.

Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
122 8682
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

БІЛАН ПАВЛО ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 612.822:611.813.14

Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних
клітинах

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в відділі загальної фізіології нервової системи
Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор

Кришталь Олег Олександрович,

зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м’язів
Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

доктор біологічних наук,

Жолос Олександр Вікторович,

професор кафедри біофізики Київського Національного університету імені
Тараса Шевченка.

Провідна установа: Національний медичний університет імені
О.О.Богомольця.

Захист дисертації відбудеться “ 22 ” листопада 2005 року о “
14 ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при
Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024,
Київ, вул. акад. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

Автореферат розіслано “ 21 ” жовтня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ВСТУП

Актуальність проблеми.

Внутрішньоклітинний кальцій розглядається у сьогоденні як один з
найбільш універсальних вторинних посередників, що бере участь у передачі
сигналу від структур плазматичної мембрани до внутрішньоклітинних
елементів, які забезпечують відгук клітини на зовнішній стимул QUOTE
“(Petersen, Michalak et al. 2005)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Petersen, Michalak et al.
2005)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\042679(Petersen, Michalak, et al. 2005
2679 /id\00(\00 (Petersen et al. 2005) . Зміни внутрішньоклітинної
концентрації іонів кальцію запускають цитоплазматичні процеси, що лежать
в основі клітинної збудливості, секреції, синаптичної передачі та
скорочення.

Підвищення цитоплазматичного кальцію в секреторних клітинах є
найважливішим кроком у процесі кальцій-залежного єкзоцитозу QUOTE
“(Petersen 1992;Yule, Essington et al. 1993;Petersen 2005)” ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\009(Petersen 1992;Yule, Essington et al.
1993;Petersen
2005)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1
2\00рTъ\01Н‹хwи\06\08\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\16\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwШw\16\02Н‹хwЁ\07\08\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\042678\16Petersen 2005 2678 /id\00\16\00
(Petersen 1992; Yule, et al. 1993; Petersen 2005) QUOTE “” ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03281\15Petersen 1992 281 /id\00\15\00
QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03351$Yule, Essington, et al. 1993 351
/id\00$\00 . Kasai й Augustine показали, що викликане агоністом
підвищення кальцію починається в апікальній частині секреторних клітин й
потім поширюється до базолатеральної частини QUOTE “(Kasai and
Augustine 1990)” ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1A(Kasai and
Augustine
1990)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\13\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03301\1EKasai & Augustine 1990 301
/id\00\1E\00 (Kasai and Augustine 1990) . Нещодавно було показано, що
протягом стимуляції низькими (фізіологічними) концентраціями агоністу,
це підвищення концентрації вільного цитозольного кальцію ([Ca2+]i) є
обмеженим тільки апікальною частиною клітини QUOTE “(Thorn P
1993;Kasai, Li et al. 1993)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00$(Thorn P 1993;Kasai, Li et al.
1993)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1
2\00PЊы\01Н‹хwи\06\07\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00
\00\00\00\003DщwЂw\15\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67
/id\00\1D\00 (Thorn 1993; Kasai et al. 1993) QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03108\14Thorn P 1993 108 /id\00\14\00 .
Недавні експерименти продемонстрували, що короткі застосування високих
доз ацетилхоліну (АХ) також викликали подібні обмежені спайки кальцію,
які не в змозі вторгнутися в ядро. Така обмежена у просторі та часі
форма передачі кальцієвих сигналів вигідна фізіологічно, оскільки вона
допускає їх цільове виникнення і застосування, а також не призводить до
потенційно шкідливих зростань концентрації вільного кальцію в інших
частинах клітини.

Вважається загальносприйманим, що ендоплазматичний ретикулум є головною
кальцій-регулюючою структурою у незбудливих клітинах QUOTE “(Yano,
Petersen et al. 2004)” ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Yano,
Petersen et al.
2004)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\042681$Yano, Petersen, et al. 2004 2681
/id\00$\00 (Yano et al. 2004) . В той же час істотна частина
апікальної області поляризованих ацинарних секреторних клітин (де й має
місце головна частина всіх агоніст-залежних змін [Ca2+]i) зайнята
органелами екзоцитозно-ендоцитозного напрямку (секреторні везикули,
апарат Гольджі, ендосоми) і майже не містить ендоплазматичного
ретикулуму. Вміст вільного кальцію й механізми його регулювання в цих
органелах у значній мірі невідомі. Механізми контролю секреції рідини і
ферментів з ацинарних секреторних клітинах, що викликається
агоніст-залежними локальними цитозольними [Ca2+]i транзієнтами в
секреторному полюсі були, таким чином, неясними. На момент початку
дисертаційної роботи, органели, відповідальні за викид і відновлення
кальцію протягом цього процесу, також були невідомі, як і невідомий був
механізм перезавантаження запасів кальцію в апікальній частині
екзокринних клітин. Регуляція концентрації кальцію в ацинарному люмені
(біля апікальної мембрани) важлива для регулювання ендоцитозу QUOTE
“(Maruyama, Inooka et al. 1993)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\1E(Maruyama, Inooka et al.
1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\17\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0266$Maruyama, Inooka, et al. 1993 66
/id\00$\00 (Maruyama et al. 1993) і ймовірно важлива для
перезавантаження запасів кальцію (особливо запасів, що беруть участь в
обмежених апікальним полюсом змінах концентрації цитозольного кальцію),
теж була невідома. Роль різних механізмів, які можуть брати участь у
регулюванні концентрації кальцію у зовнішньоклітинному люмені усе ще
залишається невстановленою. Інакше кажучи, є дві тісно зв’язані й
важливі області досліджень: органели й механізми, що залучені в змінах
цитозольної концентрації кальцію, та обіг кальцію в секреторній області
цих клітин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології
нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України:
„Розробка біофізичних методів та підходів для реєстрації вивільнення
іонів кальцію з поодиноких клітин”, „Вивчення локалізації вивільнення
іонів кальцію з поодиноких клітин”, „Моделювання дифузії кальцію в
зовнішньоклітинному середовищі”, „Дослідження механізмів синаптичної
передачі у центральній нервовій системі ссавців”.

Мета роботи.

Мета виконаної роботи полягала у дослідженні механізмів кальцієвої
регуляції в екзокринних секреторних клітинах.

Задачі дослідження.

Провести дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають
участь у скоординованій регуляції іонів кальцію в екзокринних клітинах
під час секреції ними ферментів травлення.

Розробити біофізичні методи та підходи, які дозволять реєструвати
вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул та вимірювати
кількість іонів кальцію, звільнених окремими ізольованими клітинами або
кластерами секреторних клітин.

Розробити біофізичні методи та підходи для візуалізації місць
вивільнення або захоплення іонів кальцію на поверхні ізольованих клітин
або невеликих клітинних кластерів та математичну модель дифузії і
буферування іонів кальцію у навколоклітинному середовищі після їх
вивільнення з окремих клітин.

Оцінити можливості нових методів для оцінки малих кальцієвих вхідних
потоків, викликаних вивільненням іонів кальцію з внутрішньоклітинних
кальцієвих депо.

Дослідити, чи є окремі секреторні гранули кальцієвими
внутрішньоклітинними депо у екзокринних клітинах.

Вивчити локалізацію вивільнення іонів кальцію з ацинарних клітин та
визначити молекулярні системи, що можуть відповідати за це вивільнення.

Дослідити просторове розподілення кальцієвих насосів плазматичної
мембрани в ацинарних клітинах підшлункової залози на рівні поодиноких
клітин.

Знайти зв’язок між просторово-часовими змінами внутрішньоклітинної
концентрації іонів кальцію та змінами виходу іонів кальцію з
панкреатичних ацинарних клітин.

Оцінити на прикладі секреторних клітин слинних залоз вклад секреції, як
можливого основного механізму, у процес виведення кальцію з екзокринних
клітин.

Наукова новизна отриманих результатів.

У роботі вперше були розроблені нові біофізичні методи, які дозволяють
кількісно реєструвати вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних
везикул, а також вимірювати кількість іонів кальцію, звільнених або
захоплених окремими ізольованими клітинами або невеликими клітинними
кластерами під час роботи різних кальцій-регулюючих систем плазматичної
мембрани. Нами також були розроблені нові біофізичні методи візуалізації
місць вивільнення іонів кальцію на поверхні поодиноких ізольованих
клітин або їх невеликих кластерів. У роботі вперше проведено дослідження
локалізації вивільнення іонів кальцію з панкреатичних ацинарних клітин і
ацинарних клітин слинних залоз та визначені молекулярні системи, що
відповідають за це вивільнення. Автором вперше показано, що окремі
секреторні гранули є кальцієвими внутрішньоклітинними депо. Дана робота
вперше характеризує як кількість, так і кінетику вивільнення кальцію
шляхом екзоцитозу на рівні одиночної клітини та у порівнянні із
вивільненням кальцію за допомогою мембранних кальцієвих насосів.
Встановлено, що вивільнення кальцію у екзокринних клітинах може мати
місце як шляхом екструзії, так і через екзоцитоз і, у деяких випадках,
основна частина кальцію вивільняється за допомогою останнього механізму.
Вперше показано зв’язок між просторово-часовими змінами
внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію та змінами виходу іонів
кальцію з панкреатичних ацинарних клітин. Розроблена математична модель
дифузії іонів кальцію у навколоклітинному середовищі після їх
вивільнення з окремих клітин.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Результати, які отримані в роботі, мають як фундаментальне, так і
практичне значення. Дослідження механізмів кальцієвої регуляції
секреторних клітин істотно допомагають розумінню механізмів екзотитозу
як у різноманітних секреторних, так і в нервових клітинах. Вони
збагачують знання, що стосуються вивільнення іонів кальцію з окремих
секреторних везикул та різних внутрішньоклітинних кальцієвих депо.

