ти разової імунізації. Таким чином, дана кислота є слабким
індуктором формування імунної пам( яті у мишей цієї лінії.
Динаміка гуморальної імунної відповіді на кон(югат тейхоєвої кислоти з
овальбуміном після триразової імунізації була подібною до динаміки
гуморальної відповіді на тейхоєву кислоту. При цьому кон(югат проявляв
більш виражені імуногенні властивості, ніж сама кислота (рис.3 а).
Нами встановлено, що титр антитіл до кон’югату на 7-му добу після
триразової імунізації становив 1:400 із наступним підвищенням на 14-ту
добу до 1:1600 та зі зниженням на 21-шу - до 1:200. Повторна імунізація
мишей кон(югатом овальбумін – тейхоєва кислота у дозі 50 мкг призводила
до істотного підвищення рівня сироваткових антитіл. На 14-ту добу титр
зростав до 1: 3200, а на 21-шу - знизився до 1:400 (рис.3 б).
а
б
Рис. 3. Динаміка рівня специфічних антитіл у сироватці крові після
триразової (а) та п`ятиразової (б) імунізації мишей ліній C57BL та
BALB/C кон`югатом овальбумін-тейхоєва кислота стафілокока в дозі 50 мкг.
Узагальнення одержаних результатів свідчить про те, що тейхоєвій кислоті
притаманні імуногенні властивості. До її антигенної дії високу
чутливість виявили миші лінії С57BL, тоді, як миші лінії ВАLB/C – є
низькочутливими.
4. Створення імуноферментної тест-системи на основі тейхоєвої кислоти
Staphylococcus аureus для діагностики інфекційного ендокардиту,
гаймориту та отиту стафілококової етіології.
За допомогою імуноферментного аналізу вияляли специфічні антитіла у 100%
обстежених пацієнтів. Визначення титрів цих антитіл у сироватках
показало, що у 25,4% хворих на стафілококовий ендокардит титр
специфічних антитіл до тейхоєвої кислоти становив 1:200, у 11,1% –
1:400, у 33,3% - 1:800 та у 20% - 1:1600, у 10,2% - 1:3200 (рис. 4). У
контрольній групі у 16,7% обстежених цей титр становив 1:25, у решти -
1:50.
На підставі аналізу вказаних даних було визначено середні титри антитіл
у сироватці хворих на стафілококовий ендокардит - 1:1240 та здорових
людей - 1:38 (рис. 5), і зроблено висновок, що для діагностики
ендокардиту стафілококової етіології мають значення титри від 1:200 і
вище.
Рис. 4
Рис. 4
Рис. 5
Рис. 4. Результати аналізу сироваток хворих на ендокардит за допомогою
імуноферментного аналізу.
Рис. 5. Середні титри антитіл до тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus
у сироватці крові здорових осіб та хворих на стафілококовий ендокардит.
Досліджували можливість застосування запропонованої тест-системи для
діагностики інших захворювань стафілококової етіології, зокрема
гаймориту та отиту. При аналізі сироваток хворих на гайморит і отит
тільки у 60% обстежених було виявлено специфічні антитіла, та визначено
їх титр (рис. 6). Встановлено, що титр специфічних антитіл у 30%
обстежених становив 1:100, у 18 % - 1:200 та у 12% - 1:400. У
контрольній групі у 16,7% обстежених цей титр становив 1:25, у решти -
1:50. Середній титр антитіл (рис. 7) у контрольній групі становив 1:38,
тоді як в групі хворих він сягав 1:233.
Рис. 6
Рис. 7
Рис. 6. Результати аналізу сироваток хворих на гострі гнійні гайморит та
отит за допомогою імуноферментного аналізу
Рис. 7. Середні титри антитіл до тейхоєвої кислоти Staphylococcus aureus
у сироватці крові здорових осіб і хворих на гайморит та отит
стафілококової етіології.
Ці дані свідчать про те, що дана тест-система може бути застосована для
діагностики гаймориту та отиту стафілококової етіології лише як
допоміжна в комплексі з іншими методами.
Порівняльний аналіз титрів антитіл у різних піддослідних групах дозволив
визначити межу чутливості розробленої тест-системи. Титр антитіл до
тейхоєвої кислоти у сироватці крові здорових людей (контрольна група)
коливався від 1:25 до 1:50 (в середньому - 1:38), а у хворих – в
середньому становив 1:400 і коливався в межах від 1:300 до 1:1600. Саме
цей рівень ми вважаємо діагностично значимим при захворюванні на
ендокардит.
Визначення рівня антитіл до тейхоєвої кислоти в сироватках крові хворих
різних груп показало, що діагностично значимі титри (>1: 400)
зустрічаються переважно у групі хворих на стафілококовий ендокардит
(79,9%), однак виявлені і у частини (12,0%) хворих на гайморит та отит.
Низькі значення титрів антитіл до тейхоєвої кислоти (
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
