ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА
ВОРОБЕЦЬ НАТАЛІЯ МИКОЛАІВНА
УДК 577.152.1: 577.152.2:157.175.1: 547.979.8: 546.81:546.23
Ендогенні механізми формування стійкості рослин до дії свинцю за участю
аскорбат-глутатіонової системи
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Чернівці – 2004
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті
імені Данила Галицького та Львівському
національному
університеті імені Івана Франка
Науковий консультант – академік УААН, доктор біологічних наук, професор
СНІТИНСЬКИЙ Володимир Васильович, Львівський державний аграрний
університет, завідувач кафедри біології та агроекології, ректор
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Мещишен Іван Федорович,
Буковинська державна медична
академія,
завідувач кафедри медичної хімії
член-кор. НАН України, доктор
біологічних наук, професор
Блюм Ярослав Борисович,
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії,
завідувач відділом клітинної біології та біотехнології,
заступник директора з наукової роботи
доктор біологічних наук, професор
Вінниченко Олександр Миколайович,
Дніпропетровський національний
університет,
завідувач кафедри фізіології рослин
і екології,
директор НДІ біології
Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ
Захист відбудеться 17 березня 2004 р. о 12.00 годині на засіданні
спеціалізованої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому національному
університеті імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі Українки (ІІІ
корпус університету, аудиторія
№ 81), м. Чернівці, 58012, Україна
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Чернівецького
національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі
Українки, 23, Чернівці, 58012, Україна
Автореферат розісланий 16 лютого 2004 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Г.П. Копильчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Свинець належить до елементів, потреба яких для
живих організмів, зокрема для рослин, не доведена, однак він
зустрічається у складі всіх рослин. У ряді регіонів України
забрудненість ґрунтів свинцем, в т.ч. рухомими формами, перевищує
допустимі рівні в 1,5 – 14 разів (Костишин та інш., 1995; Мусієнко та
інш., 2002; Руденко та інш., 1997; Тютюнник, Горлицкий, 1998). Найбільшу
небезпеку для біоти становлять розчинні та рухомі форми свинцю, частка
яких від 25 до 76 % від загальної кількості. Потрапляючи в організм
рослини, свинець по ланцюгах живлення надходить до організмів тварин і
людини, викликаючи значні порушення їх метаболізму. У наш час існує не
лише необхідність вивчення екологічної ситуації, а й уміння протидіяти
розвиткові забруднення природного оточуючого середовища сполуками важких
металів. Погіршення екологічної ситуації істотно загострює проблему
доконечного вивчення механізмів, за участю яких рослини можуть
запобігати проникненню свинцю або уникати його шкідливої дії. Для
нормального протікання біохімічних процесів у рослинному організмі є
діапазон концентрації іонів свинцю, перевищення яких модулює низку
негативних для метаболізму реакцій. Свинець належить до екологічних
чинників, дія яких викликає в рослин стрес (Morange, 1997). Однією з
реакцій на стрес є продукція активних форм кисню (АФК) (Inze, Van
Montagu, 1995; Davies, 1998; Jamieson, 1998; Hancock, Neill, 1999;
Барабой, Сутковой, 1997; Меньщикова, Зенков, 1993; Willekens et
al.,1997; Rucinska et al., 1998), які здатні ініціювати пероксидне
окиснення ліпідів та білків, започатковувати нові ланцюги
вільнорадикальних процесів. Захист від АФК здійснюється на різних рівнях
і приводить до нейтралізації АФК та/або відновлення продуктів окисного
пошкодження ДНК, білків, ліпідів (Барабой, Сутковой, 1997;
Modaras-Ferreira et al., 1996).
Зміна активності ферментів є первинним проявом стресу від надлишку іонів
важких металів, що зумовлює каскад інших, вторинних, ефектів:
гормональний дисбаланс, дефіцит необхідних елементів, інгібування
фотосинтезу та азотного обміну, зміну водного режиму тощо, які в свою
чергу збільшують гальмування росту рослин (Блюм, 2002, 2003; Костишин та
інш., 1997; Мусієнко, Таран, 1997; Smirnoff, 1998; Klobus et al., 2002).
Здатність ферментних систем знешкоджувати наслідки впливу іонів
важких металів або пристосуватись шляхом зміни конформації молекули
забезпечує підтримання гомеостазу рослинного організму. Знання
біохімічних механізмів, які лежать в основі реакції рослин на дію іонів
свинцю, та забезпечення їх стійкості мають суттєве значення для
розуміння фундаментальних основ адаптації, розробки підходів для
одержання стійких сортів і форм рослин, використання стійких видів з
метою фіторемедіації.