Нові розроблені методи дозволяють вимірювати як кальцієві потоки з
поодиноких клітини (і навіть окремих секреторних гранул) так і
просторове розподілення цих потоків. Методи дозволяють легко вимірювати
просторові властивості кальцієвого потоку навіть настільки малого як
0.01-0.02 фентамоль/cек з просторовим розрізненням у декілька
мікрометрів. Таким чином, ці новітні методи можуть бути застосовані для
досліджень широкого спектру фізіологічних та патологічних явищ у різних
типах клітин. Наприклад, використовуючи нові методи, ми змогли
продемонструвати, що секреторний полюс секреторних клітин є головним
місцем для кальцієвого витоку під час дії агоністів. Практичне значення
отриманих результатів полягає в тому, що вони дозволяють зрозуміти, які
саме механізми внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу відіграють
головну роль у процесах секреції в тих чи інших клітинах, що пов’язано з
кращим розумінням етіології таких тяжких захворювань, як гострий та
хронічний панкреатити.

Отримані в роботі дані та їх інтерпретація можуть стати основою для
розробки високоселективних фармакологічних підходів до лікування
гострого та хронічного панкреатитів та різноманітних захворювань слинних
залоз.

Особистий внесок здобувача.

Автор поставив задачі досліджень і розробив нові методики реєстрації
вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул, а також
вивільнення або захоплення іонів кальцію окремими ізольованими клітинами
або кластерами секреторних клітин. Автор розробив нові методи
візуалізації місць вивільнення іонів кальцію на поверхні клітин, а також
самостійно виконував основну частину експериментів пов’язаних з
дослідженнями процесів секреції у ацинарних клітинах підшлункової та
слинних залоз, здійснював аналіз, статистичну обробку й узагальнення
результатів.

Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами
опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України: академіком П.Г.Костюком, завідуючим відділом
Фізіології Ліверпульського університету (Велика Британія) професором
O.H. Петерсеном, завідуючим лабораторією кальцієвої сигналізації
Національного інституту здоров’я (США) доктором Д.В. Патні, професором
Ліверпульського університету О.В. Тепікіним, докторами цього ж
Університету О.В.Герасименко, Ю.В. Герасименко, Д. Гарднер, доктором Д.
Біордом та кандидатами біологічних наук О.Е. Сафтенку і В.В. Сницаревим.

Апробація результатів дисертації.

Усі матеріали дисертації докладено на семінарах Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України, а також на міжнародних симпозіумах і
з’їздах: щорічних конференціях Американського Товариства Нейронаук, США
(Новий Орлеан, 1997; Лос Анжелес, 1998; Майями, 1999; Сан Дієго, 2001;
Орландо, 2002; Новий Орлеан, 2003, Сан Дієго 2004); щорічних
конференціях Американського Біофізичного Товариства, США (Балтимор 1999;
Новий Орлеан, 2000;); Ювілейній школі IBRO (Ялта, Україна, 2004), а
також на засіданнях сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України, 2000, 2001, 2002, 2003 и 2004 років.

Публікації.

За результатами роботи опубліковано 24 стаття у провідних вітчизняних і
закордонних журналах і 12 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів
досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих
результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 380
найменувань. Робота викладена на 322 сторінках, містить 4 таблиці та
проілюстрована 84 рисунками.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ізоляція клітин, їх навантаження кальцієвими індикаторами та вимірювання
трансмембранних кальцієвих потоків за допомогою конфокальної мікроскопії

Шматочки підшлункової залози миші обробляли чистою колагеназою для того,
щоб отримати одиночні ацинарні клітини чи малі (по 2-10 клітин)
кластери, як це вже було описано раніше QUOTE “(Belan, Gerasimenko et
al. 1997)” ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et
al.
1997)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03333’Belan, Gerasimenko, et al. 1997 333
/id\00’\00 (Belan et al. 1997) . Для деяких експериментів, які
безпосередньо описані у розділі “Результати”, клітини навантажували
флуоресцентним індикатором – Fura Red (Molecular Probes, США) протягом
30 хвилин при кімнатній температурі, як це вже було попередньо описано
щодо методики навантаження fura-2 QUOTE “(Belan, Gerasimenko et al.
1997)” ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al.
1997)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03333’Belan, Gerasimenko, et al. 1997 333
/id\00’\00 (Belan et al. 1997) . Суспензії ізольованих клітин, як
навантажених Fura Red, так і не навантажених, або кластери клітин,
поміщали у маленьку експериментальну камеру (приблизно 200 мікролітрів),
яка в нормі містила безкальцієвий розчин із 1,5-5,0 мкM декстрану,
зв’язаного із Ca2+-чутливим барвником. В більшості дослідів
використовувався барвник Calcium Green-1, зв’язаний із декстраном
(молекулярна вага 500.000, Molecular Probes, США). Концентрація вільного
Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині у таких умовах становила приблизно
0.2-0.4 мкM. Значна відмінність у спектрах емісії Calcium Green-1
декстрану та Fura Red дозволила нам спостерігати одночасно за змінами як
внутрішньоклітинної так зовнішньоклітинної концентрацій Ca2+.
Флуоресцентні сигнали від внутрішньоклітинного та зовнішньоклітинного
барвників реєстрували, використовуючи конфокальний мікроскоп Noran
Odyssey (Noran Instruments, США) із довжиною хвилі збудження 488 нм та
довжиною хвиль емісії 530 і 650 нм для Calcium Green-1 декстрану і Fura
Red відповідно. Одночасно із реєстрацією зображень, флуоресцентні
сигнали отримували у кількох місцях, які нас цікавили. Ці місця, бокси,
розміщували у різних зонах конфокальної площини та усереднені
флуоресцентні сигнали від цих боксів записували як функцію часу.

Всі зображення аналізували та обробляли за допомогою програмного
забезпечення 2D Intervision Analysis Software (Noran Instruments, США).

Аплікацію агоніста робили або шляхом додавання малої краплі
висококонцентрованого маточного розчину агоніста, або шляхом іонтофорезу
із мікроелектроду (у цьому випадку другий електрод поміщали у
експериментальну камеру). Тривалість іонофорезу становила від 5 до 50
сек. Струми іонофоретичної ін’єкції становили від 10 до 100 нА.

Зовнішньоклітинний розчин містив (у мМ): NaCl 140, MgCl2 0.66-1.13, KCl
4.7, Hepes 10, глюкоза 10; pH 7.2 із NaOH.

Для експериментів із фотолабільними хелаторами кальцію (NP-ЕGТА) клітини
навантажували шляхом їх інкубації із ацетоксіметильною формою цієї
речовини (концентрація NP-ЕGТА у розчині 5 мкM) протягом 30 хвилин при
кімнатній температурі. Як зазначалося вище, в інкубаційний розчин
додавали 1 мМ CaCl2. Після навантаження клітини двічі центрифугували та
ресуспендували у безкальцієвому розчині. Спалахи ультрафіолету (УФ) (1-4
сек) для виділення кальцію із зв’язаних фотолабільних хелаторів робили,
використовуючи УФ лазер конфокального мікроскопа. У цих експериментах
реєстрація флуоресценції переривалася на кілька секунд (на час,
необхідний для того, щоб відкрити та закрити шторку УФ лазеру) для того
щоб не пошкодити фото помножувачі конфокального мікроскопу.

Індикатори Ca2+ та NP-ЕГТА поставлялися фірмою Molecular Probes (Eugene,
США). Всі інші реактиви поставлялися фірмою Sigma (Dorset, Велика
Британія). Експерименти проводили при кімнатній температурі.

Приготування секреторних гранул, їх навантаження кальцієвими
індикаторами та вимірювання вивільнення з них за допомогою конфокальної
мікроскопії

Миші забивалися шляхом цервікальної дислокації та ізольована підшлункова
залоза із двохмісячних мишей промивалася холодним буфером А на льоду (10
мМ MOPS-Tris pH 6.8, 0.1 мМ МгSO4, 3 мМ АТФ, 250 мМ сахарози, 0.5 мг/мл
інгібітору трипсину, 1 мг/мл альбуміну із бичачої сироватки). Потім
підшлункову залозу обережно розсікали та гомогенізували у буфері А,
використовуючи тефлонові або скляні гомогенізатори. Секреторні гранули
отримували із гомогенізованої тканини, як це вже було описано (Rogers et
al. 1987), але із певними модифікаціями. Ядра та клітинні залишки
видаляли центрифугуванням при 1000 g протягом 10 хв.; супернатант
центрифугували при 2500g протягом 10 хв. Отриманий білий осад
ресуспендували у буфері B (135 мМ KC1, 10 мМ MOPS-Tris, pH 6.8, 0.1 мМ
МгSO4, 3 мМ АТФ, 1 мг/мл альбуміну із бичачої сироватки, 0.1 мг/мл
інгібітору трипсину). Для того, щоб пофарбувати фракцію секреторних
гранул, їх інкубували із 1 мкМ Mag-fura Red AM протягом 7 хвилин при
20oC. Після фарбування Mag-fura Red проводили два послідовні етапи
центрифугування у буфері B для того, щоб відмити залишки
зовнішньоклітинної Mag-fura Red. Всі етапи намагалися виконувати
якнайшвидше при температурі 0-4oC. Використовували ?-амілазу із
діагностичного набору Sigma; загальний білок визначали за методом Лоурі
при використанні альбуміну сироватки бика як стандарту.