Усе викладене стало підставою для дослідження механізмів стійкості
рослин до дії іонів свинцю та способів впливу на них з метою корекції.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є
частиною наукових тематик: Бс 322Б „Світло-лазерна фотоактивація росту
рослин”, № 0197U018119 держреєстрації; Бр 462Б “Відбір
фізіолого-біохімічних маркерів стресу в рослин до дії промислових
ксенобіотиків”, № 0193U041333 держреєстрації; “Регуляторна роль іонів
кальцію у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи клітин”,
№ IH.07.00.0001.04 держреєстрації та Українсько-угорського проекту
„Вивчення мобілізації, акумуляції, поширення і біоремедіації важких
металів у забруднених екосистемах верхнього басейну ріки Тиса”, №
М/490-2003 держреєстрації.
Мета і задачі дослідження. З’ясувати особливості функціонування
антиоксидантної системи проростків квасолі та соняшника за умов дії
іонів свинцю, як складової частини ендогенних механізмів формування
стійкості рослин, а також можливості екзогенної регуляції процесу іонами
селену та абсцизовою кислотою (АБК).
Для досягнення поставленої мети було необхідно:
– дати оцінку змін інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів,
концентрації пероксиду водню в сім’ядолях і зародкових частинах насіння,
а також коренях і пагонах рослин, вирощених за наявності іонів свинцю в
поживному розчині й сумісної їх дії з селенітом, та в комбінації з
абсцизовою кислотою;
– з’ясувати рівні накопичення іонів свинцю в сім’ядолях і зародкових
частинах насіння, а також коренях і пагонах рослин, вирощених за
наявності іонів свинцю в поживному розчині та їх сумісної дії з
селенітом;
– установити водний статус рослин унаслідок дії іонів свинцю і їх
сумісної дії з селенітом, та абсцизовою кислотою;
– установити рівень азотного обміну в рослинах під дією іонів свинцю та
селеніту;
– вивчити зміни фотосинтетичних процесів унаслідок дії іонів свинцю та
селеніту за змінами концентрації фотосинтетичних пігментів і компонентів
віолаксантинового циклу;
– визначити концентрацію глутатіону, аскорбінової кислоти та її
метаболітів у рослинах, вирощених за наявності іонів свинцю в поживному
розчині та за сумісної дії іонів свинцю й селеніту;
– дослідити активність каталази, пероксидази, глутатіонпероксидази,
глутатіонредуктази, глутатіон-S-трансферази, аскорбатпероксидази,
монодегідроаскорбатредуктази, дегідроаскорбатредуктази, аскорбатоксидази
за дії іонів свинцю та їх сумісної дії з селенітом;
– дослідити ефективність екзогенного впливу селеніту та абсцизової
кислоти на біохімічні та фізіологічні процеси в рослин за умов дії на
них іонів свинцю.
Об’єкт дослідження – механізм дії іонів свинцю на рослини соняшника та
квасолі.
Предмет дослідження – показники пероксидного окиснення ліпідів, азотного
обміну та фотосинтезу, активність віолаксантинового циклу, водний
статус, активність ферментів антиоксидантної аскорбат-глутатіонової
системи рослин під дією на них іонів свинцю, а також за умов сумісної
дії з іонами селеніту й абсцизовою кислотою.
Методи дослідження – біохімічні, фізіологічні, фізико-хімічні,
статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження та дано оцінку активності антиоксидантного захисту рослин
унаслідок дії іонів свинцю.
Установлено, що внаслідок дії на рослини іонів свинцю в них змінюється
активність ферментів азотного обміну, концентрація фотосинтетичних
пігментів, зокрема компонентів віолаксантинового циклу.
Показано, що водний статус рослин залежить від впливу на них іонів
свинцю.
Виявлено активацію антиоксидантної аскорбат-глутатіонової системи в
результаті дії низьких концентрацій іонів свинцю і пригнічення її
високими протягом періоду проростання та початкового росту рослин.
Вперше встановлено, що іони селеніту в низьких концентраціях позитивно
впливають на ріст та розвиток рослин, активуючи процеси азотного
метаболізму та фотосинтезу.
Доведено, що за умов дії на рослини іонів свинцю антиоксидантний захист
активується екзогенною дією селеніту та абсцизової кислоти. На поживних
середовищах з ацетатом свинцю абсцизова кислота через активацію
ферментів асиміляції аміаку та відновлення водного статусу стимулює
ростову активність коренів і пагонів рослин.
Вперше виявлено, що інтенсивність проростання насіння рослин за умов
наявності іонів свинцю залежить від рівня вимушеного спокою насіння та
наявності початкового рівня аскорбінової кислоти.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати
поглиблюють уявлення про механізми розвитку стресу в рослин унаслідок
дії іонів свинцю, що відкриває можливість пошуку диференційованого
підходу до подальшого вивчення адаптаційних можливостей рослин.
У результаті проведених досліджень виявлено нові властивості
аскорбат-глутатіонової системи для забезпечення стійкості рослин в
умовах свинцевого навантаження.
Експериментально доведено, що низькі концентрації селеніту натрію
сприяють адаптації рослин до дії іонів свинцю на перших етапах їх росту.
Встановлено, що абсцизова кислота не перешкоджає проникненню іонів
свинцю в органи рослин, однак сприяє адаптації до його дії.
Отримані результати дають змогу добирати види рослин, які, очевидно,
будуть стійкими на ґрунтах з підвищеними концентраціями іонів свинцю з
метою їх застосування для фіторемедіації забруднених ґрунтів.
Матеріали дисертації можуть бути використані в курсах лекцій для
студентів з біохімії та фізіології рослин, екології, фармакогнозії. Вони
стали основою для виконання низки дипломних і курсових робіт студентами
біологічного факультету Львівського національного університету імені
Івана Франка, а також дисертаційної роботи на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук під керівництвом здобувача.
Особистий внесок здобувача полягає в безпосередньому обґрунтуванні
концепції роботи. Автор самостійно розробив дослідницьку програму,
налагодив методики та схеми проведених досліджень і виконав більшість
біохімічних, цитохімічних і фізико-хімічних досліджень (за винятком
визначення мітотичного індекса).
Розроблено та обґрунтовано методичні підходи для вивчення біохімічних
механізмів активності антиоксидантного захисту рослин унаслідок дії
іонів свинцю. Опрацьовано дані літератури, узагальнено одержані
результати, сформульовано висновки та практичні рекомендації.
При сумісному виконанні дослідів із співробітниками Київського
національного університету імені Тараса Шевченка, Інституту фізіології
рослин і генетики НАН України та Львівського національного університету
імені Івана Франка, вони є співавторами відповідних публікацій.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до
дисертації, були представлені на наукових конференціях Львівського
національного університету імені Івана Франка 1997-2002 р., 2nd
Conference on Progress in Plant Breeding to growth Regulation
(Mosonmagyarovar-Hungary, 1998); Міжнародній конференції „Онтогенез
рослин в природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998); The
11th Congress of the Federation of European Societies of Plant
Physiology (Varna, Bulgaria, 1998); (( International Symposium on Plant
Biotechnology (Kyiv, 1998); I Всеукраїнській науковій конференції
„Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах” (Тернопіль,
1998); IV з’їзді товариства фізіологів рослин Росії (Москва, 1999);
Міжнародній конференції „Проблеми сучасної екології” (Запоріжжя, 2000);
((( Congress of the FESPS (Budapest, Hungary, 2000), VII Молодіжній
конференції ботаніків у Санкт-Петербурзі (Санкт-Петербург, 2000);
International scientific conference “Growth, Development and
Productivity of Plants, Theoretical and Practical Problems” (Babtai,
Lituania, 2000); 53-ій науково-технічній конференції студентів та
аспірантів УкрДЛТУ (Львів, 2001); Шостій міжнародній конференції
„Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях” (Москва, 2001);
XI з’їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001); 17th
International Conference on Plant Growth Substances (Brno, Czech
Republic, 2001); International Symposium “Intracellular Signaling in
Plant and Animal Systems (ISPAS)” (Kyiv, 2001); Міжнародної наукової
конференції „Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту
та азотний метаболізм рослин (Тернопіль, 2001); Міжнародній
науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів „Природні
екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород,
2001); Fifth conference on Oxygen, free radicals and oxidative stress in
plants (Nice, France, 2001); VІІІ Українському біохімічному з’їзді
(Чернівці, 2002); III з’їзді Українського біофізичного товариства
(Львів, 2002); 4th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cell
Activation : Biological Signals and Their Target Enzymes” (Wroc?aw,
Poland, 2002); IV Міжнародній науковій конференції „Промислова ботаніка:
стан та перспективи розвитку” (Донецьк, 2003).
Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені в 46
публікаціях, у тому числі 26 статтях (з них – 11 одноосібних), які
опубліковані в наукових фахових виданнях, та у 21 тезах доповідей.
Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, опису об’єкта та методів досліджень, опису отриманих
результатів, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків,
списку використаних джерел (705 назв). Робота викладена на 324
сторінках, містить 60 таблиць, 35 рисунків.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обгрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, завдання
та методи досліджень, розкрито наукову новизну і практичне значення
роботи, зазначено особистий внесок здобувача і апробацію результатів
дисертації.