Ми поміщали 10 мікролітрів препарату секреторних гранул у
експериментальну камеру і добавляли до них калієві солі кальцієвих
індикаторів fluo-3 або indo-1 для того щоб отримати 100 мікромолярну
концентрацію цих флуоресцентних індикаторів і кальцієвих буферів для
вимірів концентрації кальцію у позагранулярному середовищі. Вторинні
кальцієві посередники IP3 та cADP рибоза добавлялися до гомогенату
гранул для отримання їх фінальної концентрації на рівні 5-25 мкМ. СаCl2
та EGTA добавлялись до гомогенату наприкінці кожного експерименту для
того, щоб відкалібрувати кальцієві відповіді у позагранулярному
середовищі. Гранули напружені Mag-fura Red були використані як у
експериментах з гранулярними суспензіями так і у експериментах з
поодинокими гранулами. Для експериментів з поодинокими гранулами 10
мікролітрів препарату секреторних гранул розбавлялися до 100 мкл з
використанням буферу В, що містив 100 мкМ EGTA і поміщали цей розчин у
експериментальну камеру. IP3 та cADP рибоза були добавлені або
ін’єковані іонофоретично у позагранулярне середовище у цьому наборі
експериментів. Іономіцін (20 мкМ) або А23187 (20 мкМ) з 1 мМ EGTA та 10
мМ СаCl2 були використані для калібрування внутрішньо гранулярних змін
концентрації кальцію наприкінці кожного експерименту. Всі виміри кальцію
виконувались при кімнатній температурі з використанням конфокальної
системи Noran Odyssey (Noran Instruments, США) об’єктивів x20 та x100
(Nikon, Японія). Режим сумації 128 окремих зображень був використаний у
експериментах з поодинокими гранулами для підвищення співвідношення
сигнал/шум.

Вимірювання вивільнення іонів кальцію із поодиноких клітин за допомогою
методу крапельки.

Головна ідея методу крапельки – це утримання клітини у дуже маленькій за
об’ємом крапельці зовнішньоклітинного розчину. Об’єм такої крапельки
повинен бути настільки малим, щоб кількість кальцію вивільненого із
ізольованої клітини була достатньою для того, щоб викликати такі за
величиною зміни зовнішньоклітинної концентрації кальцію, які можна було
б виміряти. Крапельку утворюють на поверхні силіконізованого покровного
скла та покривають мінеральною олією для того, щоб запобігти швидкому
випаровуванню. Клітину та зовнішньоклітинний розчин наповнюють
індикаторами кальцію різних типів. Оптичні характеристики цих
індикаторів підбирають таким чином, щоб надати можливість синхронних
вимірів внутрішньоклітинної та зовнішньоклітинної концентрацій кальцію.
Клітина у крапельці може при цьому стимулюватися агоністами, які
прикладають через мікропипетки, вставлені у крапельку. Оцінка об’єму
клітини та крапельки дозволяє експериментатору виміряти всі зміни
загальної концентрації кальцію як у клітині так і у крапельці.

Вимірювання вивільнення іонів кальцію із поодиноких клітин за допомогою
важких декстранів.

Експерименти по вимірюванню вивільнення Ca2+ за допомогою важких
декстранів є технічно набагато простішими, ніж вимірювання вивільнення
кальцію із використанням методу краплинки. Перевагою такого типу
експериментів є те, що на рівні одиночної клітини реєструється не тільки
загальна кількість виділення кальцію, але і її локальна інтенсивність.

Ми сповільнювали поширення кальцію із місця вивільнення за допомогою
кальцієвого буфера із великою молекулярною вагою (Calcium Green-1,
декстран, МW 500.000) який одночасно використовувався як кальцієвий
індикатор. Це створило необхідні умови для локалізації місць вивільнення
кальцію за допомогою конфокального мікроскопа.

Для експериментів готували зовнішньоклітинний розчин, який містив 30-100
мкМ кальцій-чутливого барвника, зв’язаного із декстраном. Для підвищення
чутливості методики із використанням Calcium Green-1 декстрана, цей
декстран був єдиним кальцієвим буфером у зовнішньоклітинному розчині.

Після цього ізольовані клітини відмивали у безкальцієвому розчині та
ресуспендували у безкальцієвому розчині, який містив Calcium Green-1
декстран. 200 мкл клітинної суспензії наливали у експериментальну камеру
і рзміщували камеру на столику конфокального мікроскопу. У разі
довготривалого експерименту (більше, ніж 10 хв.), розчин вкривали
мінеральною олією.

Для стимуляції клітин агоністами використовували локальну їх аплікацію.
Наприклад, мікроелектрод заповнювали розчином із 10 – 20 мМ АХ. При
цьому опір мікроелектрода становив 40 – 50 МОм при заповненні його 1М
КСl. В експериментальну камеру вносили інший електрод (срібну дротину,
вкриту AgCl). Прикладали постійний струм, що не дозволяв АХ виходити з
мікроелектрода (5 – 10 нА). Розміщували кінчик електрода на відстані 50
– 100 мкм від групи клітин, які планували стимулювати. Для стимуляції
клітин прикладали вхідний струм у зворотному напрямку (у наших
експериментах – 10 – 100 нА).

Аналіз даних. Аналіз даних та зображень виконували з використанням
аналітичних програмних продуктів: 2D Intervision Analysis Software,
Noran Instruments, США; QuantiCell, Applied Imaging, UK; Tida HEKA
Electronics, Germany; Origin 3.54, Microcal Software, США; Excel 2000,
Microsoft, США). Як що не вказано іншого, результати представлені як
середні значення ± середньоквадратична похибка при обсязі вибірки n.
Вірогідність розходжень між значеннями визначали за критерієм
t-Стьюдента. Різницю вважали достовірною при р 590 нм). Області із
гранулами вибиралися при використанні режиму прохідного світла
конфокального мікроскопу. Для експериментів вибиралися ділянки, що мали
зображення темних круглих частинок із діаметром приблизно 1 мкм. На рис.
2 A-C показані результати експерименту, у якому одночасне вимірювання
флуоресценції проведене для шести ізольованих гранул у полі зору.
Вибрані для вимірювання флуоресценції ділянки співпадали із яскравими
часточками такого ж розміру, що і темні у прохідному світлі. Виміряна
концентрація вільного Ca2+ всередині одиночних гранул становила 50 + 1
мкМ (n = 70). IP3 інжектували у середовище поблизу гранул, які були
вибрані для експерименту, і це спричиняло зниження у них
інтрагранулярної концентрації вільного Ca2+ на 25 + 3% (n = 30) (рис.
2A). Подібні ж відповіді отримували, використовуючи ін’єкцію cADPr
(зниження на 30 + 5%, n = 24, рис. 2B). Додавання 10 мкМ Tg не викликало
ніяких змін (n = 24, рис. 2С).

Вимірювання змін концентрації вільного Ca2+ у середовищі навколо
одиночної секреторної гранули

Вимірювання вивільнення Ca2+ із одиночної ЗГ проводили, використовуючи
Calcium Green-1 декстран (збудження – 488 нм, випромінювання – 510-560
нм). Поля із одиночними гранулами вибирали, використовуючи можливості
конфокального мікроскопа для реєстрації у прохідному світлі (рис. 3).
Цікаві ділянки вибирали так, щоб одна із них знаходилася поблизу
секреторної гранули (контроль), а інша – на відстані 10-15 мкм від
гранули. Аплікацію IP3 виконували, використовуючи іонофоретичну ін’єкцію
(рис. 3). Записи інтенсивностей флуоресценції для випадку Calcium
Green-1 декстрану (70kD) показані на рис. 3 D. Верхній запис демонструє
сигнал, заміряний у боксі поблизу гранули (рис. 3 A,B,C), нижній запис
відповідає боксу, розміщеному на відстані 15 мкМ від гранули (поза полем
зору, зображеному на рис. 3 A,B,C). Ін’єкції IP3 викликали швидке
вивільнення Ca2+ із одиночних ЗГ (n=3) та із маленьких кластерів гранул
(n=6). Швидкоминаюче підвищення концентрації вільного Ca2+, яке можна
було зареєструвати за допомогою боксу, розміщеного поблизу гранули,
слабо реєструвалося вже на відстані кілька мікрон від гранули, і ніяких
змін не можна було зареєструвати вдалині, на відстані у 10 мкм.
Контрольна ін’єкція IP3 у те ж саме середовище, але без ЗГ не викликала
ніяких змін у інтенсивності флуоресценції.

Зміни у концентрації вільного цитозольного Ca2+ в інтактних клітинах
внаслідок дії ацетилхоліну або тапсігаргіну

У попередніх експериментах було багаторазово задокументовано, що AХ та
CCK викликають зміни у концентрації цитозольного вільного кальцію
([Ca2+]i), які або обмежуються областю секреторних гранул, або виникають
в цій області, а потім поширюються на інші частини клітини QUOTE
“(Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai and Augustine 1990;Toescu, Lawrie et
al. 1992;Kasai, Li et al. 1993)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00e(Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai and Augustine
1990;Toescu, Lawrie et al. 1992;Kasai, Li et al.
1993)\01\11\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00PЊы\01Н‹хwи\06\14\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00
\00\00\00\003DщwHП\00\02Н‹хwЁ\07\13\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003Dщwpnе\01Н‹хwЁ\07\15\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwHП\00\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03301\1EKasai & Augustine 1990 301
/id\00\1E\00 (Thorn et al. 1993; Kasai et al. 1993) QUOTE “” ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67
/id\00\1D\00 QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112″Thorn, Lawrie, et al. 1993 112
/id\00″\00 QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0269″Toescu, Lawrie, et al. 1992 69
/id\00″\00 . Toeску та ін. QUOTE “(Toescu, Lawrie et al. 1992)”
ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Toescu, Lawrie et al.
1992)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1
2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0269″Toescu, Lawrie, et al. 1992 69
/id\00″\00 (Toescu et al. 1992) показали, що на відміну від дії
стимуляторів секреції, специфічний інгібітор ЕР Ca2+-АТФаз, Tg, головним
чином викликає вивільнення Ca2+ із базолатеральних областей
панкреатичних ацинарних клітин QUOTE “(Thastrup, Cullen et al. 1990)”
ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1E(Thastrup, Cullen et al.
1990)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1
2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\17\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03328%Thastrup, Cullen, et al. 1990 328
/id\00%\00 (Thastrup et al. 1990) . Результатами своїх експериментів
Toeску та ін. показали, що коротка попередня стимуляція AХ викликала
помітне підвищення [Ca2+]і у області секреторних гранул, а після цього
клітина могла відновити концентрацію [Ca2+]i у області секреторних
гранул і повернутись до нормальних стану перед аплікацією Tg. Однак
можна було заперечити, що той факт, що у таких експериментах Tg не
викликав вивільнення Ca2+ із області секреторних гранул QUOTE
“(Toescu, Lawrie et al. 1992)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Toescu, Lawrie et al.
1992)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1
2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0269″Toescu, Lawrie, et al. 1992 69
/id\00″\00 (Toescu et al. 1992) можна пояснити попереднім, викликаним
АХ, вивільненням Ca2+ у цій області. Виходячи із точки зору наведених
вище даних які вказують на те, що Tg не може вивільнювати Ca2+ із
ізольованих ЗГ, нам було цікаво протестувати інтактні клітини,
використовуючи конфокальний мікроскоп і з’ясувати, де все ж таки
відбувається первинне вивільнення Ca2+, викликане Tg. Підвищення Ca2+,
виклікане короткою іонофоретичною аплікацією AХ відбувалося дуже
специфічно у гранулярній секреторній області. Як і у попередньо
опублікованих даних, Tg викликав повільне зростання [Ca2+]i переважно у
базолатеральній області.

Таким чином у даній частині дисертаційної роботи ми визначали, чи є ЗГ
кальцієвими депо у секреторних клітинах і чи можуть вивільнювати Ca2+ із
ЗГ такі посередники, як IP3 та циклічна АДФ-рибоза. У експериментах на
одиночних ізольованих ЗГ із використанням конфокальної мікроскопії ми
показали, що IP3 та cADPr викликають помітне спадання концентрації
вільного інтрагранулярного Ca2+. Використовуючи новий метод, ми
вимірювали зміни у концентрації Ca2+ поблизу ізольованих ЗГ та показали,
що IP3 та cADPr викликають швидке вивільнення Ca2+ із гранул, чим можна
пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольного Ca2+ у
секреторному полюсі ацинарних клітин.

Локалізація місць виділення Сa2+ в панкреатичних ацинарних клітинах

Еволюційним шляхом в клітинах утворилася складна система для підтримки
низьких концентрацій Ca2+ шляхом видалення Ca2+ із цитоплазми після
того, як він туди потрапив як шляхом вивільнення із внутрішньоклітинних
депо, так і внаслідок потрапляння Ca2+ через канали плазматичної
мембрани. Власне, Ca2+ може бути видалено із цитозолю різноманітними
системами плазматичної мембрани QUOTE “(Kessler, Bennardini et al.
1990;Tepikin, Voronina et al. 1992a;Ashley, Griffiths et al. 1993;Piper,
Siegmund et al. 1993)” ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00z(Kessler,
Bennardini et al. 1990;Tepikin, Voronina et al. 1992a;Ashley, Griffiths
et al. 1993;Piper, Siegmund et al.
1993)\01\11\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\
00PЊы\01Н‹хwи\06\1A\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwЂw\15\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\16\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0236%Ashley, Griffiths, et al. 1993 36
/id\00%\00 (Ashley et al. 1993; Piper et al. 1993) QUOTE “” ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\019&Kessler, Bennardini, et al. 1990 9
/id\00&\00 QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0235#Piper, Siegmund, et al. 1993 35
/id\00#\00 QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 . Однак, не дослідженою до цього часу проблемою є
просторове розподілення вивільнення у позаклітинний простір на
клітинному рівні. Як правило, оцінки просторового розподілу активності
різних типів регуляторних систем плазматичної мембрани робляться на
основі вивчення змін у [Ca2+]і. Однак, інтерпретація результатів таких
вимірювань є неоднозначною внаслідок інтерференції із іншими кальцієвими
регуляторними системами (такими, як буфери Ca2+, механізми захвату Ca2+)
та неоднорідностями дифузії Ca2+ всередині клітин.

Розробивши теоретичне і практичне обґрунтування для застосування
розроблених нами новітніх методів вимірів просторово-часових
характеристик потоків іонів кальцію через плазматичну мембрану клітин,
ми розпочали серії дослідів, націлених на дослідження місць виділення
Ca2+ в панкреатичних ацинарних клітинах мишей.

Швидке зростання [Ca2+]i, спричинене аплікацією АХ, викликало зниження
інтенсивності флуоресценції Fura Red, за яким слідувало зростання
інтенсивності флуоресценції Calcium Green-1 декстрану, що означало
вивільнення Ca2+ із клітин у оточуюче середовище. Стимуляція цього типу
(за допомогою 10 мкМ АХ) завжди викликала зростання [Ca2+]i, яке
починалося у секреторному полюсі, а потім швидко (протягом кількох
секунд) поширювалося по всій ацинарній клітині QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0269″Toescu, Lawrie, et al. 1992 69
/id\00″\00 . Теоретично можливо, що нерівномірний внутрішньоклітинний
розподіл Fura Red може викликати подібні зміни у часі виділення Ca2+ у
різних частинах клітини, і тому більшість описаних експериментів ми
проробили на клітинах, які не були навантажені ніякими флуоресцентними
індикаторами. У цих експериментах для реєстрації вивільнення Ca2+ ми
використовували тільки зовнішньоклітинний індикатор.

На рис. 4 показані результати експериментів на кластері ацинарних
клітин, який знаходився у розчині із Calcium Green-1 декстраном.
Конфокальний мікроскоп був використаний у цьому досліді для того, щоб
зареєструвати місця виділення Ca2+ із стимульованих клітин. На рис. 4A
подано зображення клітинного кластера у прохідному світлі, із якого
видно, що секреторні гранули локалізовані у центрі зображення. На рис.
4B показане флуоресцентне зображення оптичної площини, яка проходить
через частину кластера із 4 клітинами, які оточують псевдолюмен. Три
бокси, які видно на зображенні, вказують місця, у яких велася реєстрація
Ca2+-залежної флуоресценції. Короткий, але інтенсивний період
іонофоретичної стимуляції АХ спричиняє зростання зовнішньоклітинної
концентрації Ca2+ у всіх 3 областях, де спостерігали флуоресценцію. Але,
як це видно із рис. 4C, найбільше посилення флуоресценції реєстрували у
боксі 1, розміщеному поблизу центра кластера біля псевдолюмена.

Можна заперечити, що результати, наведені на рис. 4, пояснюються тими
обмеженнями, яких зазнає дифузія Ca2+ із люмена. Тому ми вирішили
проробити експерименти, у яких оптична площина взагалі не проходить
через клітинний кластер. В наступних експериментах світловий потік
флуоресценції збирали із шару, який знаходиться як раз над верхньою
поверхнею кластера.

На рис. 5 показані результати таких експериментів на кластері із 4
ацинарних клітин, які омивалися розчином, який містив Calcium Green-1
декстран. На рис. 5a зображення кластера у прохідному світлі, яке
демонструє центральне розташування секреторних гранул. Всі інші
зображення із цього набору демонструють псевдокольорову інтенсивність
флуоресценції Calcium Green-1 декстрану у зовнішньоклітинному розчині.
Для зручності на всіх флуоресцентних зображеннях розмістили обриси
кластеру клітин, взяті із зображення, отриманого у прохідному світлі. На
рис. 5(b-h) подано зображення, зроблені із 10 секундним інтервалом
безпосередньо перед (b) та після стимуляції АХ (c-h) , тоді як на рис. 5
i показана картинка, зареєстрована більш ніж через 100 сек. після того,
як була досягнута максимальна концентрація зовнішньоклітинного Ca2+. Із
рис. 5 видно, що максимальну інтенсивність флуоресценції реєстрували
поблизу зони секреторних гранул. Підвищення інтенсивності флуоресценції
явище недовготривале, воно продовжується тільки 200 сек., і не залежить
від того чи продовжується стимуляція АХ. Цього можна очікувати, оскільки
зовнішньоклітинна концентрація Ca2+ у наших експериментах підтримувалася
достатньо низькою для того, щоб не допустити вхід Ca2+ у клітину після
того, як були вичерпані всі запаси мобілізованого Ca2+ як це було
показано раніше у роботах QUOTE “(Tepikin, Voronina et al.
1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00?(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin,
Voronina et al.
1992b)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12
\00PЊы\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003Dщw\18L‰\01Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie
r New CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie
r New CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3
/id\00$\00 (Tepikin et al. 1992) QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 . Подібні результати були продемонстровані у 14
експериментах даної серії.