У першому розділі систематизовано й узагальнено літературні результати
щодо сучасної теорії стресу, проаналізовано експериментальні дані
стосовно механізмів стійкості рослин до дії стресових факторів. Крім
того, проаналізовано дані про вплив іонів свинцю на фізіолого-біохімічні
параметри різних видів рослин, розглянуто участь низькомолекулярних
антиоксидантів і ферментів їх утворення та метаболізму в захисті від
АФК.
Другий розділ присвячений матеріалам і методам дослідження: тут описано
об’єкти дослідження, наведено методи та матеріал дослідження, що
використані в роботі.
Досліди виконані на соняшнику (Helianthus annus L., сорту Світоч та
гібриду Погляд) та квасолі (Phaseolus vulgaris L., сортів Лисецька,
Сперанца, Первомайська, Ювілейна), насіння яких надане Інститутом
рослинництва імені Юр’єва (м. Харків).
Дослідження проводили за двома схемами. За першою схемою насіння
відмивали водою, замочували і пророщували протягом трьох діб у темному
термостаті при +23(С ( 1(С на поживних розчинах різних варіантів. Через
три доби проростки пересаджували у водні культури і продовжували
вирощувати в тих самих поживних розчинах до використання. За другою
схемою насіння відмивали водою, замочували і пророщували протягом трьох
діб у темному термостаті при + 23( ( 1( С на бідистильованій воді.
Через 3 доби проростки пересаджували на поживні суміші різних варіантів.
Пророщували насіння в чашках Петрі або в емальованих кюветах. В обох
схемах дослідів використовували такі варіанти поживних сумішей: водні
розчини ацетату свинцю в концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М; водні
розчини ацетату свинцю у концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М разом з
10-8 М та 10-9 М селенітом натрію; водні розчини ацетату свинцю в
концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М разом з 10-10 М абсцизовою
кислотою. Як контрольні варіанти використовували бідистильовану воду,
розчин Кнопа, а також розчин 10-8 М або 10-9 М селеніту натрію та 10-10
М абсцизової кислоти.
Вивчали енергію проростання, схожість насіння та ріст проростків (у
соняшника через 3 доби – енергію проростання, через 7 діб – схожість; у
квасолі через 4 доби – енергію проростання, схожість – через 8 діб
(Тютюрев, 1949). Приріст маси проростків обчислювали за (Гродзинский,
Гродзинский, 1964), індекс толерантності рослин – за (Wilkins 1978).
Вміст свинцю визначали атомно-адсорбційним методом на спектрофотометрі
С-115 М1 в пропан-бутановому полум’ї з використанням електротермічного
атомізатора “Графіт-2”, а також на атомно-адсорбційному спектрофотометрі
Perkin Elmer model 33000 (Самохвалов и др., 1989). Вміст хлорофілів а та
b і каротиноїдів встановлювали у вихідній витяжці пігментів ацетоном без
попереднього їх розділення (Васильєва, 1978). Визначення вмісту
пероксиду водню проводили колориметрично (Jana, Choudhuri, 1981). Вміст
малонового діальдегіду виявляли за накопиченням у тканинах одного з
кінцевих продуктів – малонового діальдегіду (МДА) у кольоровій реакції з
тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (Health, Packer, 1968). Вимірювали вміст
відновленого глутатіону (Lay, Casida 1976). Концентрацію білка визначали
за методом Лоурі (Lowry, 1951) або за методом Бредфорда (Bradford,
1976). Розподіл іонів свинцю вираховували гістохімічно (Серегин, Иванов,
1997). Лігнін визначали за методом Барської (Барская, 1967). Для
з’ясування водного статусу рослин використовували такі показники, як
водний потенціал, який визначали рефрактометричним методом (Григорюк и
др., 1999), та відносний вміст води (Lazcano-Ferrat, Lovatt 1999). Для
обчислення вмісту аскорбінової, дегідроаскорбінової та дикетогулонової
кислот використовували методи (Соколовский и др., 1974) у модифікації
(Окунцев, Аксенов, 1981). Активність пероксидази (гваяколпероксидази)
(КФ 1.11.1.7) визначали за окисненням гваяколу до тетрагваяколу при 420
нм за наявності Н2О2 (Bisbis et al., 1998). Активність
аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1) та аланінамінотрансферази (КФ
2.6.1.2) – за допомогою 2,4-динітрофенілгідразину (Тищенко, 1978).
Концентрацію аміаку вимірювали мікродифузним методом (Любимов, 1968).