Для того, щоб покращити результати по розрізненню місць виділення Ca2+,
ми провели серію експериментів на ізольованих одиночних клітинах. У
цьому випадку одиночні ацинарні клітини стимулювали за допомогою 10 – 15
секундних імпульсів АХ, який іонофоретично аплікувався. У експериментах
із клітинами, навантаженими Fura Red, було показано, що такий протокол
призводив до значного підвищення [Ca2+]i QUOTE “(Kasai and Augustine
1990)” ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1A(Kasai and Augustine
1990)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\13\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03301\1EKasai & Augustine 1990 301
/id\00\1E\00 (Kasai and Augustine 1990) . Один із наших експериментів
наведено на рис. 6. Цей експеримент було проведено для того, щоб
візуалізувати місце більшого вивільнення Ca2+ із одиночної клітини при
цьому типі стимуляції АХ. Поляризацію одиночних клітин чітко видно із
рис. 6a. Конфокальна система реєструвала флуоресценцію із площини, що
проходила через клітину. Сама клітина показана, як чорна пляма на
кожному із флуоресцентних зображень (рис. 6b-i). Ці зображення
отримували через 3-х секундні інтервали після початку стимуляції АХ.
Інтенсивність флуоресценції Calcium Green-1 декстрану зростала значно
більше поблизу секреторного полюсу у порівнянні із полюсом базальним, і
це графічно проілюстровано на рис. 6B. У кожному із 6 експериментів
цього типу інтенсивність флуоресценції зростала помітно сильніше поблизу
секреторного полюсу у порівнянні із полюсом базальним, і не було
зареєстровано жодного випадку, щоби пік інтенсивності поблизу базального
полюсу перевищував 50% того значення, яке реєстрували поблизу
секреторного полюсу, незалежно від того, де знаходилася піпетка для
стимуляції АХ. Як це видно із рис. 6B, було зареєстровано зростання
Ca2+-залежної флуоресценції безпосередньо поблизу базального полюсу. Ми
намагалися з’ясувати, чи може це бути результатом дифузії Ca2+, який
перед тим виділився із апікального (секреторного) полюсу, чи також це
може бути і результатом дифузії Ca2+, який виділився із базальної
мембрани. Для цього ми порівнювали зростання Ca2+-залежної флуоресценції
за допомогою 3 боксів, розташованих на рівних відстанях на одній прямій.
Один бокс був розташований поблизу секреторного полюсу, а два інших
поблизу базального полюсу та на прямо протилежній від полюсу стороні
відповідно. У цих випадках підвищення інтенсивності флуоресценції
наступало раніше поблизу базального полюсу, завжди розвивалося там
швидше та досягало більших величин (принаймні, вдвічі), якщо порівняти
це із боксом із протилежної від базального полюсу сторони. Все це вказує
на те, що зростання концентрації Ca2+ поблизу базального полюсу
відбувається і завдяки вивільненню Ca2+ через базальний полюс, а не
тільки завдяки дифузії Ca2+, вивільненого через секреторний полюс.

Чи можна пояснити спостережуване вивільнення Ca2+ (рис. 4, 5, та 6)
тільки як результат вивільнення Ca2+ внаслідок екзоцитозу? Із
експериментів із використанням методики краплини, у яких вимірювалася
загальна кількість вивільненого Ca2+ при максимальній стимуляції
панкреатичних ацинарних клітин відомо, що вся кількість мобілізованого
Ca2+, яка відповідає приблизно 0.7 мM загальної концентрації кальцію у
клітині QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 , вивільняється приблизно за 200 сек. QUOTE “(Tepikin,
Voronina et al. 1992a)” ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Tepikin,
Voronina et al.
1992a)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12
\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 (Tepikin et al. 1992) . Протягом цього відрізка часу ми не
спостерігали помітного зменшення запасів секреторних гранул у
панкреатичних ацинарних клітинах. Ми також не спостерігали ніякого
помітного зменшення флуоресценції квінакріна, накопиченого у секреторних
гранулах (квінакрін накопичується у кислотних гранулах і зменшення
квінакрінової флуоресценції використовується для вимірювань секреції
QUOTE “(Bokvist, Eliasson et al. 1995)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\1F(Bokvist, Eliasson et al.
1995)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0210%Bokvist, Eliasson, et al. 1995 10
/id\00%\00 (Bokvist et al. 1995) ) після прикладення стандартного
імпульсу АХ протягом 10-15 сек. за наших експериментальних умов
(кімнатна температура, безкальцієвий розчин) (n=6). В присутності 1мM
зовнішньоклітинного Ca2+, постійної стимуляції АХ (10 мкМ) при 37oC, ми
спостерігали значне зменшення флуоресценції квінакріну, який виступав як
маркер секреції.

Таким чином застосувавши нову методику, ми безпосередньо показали, що
секреторний полюс (ділянка секреторних гранул) є головним місцем
вивільнення Ca2+ внаслідок стимуляції агоністом. Виявилося, що це
вивільнення Ca2+ не є наслідком єкзоцитозу – оцінки секреції в умовах
нашого експерименту (низька концентрація зовнішньоклітинного Ca2+ ,
кімнатна температура) із використанням методики реєстрації флуоресценції
квінакріну показують, що втрати секреторних гранул при цьому процесі
невеликі, не дивлячись на те, що процес вивільнення Ca2+ відбувається
постійно.

Розподіл ca2+-atфаз по поверхні ацинарної клітини підшлункової залози

Підвищення концентрації вільного внутрішньоклітинного кальцію у
панкреатичних ацинарних клітинах призводить до активації кальцієвих
насосів плазматичної мембрани та до вивільнення значної кількості
кальцієвих іонів QUOTE “(Zhang, Zhao et al. 1992;Tepikin, Voronina et
al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00W(Zhang, Zhao et al. 1992;Tepikin, Voronina et
al. 1992a;Tepikin, Voronina et al.
1992b)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12
\00PЊы\01Н‹хwи\06\12\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003DщwXоы\01Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3
/id\00$\00 (Petersen 2003) QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0212\1FZhang, Zhao, et al. 1992 12
/id\00\1F\00 . В природі це підвищення [Ca2+]i відбувається після
стимуляції клітини гормонами та нейропередатчиками QUOTE “(Zhang, Zhao
et al. 1992;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Berridge 1993)” ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00F(Zhang, Zhao et al. 1992;Tepikin,
Voronina et al. 1992b;Berridge
1993)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1
2\00рTъ\01Н‹хwи\06\12\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003Dщw(џ\16\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwHП\00\02Н‹хwЁ\07\08\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0227\14Berridge 1993 27 /id\00\14\00
(Berridge 1993) QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3
/id\00$\00 QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0212\1FZhang, Zhao, et al. 1992 12
/id\00\1F\00 . У попередніх експериментах ми показали, що тим місцем,
де переважно вивільняється кальцій при такій стимуляції є апікальна
частина клітин QUOTE “(Belan, Gerasimenko et al. 1996)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al.
1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64
/id\00&\00 (Belan et al. 1996) . Також було показано, що апікальний
секреторний полюс панкреатичних ацинарних клітин особливо чутливий до
кальцій мобілізуючих посередників QUOTE “(Thorn P, Gerasimenko O et
al. 1994;Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai, Li et al. 1993)” ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00T(Thorn P, Gerasimenko O et al.
1994;Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai, Li et al.
1993)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00PЊы\01Н‹хwи\06\1D\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003DщwШw\16\02Н‹хwЁ\07\14\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwШa\1B\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67
/id\00\1D\00 (Thorn P et al. 1994) QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03104+Thorn P, Gerasimenko O, et al. 1994
104 /id\00+\00 QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112″Thorn, Lawrie, et al. 1993 112
/id\00″\00 . Ця чутливість призводить до того, що підвищення
концентрації [Ca2+]i відбувається у просторі клітини неоднорідно.
Підвищення концентрації Ca2+ починається у апікальній частині клітин
(або навіть відбувається тільки в цій частині), а потім поширюється із
цього місця по всьому цитозолю клітин QUOTE “(Thorn, Lawrie et al.
1993;Kasai, Li et al. 1993)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\001(Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai, Li et al.
1993)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1
2\00рTъ\01Н‹хwи\06\14\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003DщwX7‡\01Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67
/id\00\1D\00 (Thorn et al. 1993) QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112″Thorn, Lawrie, et al. 1993 112
/id\00″\00 . Звичайно, що просторова неоднорідність підвищення [Ca2+]i
може спричинювати і неоднорідність паттерну вивільнення кальцію із
клітин.

Займаючись даним дослідженням, ми намагалися зрозуміти, як паттерн змін
концентрацій вільного внутрішньоклітинного кальцію може впливати на
просторову організацію потоків викидів кальцію, а також вивчити те, чи
може агоніст сам по собі або/та джерело кальцію, який вивільняється,
впливати на просторове розташування місць викидів кальцію.

Для вирішення цих питань ми проводили експерименти, у яких змінювали
концентрацію внутрішньоклітинного кальцію подібно до того, як це
відбувається при дії гормонів та нейропередатчиків, виходячи із термінів
амплітуди та кінетики, але відмінних з точки зору просторового розподілу
всередині клітини.

Раніше вже було показано, що стимуляція агоністом панкреатичних
ацинарних клітин викликає початкове підвищення кальцію в апікальній
частині клітини, яке потім поширюється у базальну частину QUOTE
“(Belan, Gerasimenko et al. 1996)” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al.
1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64
/id\00&\00 (Belan et al. 1996) QUOTE “” ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112″Thorn, Lawrie, et al. 1993 112
/id\00″\00 . Це явище було повторене у специфічних умовах наших
експериментів. Просторовий паттерн змін інтенсивності флуоресценції,
отриманий за допомогою конфокального мікроскопу у площині одиночної
панкреатичної ацинарної клітини, представлено на рис. 7 (набір зображень
у верхній частині рис.). У наведеному прикладі підвищення [Ca2+]i
протягом іонофоретичної аплікації АХ було локалізовано виключно у
апікальній частині клітини. Аплікації, які тривали довше у часі (у цій
та іншіх клітинах), викликали хвилю змін [Ca2+]i, яка ініціалізувалася у
тій же самій апікальній частині клітини, а потім це підвищення
концентрації кальцію поширювалося по всій клітині (дані не показані).

Підвищення кальцію, яке відбувалося внаслідок вивільнення Ca2+ із
зв’язаної форми (NP-EGTA) за допомогою флеш фотолізу проходило інакше.
[Ca2+]i підвищувалася однорідно по всій конфокальній площині, що
проходила через клітину. Ця однорідність спостерігалася практично
протягом усього періоду підвищення концентрації кальцію. На рис. 7
наведено приклад такого експерименту (набір зображень у нижній частині
рисунку). Така різниця паттернів змін [Ca2+]i спонукала нас дослідити
можливу різницю у вивільненні кальцію у зовнішньоклітинне середовище,
яка була викликана цими змінами.

Ми провели серії експериментів по локалізації місць вивільнення кальцію
протягом іонофоретичної аплікації АХ. У цих експериментах ми вимірювали
як зовнішньоклітинну концентрацію кальцію поблизу плазматичної мембрани
(що відображає просторовий паттерн вивільнення кальцію), так і
концентрацію вільного кальцію всередині клітини. Кластер омивався
розчином, який містив у собі Calcium Green 1 декстран та був попередньо
навантажений Fura Red/АМ. Конфокальний мікроскоп застосовували для того,
щоб зареєструвати як місця вивільнення Ca2+ із клітин кластеру, так і
зміни [Ca2+]i у одній із клітин. Оптичну площину проводили через клітини
кластеру і, таким чином, флуоресценція у боксі 1 була, головним чином,
флуоресценцією Fura Red всередині клітини. Іонофоретична аплікація АХ
спричиняла як мобілізацію внутрішньоклітинного Ca2+ так і вивільнення
Ca2+. Зростання концентрації зовнішньоклітинного кальцію (що відображало
процес вивільнення Ca2+ ) відбувалося значно швидше біля апікального
полюсу клітини, ніж біля базального. Крім того, спостерігалася значна
різниця у часі між піками відповідей у апікального та базального полюсів
клітини, яка вказує на те, що значна частина підвищення кальцію
пояснюється дифузією Ca2+ із апікальної частини клітини. Амплітуда
відповідей біля апікального полюсу клітини була приблизно у 2.5 разів
вища за амплітуду відповідей біля базального.

В другої серії експериментів по локалізації місць вивільнення кальцію
одиночні панкреатичні ацинарні клітини навантажували NP-EGTA. Спалах УФ
світла посилався на клітину із УФ лазера конфокальної системи. Протягом
спалаху та відкритті та закритті шторки УФ лазера, вимірювання
флуоресценції припиняли для того, щоб не пошкодити фотопомножувач
реєстраційної системи. Після швидкого зростання [Ca2+]i внаслідок
спалаху УФ світла відбувається збільшення зовнішньоклітинної
концентрації кальцію, що свідчить про вивільнення Ca2+ із клітини у
оточуюче середовище. Головне джерело вивільненого кальцію було
локалізовано у апікальній частині клітини. Стимуляція такого типу (при
тривалості спалаху від 1 до 5 секунд) завжди викликала подібні
просторові паттерни вивільнення Ca2+ із клітин (n=8).

Ми провели кілька експериментів на ненавантажених клітинах, як для
випадку стимуляції за допомогою АХ, так і при стимуляції флеш фотолізом,
для того, щоб упевнитися, що барвник Fura Red сам по собі не впливав на
просторовий паттерн вивільнення кальцію. В цих експериментах для
реєстрації вивільнення Ca2+ використовувався тільки зовнішньоклітинний
індикатор. Ми не помітили ніякої різниці у просторовому паттерні змін
зовнішньоклітинної концентрації Ca2+ у порівнянні із клітинами,
навантаженими Fura Red (n=3 для стимуляції АХ; n=2 для стимуляції флеш
фотолізом).

Було цікаво порівняти просторові паттерни вивільнення кальцію, отримані
за допомогою стимуляції АХ та флеш стимуляції на одній і тій же клітині
або маленькому кластері клітин, оскільки паттерн вивільнення повинен
залежати від топологічної структури різних типів клітин. У цьому випадку
подібні просторові паттерни повинні також демонструвати подібність у
вивільненні кальцію при різних типах стимуляції. У попередніх
експериментах ми побачили, що спричинене спалахом підвищення [Ca2+]i у
деяких випадках може викликати мобілізацію кальцію із внутрішніх депо
(можливо, через механізм кальцій-залежного вивільнення кальцію). Для
того, щоб бути впевненим, що вивільнений при УФ спалаху кальцій є
“зв’язаним ”, а не кальцієм мобілізованим із внутрішніх депо, ми робили
спалах після попередньої аплікації АХ (що повинна була розрядити запаси
кальцію у внутрішньоклітинних депо).

На рис. 8A наведено флуоресцентне зображення кластера із двох клітин,
навантажених Fura Red та поміщених у розчин із Calcium Green 1
декстраном. Кластер добре видно у вигляді яскравої структури у центрі
зображення. Вимірювання флуоресценції кальцієвих барвників робили у
боксах, зображених на рис. 8A. На рис. 8B наведено приклад змін
внутрішньоклітинної та зовнішньоклітинної концентрацій іонів кальцію у
боксах 1 – 3 рис. 8А протягом стимуляції АХ та вивільнення Ca2+ із
NP-EGTA при спалаху УФ світла. Видно, що крива кінетики зміни [Ca2+]i
повертається до базової лінії після досягнення піка та, що амплітуди
відповідей на обидва стимули подібні між собою. На цьому рисунку також
видно, що в обох випадках величина зростання концентрації
зовнішньоклітинного кальцію (що відображає вивільнення Ca2+) є значно
вищою поблизу області секреторних гранул (яка розташована, головним
чином, у верхній центральній частині кластера). Оскільки експеримент
проводили на клітинах, які омивалися розчином із низькою концентрацією
кальцію ([Ca2+] =300 нM), то аплікація АХ, яка спричинювала вивільнення
Ca2+, повинна була викликати значне спустошення внутрішніх кальцієвих
депо. У цьому випадку, Ca2+ вивільнений із NP-EGTA усередині клітин,
повинен бути єдиним джерелом Ca2+, вивільненого внаслідок спалаху УФ
світла у позаклітинний простір (n=3).

?

E

?

3/4

?

?