Активність НАДН-глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2.) визначали за
швидкістю окиснення НАДН (Joy, 1969). Активність глутамінсинтетази (КФ
6.3.1.2) – гідроксаматним методом (Евстигнеева и др., 1980). Активність
каталази (КФ 1.11.1.6) визначали спектрофотометрично при 240 нм (Bisbis
et al., 1998). Активність глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9) – за
модифікованою методикою Моіна (Моин 1986). Активність
аскорбатпероксидази (КФ 1.11.1.11) визначали спектрофотометрично за
зменшенням екстинкції при 290 нм при окисненні аскорбату (Shigeoka et
al., 1980; Nakano, Asada, 1981). Активність монодегідроаскорбатредуктази
(КФ 1.6.5.4) – спектрофотометрично за зміною екстинкції при 360 нм
(Miyake, Asada, 1992). Активність аскорбатоксидази (КФ 1.10.3.3)
обчислювали за зміною поглинання при 265 нм внаслідок окиснення
аскорбінової кислоти (Conklin et al., 1997). Активність
глутатіонредуктази (КФ 1.6.4.2) визначали спектрофотометрично (Foyer,
Halliwell, 1976) у модифікації (Vanaker et al., 1998) за зміною
поглинання при 340 нм. Активність дегідроаскорбатредуктази (КФ 1.8.5.1)
визначали спектрофотометрично за зміною поглинання при 265 нм і
утворенням аскорбінової кислоти (Foyer et al., 1989; Miyake, Asada
1992).
Результати вимірів опрацьовували статистично, визначаючи середнє
арифметичне значення (М) та похибку середнього (m). Вірогідність різниці
середніх значень встановлювали за критерієм t Ст’юдента (Плохинский,
1970). Дисперсійний та кореляційний аналіз отриманих результатів
здійснювали з використанням пакета комп’ютерних програм “Microsoft
Office XP”.
У третьому розділі роботи, який складається з семи частин, викладено
результати дослідження та їх обговорення.
Утворення активних форм кисню в рослинах соняшника та квасолі за дії
свинцю, а також при сумісній дії з низькими концентраціями селеніту та
АБК.
Ми виявили, що малоновий діальдегід утворюється в коренях та пагонах
тридобових рослин соняшника на всіх поживних розчинах (табл. 1).
Особливо високий його рівень у коренях рослин, вирощених на обох
концентраціях іонів свинцю та разом із селенітом натрію: 209,4 –225,4
нмоль ( г-1 маси сирої речовини, тоді як у контролі вміст МДА був у 5
разів меншим і становив 42,5 нмоль ( г-1 маси сирої речовини (Р6
d
d
7uuuuuuuouooouuuueoTHTHUII
d
d
d
d
d
d
7?9e9l?3/4@6B>DtE
F?H2I|JL–L(NpOoQnS~UAVOWOeXjZ?]ue_ooooooooooooooooooooooooooo
d
YI§¬?I©°®c±T?iiaaUUOUUCCUUCC3/4???
d
d
`„Ae
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
X?Z???1/4?V?@1/4¶CcEYQQEEEE
d
d
d
d
d
d
^„Ae
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
–
3/4
A
†
?
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
6teridge 1989; Storz et al., 1987; Wolff et al., 1986). В результаті
зростання рівня АФК виникає оксидативний стрес. Тому постійне утворення
АФК в живих організмах урівноважується наявним захистом і їх
дезактивацією антиоксидантами, що дозволяє утримувати АФК на певному
базальному рівні й усувати пошкодження клітин. Для підтримання
гомеостазу потрібна неперервна регенерація антиоксидативної здатності.
Виживання і ріст рослин в умовах свинцевого навантаження може бути
результатом роботи ферментів, які перетворюють пероксид водню, пероксиди
жирних кислот та фосфоліпідів, що при цьому утворюються, до нетоксичних
сполук та наявності низькомолекулярних антиоксидантів. Те, що в органах
тридобових рослин великих кількостей Н2О2 не накопичується, може бути
результатом роботи ферментів їх усунення. Ми показали, що активність
пероксидази в зародкових осях у 4-5 разів вища, ніж у сім’ядолях (рис.
4). Найнижча вона і в зародкових осях, і в сім’ядолях при проростанні
насіння на воді. На інших варіантах досліду активність пероксидази в
сім’ядолях в 4-5 разів вища, ніж на воді, але за значеннями
відрізняється мало. Активність пероксидази в зародкових осях варіанта
10-8 М Pb2+ найнижча, а додавання в розчин 10-9 М SeO32- підвищує
активність на 53%. Селеніт підвищує активність пероксидази на розчині
10-8 М Pb2+ на 28% (Р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