ri?? Ae d?]„1`„ ????ц?????????????????? ?????? AbApA?A?AUeAeAIAUA\A^AfChC@EHEJE2E?EtE®EEEoioaYaYaYoioaYaYOeYOYOeYOYIOYO eYIOYAYOYAYOYOeY3/4I·IYI·IOI°IOIOI°I·IYAYIOIO hMq• —F hMq• hMq•@?yyH* AE# @ hMq•@?thyH* oioieioiUeOUeoioiIiIioiUeOUeoioieiIiIiIiIioiUeOUeoioiIioiUeOUeoioieiIioi UeOUeoioiUeOUeoioiUeOUe hMq•@?thyH* hMq•@?thyH* hMq•@?thy $ AE# @ AE# @ $ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ Ekd hMq•@?thyH* @?thy ?y???x?x??? hMq•@?thyH* hMq•@?thy hMq•@?thyH* i o uouiuauOeIOeauauOeIOeauOeIOeauOeIOeauauOeIOeauauououauOeIOeauauouiuouiuo uauOeIOeauauouououououiu hMq•@?thyH* hMq•@?thy hMq•@?yyH* hMq•@?yyH* hMq•@?thy D H ? O ue/ueoueeueaeueUeeueUeueUeueeue/ue/ueoue/ue/ue/ue/ue/ueeue/ue/ue/ueoue/u eUueOEOA»???A»???A»??? TH ???????????ляції агоністом відбуваються значні (по кілька мМ на літр) зміни у концентрації вільного кальцію в люмені ацинусу. Ізопротеренол викликає зовнішньоклітинні Сa2+ спайки відповідно до актів секреції у клітинах слинної залози QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0273\13Douglas 1968 73 /id\00\13\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0272\10Katz 1969 72 /id\00\10\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03315)Muallem, Kwiatkowska, et al. 1995 315 /id\00)\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0268\1ANeher & Zucker 1993 68 /id\00\1A\00 У екзокринних клітинах після дії агоніста відбувається зростання [Ca2+]i QUOTE "(Douglas 1968)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\0E(Douglas 1968)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\07\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0273\13Douglas 1968 73 /id\00\13\00 (Douglas 1968) , яке викликає екзоцитоз QUOTE "(Maruyama, Inooka et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1E(Maruyama, Inooka et al. 1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0266$Maruyama, Inooka, et al. 1993 66 /id\00$\00 (Maruyama et al. 1993) . Кальцієві насоси були знайдені у різних областях плазматичної мембрани екзокринних ацинарних клітин QUOTE "(Lee, Xu et al. 1997)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\15(Lee, Xu et al. 1997)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\0E\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03313\1CLee, Xu, et al. 1997 313 /id\00\1C\00 (Lee et al. 1997) , і зростання [Ca2+]i також активує залежне від АТФаз вивільнення Ca2+ через плазматичну мембрану QUOTE "(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00^(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00PЊы\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwX7‡\01Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Belan et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3 /id\00$\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2 /id\00$\00 . Секреторні гранули містять Ca2+ у дуже високій концентрації QUOTE "(Nicaise, Maggio et al. 1992;Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00B(Nicaise, Maggio et al. 1992;Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1996)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003Dщwpnе\01Н‹хwЁ\07\1F\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0265,Gerasimenko, Gerasimenko, et al. 1996 65 /id\00,\00 (Gerasimenko et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0213#Nicaise, Maggio, et al. 1992 13 /id\00#\00 , і акт екзоцитозу сам по собі також повинен вивільнювати Ca2+. Однак під час наших попередніх досліджень на панкреатичних ацинарних клітинах QUOTE "(Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Belan et al. 1996) , в яких викликана агоністом секреція є суттєво зниженою при низькій концентрації зовнішньоклітинного Ca2+, було показано, що головна частина Ca2+ вивільняється у відповідь на супрамаксимальну стимуляцію агоністом завдяки опосередкованому Ca2+ насосами потоку через плазматичну мембрану, а не завдяки екзоцитозу, QUOTE "(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00^(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\ 00PЊы\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwЂw\15\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw\18L‰\01Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie r New CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie r New CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Tepikin et al. 1992; Belan et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3 /id\00$\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2 /id\00$\00 . На відміну від загальноприйнятої ролі Ca2+ у регуляції екзоцитозу існують екзокринні секреторні клітини, наприклад, клітини слинних залоз, для яких головним внутрішньоклітинним сигналом, який викликає екзоцитоз є не підвищення [Ca2+]i, а зростання концентрації циклічного АМФ QUOTE "(Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\003(Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\12\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw(џ\16\02Н‹хwЁ\07\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0275\1CQuissell & Tabak 1989 75 /id\00\1C\00 (Quissell and Tabak 1989; Spearman and Butcher 1989) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0276\1ESpearman & Butcher 1989 76 /id\00\1E\00 . Збудження ?- адренергічних рецепторів стимулює секрецію білків із слинних залоз шляхом утворення циклічного АМФ без помітного зростання [Ca2+]i QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0276\1ESpearman & Butcher 1989 76 /id\00\1E\00 . У цих клітинах на секреторні відповіді важко вплинути шляхом відсутності чи присутності зовнішньоклітинного Ca2+ QUOTE "(Petersen, Ueda et al. 1977)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Petersen, Ueda et al. 1977)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0271"Petersen, Ueda, et al. 1977 71 /id\00"\00 (Petersen et al. 1977) . Оскільки слинні залози мають як холінергічні мускаринові і ?-адренергічні рецептори, які контролюють [Ca2+]i, так і ?-адренергічні рецептори, які регулюють утворення циклічного АМФ QUOTE "(Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\003(Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\12\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0275\1CQuissell & Tabak 1989 75 /id\00\1C\00 (Quissell and Tabak 1989; Spearman and Butcher 1989) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0276\1ESpearman & Butcher 1989 76 /id\00\1E\00 , ми вирішили порівняти механізми вивільнення Ca2+ у зовнішньоклітинне середовище у відповідь на дію мускаринового агоніста АХ та ?-адренергічного агоніста ізопротеренола (ISP) в одиночних клітинах та маленьких кластерах клітин слинної залози. Вимірювання вивільнення Са2+, спричиненого ISP та АХ , які були проведені за допомогою методики краплини Для того, щоб кількісно охарактеризувати вивільнення кальцію із сабмандибулярних клітин, ми використовували методику краплини. Кластери сабмандибулярних клітин поміщали у маленькі краплини зовнішньоклітинного розчину із кальцій- чутливим барвником fluo-3. У цій серії експериментів клітини попередньо навантажували fura -2. Загальна кількість кальцію, вивільненого із кластерів, розраховувалася на основі вимірювання за допомогою fluo-3. Кластери, які поміщали у краплини, демонстрували значне базальне вивільнення кальцію відповідно до зниження загальної концентрації клітинного кальцію у 81 + 15 мкM за хвилину (n = 7) (сабмандибулярні клітини миші). Аплікація ISP у зовнішньоклітинний розчин призводила до значного зростання концентрації зовнішньоклітинного кальцію (рис. 9А). Одночасно, ми майже не спостерігали змін у [Ca2+]i у відповідь на аплікацію ISP (рис. 9А). Ця відсутність змін у [Ca2+]i дозволяє припустити, що основна частина Ca2+ протягом стимуляції ISP вивільняється внаслідок секреції. Похідна від змін [Ca2+]o, яка вказує на кількість Ca2+, вивільненого внаслідок екзоцитозу, показала, що існує початковий швидкий компонент секреції (максимальна величина екструзії становила при цьому 460 + 28 мкM/хв, n = 7, рис 9В) який зникав після, приблизно, 100 секунд. Вивільнення кальцію протягом цих перших 100 секунд стимуляції ISP відповідає зниженню загальної концентрації клітинного кальцію на 429 + 35 мкM (n = 7). За цим початковим швидким компонентом слідувало більш повільне вивільнення кальцію, яке продовжувалося довше, ніж тривали наші експерименти (більше, ніж 500 сек.). Величина екструзії протягом цієї більш повільної фази приблизно вдвічі перевищувала її рівень у спокої до стимуляції. Загальне вивільнення кальцію протягом перших 300 сек. стимуляції відповідає зниженню загальної концентрації кальцію у клітині на 930 + 40 мкM (n = 7). Інформація щодо здатності ISP вивільняти кальцій із внутрішньоклітинних депо у сабмандибулярних ацинарних клітинах є предметом наукових дискусій. У перших повідомленнях вказувалося, що ISP може вивільняти кальцій із кальцієвих депо в сабмандибулярних ацинарних клітинах QUOTE "(Helman, Ambudkar et al. 1987;Cook, Day et al. 1988)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\004(Helman, Ambudkar et al. 1987;Cook, Day et al. 1988)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00PЊы\01Н‹хwи\06\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03309\1ECook, Day, et al. 1988 309 /id\00\1E\00 (Helman et al. 1987; Cook et al. 1988) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03312%Helman, Ambudkar, et al. 1987 312 /id\00%\00 . Однак, коли тестували очищені клітинні препарати, то було знайдено, що хоча ISP і міг значно підвищити концентрацію цитозольного Ca2+ у клітинах інтралобулярної (гранулярної) протоки, але він практично не впливав на ацинарні клітини QUOTE "(Dehaye, Valdez et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Dehaye, Valdez et al. 1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03310#Dehaye, Valdez, et al. 1993 310 /id\00#\00 (Dehaye et al. 1993) . Оскільки точні знання про дію ISP на ацинарні клітини були надзвичайно важливими для інтерпретації результатів нашого дослідження, ми провели окремі експерименти, у яких вивчався ефект стимулюючої дії ISP на [Ca2+]i. Ці експерименти проводили на клітинах, навантажених fura-2 із використанням системи цифрових досліджень зображень (QuantiCell, Applied Imaging, UK). Клітини поміщали у відкриті камери для перфузії. Було протестовано 67 клітин. ISP аплікували за допомогою перфузії. Високі дози ISP (10 мкM) не викликали такі зміни у [Ca2+]i у всіх тестованих клітинах, які можна було б виміряти. Наступна за цим аплікація АХ викликала у тих самих клітинах значні зміни у [Ca2+]i (на 70 - 470 нМ). Можна припустити, що ISP може викликати таке повільне зростання кальцію у цитоплазмі, яке важко зареєструвати. Відомо, що лантан у високих концентраціях блокує кальцієві АТФ-ази у плазматичній мембрані QUOTE "(Kwan, Takemura et al. 1990;Toescu and Petersen 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\005(Kwan, Takemura et al. 1990;Toescu and Petersen 1995)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwЂw\15\02Н‹хwЁ\07\13\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03146#Kwan, Takemura, et al. 1990 146 /id\00#\00 (Kwan et al. 1990; Toescu and Petersen 1995) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\011\1CToescu & Petersen 1995 1 /id\00\1C\00 . Таким чином, лантан може потенціювати вказані гіпотетичні кальцієві сигнали завдяки блокуванню кальцієвих насосів у плазматичній мембрані. Однак у експериментах, в яких зовнішньоклітинний розчин містив лантан (2 мM), ми не змогли зареєструвати ніякого зростання [Ca2+]i у цитоплазмі клітин після аплікації ISP (n = 29). В усіх цих клітинах наступна аплікація АХ викликала значне зростання [Ca2+]i. Відсутність викликаних ISP змін у [Ca2+]i у цих двох наборах експериментів чітко вказує на те, що вивільнення кальцію, зареєстроване у експериментах за методом краплі не може відбуватися завдяки активації Ca2+ насосів у плазматичній мембрані. Ми також провели серію експериментів за методом краплі, в яких у зовнішньоклітинний розчин краплини додавався ?- адренергічний інгібітор фентоламін у високій концентрації (30 мкM). Це повинно було запобігти виникненню будь-яких кальцієвих сигналів від гіпотетично можливої викликаної ISP активації ?-адренергічних рецепторів. У цих експериментах (n = 8) ISP викликав значне вивільнення кальцію назовні клітин без будь-якого помітного зростання [Ca2+]i. Величина вивільнення кальцію була подібна до тієї, яка була зареєстрована без фентоламіну у зовнішньоклітинному розчині. Вивільнення кальцію протягом перших 100 секунд стимуляції ISP в присутності фентоламіну відповідає зниженню загальної концентрації кальцію у клітині на 477 + 35 мкM. Ці експерименти далі підтвердили те припущення, що вивільнення кальцію із клітин, викликане аплікацією ISP, не має відношення до вивільнення Ca2+, опосередкованого роботою Ca2+ насосів у плазматичній мембрані. Аплікації АХ на кластери, поміщені у краплини, також викликали значне вивільнення Ca2+ із клітин. Однак, на відміну від того, що відбувалося при аплікації ISP, аплікації АХ спричинювали значне зростання [Ca2+]i. Величина вивільненого кальцію градуально спадала та досягала рівня спокою приблизно через 100 - 300 сек. після початку стимуляції АХ. Максимальні величини АХ-викликаного вивільнення кальцію становили 430 + 70 мкM/хв (n=3). Загальне вивільнення кальцію протягом перших 300 сек. стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію у клітинах на 680 + 65 мкM (n = 3). Спайки вивільнення Ca2+ Вивільнення Ca2+ за допомогою Ca2+ насосів та вивільнення Ca2+ завдяки екзоцитозу повинно призводити до різних типів змін [Ca2+]o. Можна очікувати, що екзоцитоз викличе короткі спайки [Ca2+] у зовнішньоклітинному розчині тоді, коли окремі гранули переносять свій вантаж – іони кальцію – назовні клітин. В той же час насоси та обмінники повинні спричинять вивільнення кальцію, яке має “гладкий” вигляд. Ґрунтуючись на таких уявленнях, ми зробили спробу за допомогою конфокальної мікроскопії розрізнити механізми, які включені у вивільнення кальцію у випадках стимуляції клітин ISP та АХ. Для того, щоб виміряти зміни [Ca2+]o, ми додавали Calcium Green 1 декстран до практично безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину. У більшості експериментів ми записували усереднені зміни флуоресценції у малих боксах, розміщених поблизу межі клітини (дивись рис. 10 та наступну главу). На рис. 10А наведено зображення маленького кластеру (5 клітин) у прохідному світі. Обстеження кластера показало, що було тільки одне місце на межі кластеру у даній конфокальної площини, де були зареєстровані значні зміни у флуоресценції у відповідь на стимуляцію ISP. Це було місце, відмічене боксом на рис. 10А, де, з великою ймовірністю, люмен був у контакті із зовнішньоклітинним розчином. Часовий паттерн змін [Ca2+]o у боксі показано на рис. 10В. Ми також проводили експерименти, під час яких ми робили “фільм” (швидку послідовність зображень) про зміни [Ca2+]o поблизу кластера клітин. На рис. 10С представлено експеримент цієї серії (n = 7). Фільм знімали протягом терміну, відміченого короткою рискою шкали на рис. 10В; він показаний на рис. 10С. Зростання флуоресценції розпочиналося у певній точці на краю кластера, а потім поширювалося у вигляді хвилі дифузіїї. Характер спайків, який носила зміна [Ca2+]o, дозволяє припустити, що ці зміни відбувалися завдяки екзоцитозу. Інформація про розподіл концентрації Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині для послідовності точок у часі дозволила нам підрахувати кількість вивільненого Ca2+ у даній області та оцінити кількість Ca2+, який покинув цю область у результаті секреторного акту QUOTE "(Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Belan et al. 1996) . Наприклад, під час другого спайку, показаного на рис. 10С, кількість секретованого кальцію становила приблизно 3.5 x 10-18 моль. Поділивши цю величину на приблизний об’єм сабмандибулярної клітини (5 x 10-13 літр) можна отримати величину приблизного зменшення загальної концентрації кальцію у клітині внаслідок одиночного акту екзоцитозу. Розраховане значення для цього окремого експерименту становило 7 мкM. В окремих експериментах протягом аплікації ISP концентрація [Ca2+]i замірялася для клітинних кластерів, навантажених Fura Red. В цих експериментах із використанням конфокального мікроскопа ми не зареєстрували змін у [Ca2+]i (n = 5). В цій же серії дослідів було показано, що елементарні акти секреції можуть мати місце у декількох просторово роздільних місцях на поверхні малих клітинних кластерів. Причому секреція спостерігалась у одних і тих же місцях кластерів, в той час як у інших вона була відсутня. Ми також спостерігали синхронне збільшення концентрації позаклітинного кальцію у декількох боксах, що знаходились поблизу секреторних полюсів поодиноких клітин або клітинних кластерів. Відмінність у відповідях із вивільненням Ca2+ на ізопротеренол та ацетилхолін У наступній серії експериментів ми, в основному, записували усереднені [Ca2+]o сигнали у тих областях, які нас цікавили. Сигнали, записані у таких експериментах, залежали від розмірів боксів, розташування боксів по відношенню до місць вивільнення кальцію, а також від кількості вивільненого кальцію. Типовий результат стимуляції ISP сабмандибулярних клітин наведено на рис. 11. Відповідь складається із паттерну спайкування [Ca2+]o. У деяких експериментах ми спостерігали суміш повільних підйомів на які накладалися швидкі спайки. Ми можемо уявити паттерн спайкування як послідовність секреторних актів, які відбувалися один за одним. Тому такі “змішані” паттерни можуть бути результатом суперпозиції численних актів секреції. Спонтанні спайки [Ca2+]o могли також виникати без будь-якої стимуляції агоністом. Можна припустити, що це явище відбувається внаслідок базального екзоцитозу. Іноді ми також спостерігали “згладжені” зміни [Ca2+]o. Можливо, “згладжені” зміни були записані від боксів, які знаходилися далеко від того місця, де відбулася секреція. Інше пояснення полягає у тому, що бокси були занадто великими для того, щоб реєструвати локалізовані секреторні акти. На рис. 12 наведено результати експериментів, у яких АХ викликав вивільнення Ca2+. У всіх експериментах цього типу перша аплікація АХ призводила до великого та широкого транзитивного зростання [Ca2+]o, яке тривало 70-300 сек. Такі зростання мали або загладжену форму, або загладжену форму на яку накладалися швидкі спайки [Ca2+]o (рис. 12). На відміну від стимуляції ISP, перша аплікація АХ ніколи не викликала чистого паттерну спайкування (відповідей без значного підвищення базової лінії між спайками), але друга аплікація АХ у двох випадках із шести викликала відповіді типу чистих спайків. Це відбувалося у експериментах, у яких протягом першої аплікації АХ спайки накладалися на загладжену форму змін концентрації кальцію. Нарешті в експериментах, у яких спайковий паттерн змін [Ca2+]o реєструвався в результаті другої стимуляції АХ, наступна стимуляція ISP також викликала відповідь зі спайками. Ці дані дають підставу припустити, що протягом початкової стимуляції АХ були записані два компоненти вивільнення кальцію: (i) перекачування кальцію із цитозолю у зовнішнє середовище за допомогою Са2+-АТФаз, що спричиняло загладжене зростання, зареєстроване у тих випадках, коли АХ аплікувався перший раз та (ii) вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу, що призводило до генерації спайків [Ca2+]o. Для того, щоб зареєструвати загальну величину вивільненого кальцію із клітинних кластерів, ми усереднювали величини концентрації кальцію у великій області зовнішньоклітинного розчину навколо відносно великих клітинних кластерів (більше, ніж 10 клітин). Таким чином, вимірювані зміни концентрації кальцію відображають середню величину вивільнення кальцію із клітин. Хоча на клітинний кластер набагато простіше аплікувати агоністи, ніж робити це за допомогою методики краплі QUOTE "(Tepikin, Llopis et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1D(Tepikin, Llopis et al. 1994)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0240#Tepikin, Llopis, et al. 1994 40 /id\00#\00 (Tepikin, Llopis et al. 1994) , отримані результати носять скоріше якісний, аніж кількісний характер. При такій конфігурації експерименту, звичайно, неможливо розрізнити спайки [Ca2+]o, які виникли у результаті екзоцитозу. Такий протокол експерименту ми використовували тільки для того, щоб дослідити, чи є незалежними джерела кальцію для кальцієвих викидів, спричинених обома типами агоністів. У таких експериментах стимуляція АХ призводила до повільного поступового зростання [Ca2+]o. Стимуляція клітин за допомогою ISP після стимуляції АХ, досить довгої для того, щоб виснажити внутрішні запаси кальцію, викликала значне збільшення [Ca2+]o. Все це вказує на те, що стимуляція АХ не вичерпує ресурсів для викликаного ISP вивільнення кальцію (n = 8). У додаткових експериментах довготривала аплікація ISP (15 мкM, протягом 40 хвилин) не спустошувала внутрішньоклітинні запаси Ca2+, які могли бути вивільнені за допомогою АХ, і не запобігала АХ індукованому вивільненню кальцію у зовнішньоклітинний простір (n = 5). Таким чином за допомогою нової методики для вимірювання концентрації зовнішньоклітинного кальцію поблизу клітинної мембрани та методики краплини ми вивчали ступінь вивільнення кальцію із ацинарних клітин слинної залози. Ізопротеренол, що є ?-адренергічним агоністом та потужним секреторним агентом, не викликав змін у концентрації вільного Ca2+ у цитозолі, але спричинював помітні зміни у вигляді спайків [Ca2+]o. Відсутність зростання [Ca2+]i та пульсоподібна природа змін у [Ca2+]o вказують на те, що ці спайки з’являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул. Холінергічний агоніст АХ який викликає помірну секрецію у цих клітинах, також викликав значне зростання [Ca2+]i та ”гладке” за формою зростання [Ca2+]o, яке, найбільш можливо, було спричинені роботою кальцієвих насосів плазматичних мембран із накладанням коротких спайків [Ca2+]o, викликаних екзоцитозом. Величина викликаного ISP вивільнення кальцію була досить значною. Обчислена величина втрат кальцію протягом перших 100 секунд при супрамаксимальній стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію в клітині на 0.4 мМ. АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ У дисертаційній роботі наведені дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах. Порушення цих механізмів можуть лежати в основі розвитку певних патологічних станів, що призводять до тяжких захворювань у людини. Виконане дослідження спирається на розроблені авторами новітні підходи для кількісного та якісного вимірювання роботи кальцій-регулюючих клітинних механізмів, що дозволяють значно розширити наші знання про фізіологічні зміни, що відбуваються в екзокринних клітинах в нормі та патології, а також можуть бути застосовані для вивчення різних молекулярних механізмів у багатьох типах клітин. Крім того, дане дослідження може допомогти вирішити питання про походження таких складних захворювань як гострий і хронічний панкреатити, що дозволяє стверджувати про можливість клінічного застосування результатів, отриманих у цій роботі. Просторова локалізація систем викиду іонів кальцію на поверхні панкреатичних ацинарних клітинах Відносно високий процент Ca2+, вивільненого із секреторного полюсу, як це показано у наших експериментах (рис.6), може бути результатом відносно високої щільності Ca2+ насосів у цій ділянці та/чи може бути пояснений тим, що Ca2+ насоси у цій частині клітини мають характеристики, відмінні від характеристик насосів у базальній мембрані. Ці припущення мають сенс оскільки на даний момент описана велика кількість ізоформ Ca2+ АТФаз плазматичної мембрани QUOTE "(Carafoli 1992)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\0F(Carafoli 1992)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00x№†\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\0D\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwp№†\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwp№†\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03200\15Carafoli 1992 200 /id\00\15\00 (Carafoli 1992) . Крім того відомо, що афінність цих АТФаз може контролюватися альтернативним сплайсінгом, що призводить до змін у афінності АТФаз для кальмодуліна QUOTE "(Enyedi et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\14(Enyedi et al. 1994)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00(

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020