ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ПЕТРУК ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА
УДК 574:579.87.71:632.951
Синтез і біологічна активність авермектинового комплексу STREPTOMYCES
AVERMITILIS
03.00.07 – мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі загальної та ґрунтової мікробіології Інституту
мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії
Наук України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник
Іутинська Галина Олександрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім.
Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу загальної та ґрунтової
мікробіології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Пирог Тетяна Павлівна, Інститут мікробіології і вірусології
ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник
відділу газоокислюючих мікроорганізмів.
доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Юрчак
Лариса Дем’янівна, Національний ботанічний сад ім. Гришка НАН України,
провідний науковий співробітник відділу алелопатії
Провідна організація: Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН
України, м. Чернігів.
Захист відбудеться “16” листопада 2005 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м.
Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м.
Київ, ДСП, вул. Заболотного, 154
Автореферат розісланий “ 14 “ жовтня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л. М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Сучасні агроекосистеми на відміну від природних
екосистем є менш стабільними і самоврегульованими. Їх рослинний
компонент представлений одноманіттям окремих сільськогосподарських
культур. Стабільність і продуктивність агроекосистем необхідно постійно
підтримувати додатковими зусиллями і витратами енергії з боку людини,
спрямованими на їх регулювання, зокрема застосуванням засобів захисту
рослин від шкодочинних організмів.
На сьогодні все більш актуальною стає розробка таких систем
інтегрованого біологічного захисту і стимуляції росту рослин, які не
порушують екологічної рівноваги у ґрунті і не забруднюють оточуючого
середовища. У цьому важливу роль відіграють мікробні препарати на основі
живих культур та продуктів життєдіяльності бактерій, грибів,
актиноміцетів.
Перспективними для рослинництва є речовини родини авермектинів, що
синтезуються стрептоміцетами [Burg R.W. et al. 1979]. Авермектини
характеризуються вибірково направленою дією проти комах, кліщів,
нематод. Специфічність авермектинів зумовлена їх нервово-паралітичною
дією на зазначених шкідників. Перевагою цих препаратів є відсутність
негативного впливу на організм теплокровних тварин і гідробіонтів
[Березкина Н.Е., 1996; Ikeda T., 2003; Ісаєнко В.М., 2004].
В Україні у 1997-99 р.р. був проведений пошук вітчизняного продуцента
авермектинів на базі колекції стрептоміцетів відділу загальної та
ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України. Дослідження, проведені співробітниками ІМВ НАНУ
та Українського державного університету харчових технологій, дали змогу
виділити природний штам стрептоміцета Streptomyces avermitilis УКМ
Ас-2161 – продуцент авермектинів [Ісаєнко В.М., Іутинська Г.О. та ін.,
2001]. Проте багато питань щодо біології продуценту, шляхів синтезу
авермектинів та їх дії на різні біологічні об’єкти залишаються
невирішеними. Тому селекція вітчизняного продуценту авермектинів,
вивчення шляхів підвищення його продуктивності, дослідження біологічної
активності синтезованого ним авермектинового комплексу є актуальними.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України в
межах бюджетної тематики відділу загальної та ґрунтової мікробіології
№ 0101V003058/2.3.12.63: “Еколого-функціональні особливості мікробних
угруповань ґрунту в умовах сучасного розвитку агроекосистем”.
Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи була селекція Streptomyces
avermitilis УКМ Ас-2161 та вивчення умов його культивування для
підвищення активності синтезу авермектинів, дослідження впливу
авермектинового комплексу на мікробні угруповання ґрунту, нематоди і
рослини.
Для реалізації мети дослідження вирішували наступні завдання:
вивчити популяційну різнорідність S. avermitilis УКМ Ас-2161;
провести селекцію варіантів за здатністю до накопичення високого рівня
авермектинів;
дослідити вплив умов культивування на синтез авермектинів активним
варіантом-продуцентом;
вивчити ліпідний та жирнокислотний склад міцелію активного варіанту;
визначити дію авермектинового комплексу на мікробні угруповання ґрунту;
вивчити дію на рослини в умовах закритого ґрунту;
дослідити нематоцидну активність авермектинового комплексу,
синтезованого активним варіантом S. avermitilis УКМ Ас-2161.
Об’єктами дослідження були: Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2161
(штам 1313), його варіанти 288 (УКМ Ас-2172) та 1088 (УКМ Ас-2177);
мікробні угруповання чорнозему та сірого опідзоленого ґрунту; нематоди
виду Meloidogyne incognito; огірки сортів “Конкурент” та “Анжеліна”
(гібрид F1). Природний штам УКМ Ас-2161 виділений з чорнозему
малогумусного Попельнянського району Житомирської області (Україна).
Предметом дослідження була здатність культури стрептоміцету продукувати
авермектиновий комплекс за різних умов вирощування; дія авермектинового
комплексу Аверком на ґрунтові мікроорганізми і рослини та його
нематоцидна активність.
Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували
мікробіологічні, біохімічні, фізіологічні, хіміко-аналітичні методи
дослідження у поєднанні з класичними методами ґрунтової мікробіології,
нематодології та рослинництва.
Наукова новизна одержаних результатів.
визначено, що для отримання високопродуктивного штаму S. avermitilis
ефективна багатоступенева селекція: відбір варіантів при дослідженні
спонтанної мінливості штаму, мутагенез шляхом опромінення ультрафіолетом
та обробкою N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідином;
показано, що максимальне продукування авермектинів штамом S. avermitilis
УКМ Ас-2177 відбувається при культивуванні у поживному середовищі за
присутності 7% глюкози; синтез збільшується на 16% за присутності 0,5%
ацетату Nа та на 26% за присутності регулятору росту рослин – Івіну в
кількості 100 пл/мл;
вперше показано існування залежності між авермектинсинтезувальною
активністю і вмістом в біомасі продуценту тригліцеридів, фосфоліпідів та
стеринів;
в жирнокислотному складі S. avermitilis УКМ Ас-2177 вперше виявлено
жирні кислоти з кількістю вуглецевих атомів від С4 до С10;
отримано авермектиновий комплекс, названий Аверком, що містить не менше
40 % компоненту В1 з нематоцидною активністю;
виявлено суттєве підвищення чисельності педотрофних, амілолітичних,
фосфатмобілізуючих, амоніфікуючих мікроорганізмів за умов внесення у
ґрунт біомаси, культуральної рідини S. avermitilis та Аверкому;
вперше показано, що комплексний препарат Аверком має не лише
антипаразитарні властивості, але й характеризується фітостимулюючою
дією, позитивно впливає на ріст і врожайність рослин закритого ґрунту.
Практичне значення одержаних результатів. Селекціоновано новий штам
S. avermitilis УКМ Ас-2177, який продукує авермектиновий комплекс, що
отримав назву Аверком. Зважаючи на позитивний вплив Аверкому на ґрунтову
мікробіоту і рослини, які вирощуються в умовах закритого ґрунту, а також
його нематоцидну активність, S. avermitilis УКМ Ас-2177 рекомендовано як
перспективний продуцент авермектинового комплексу для рослинництва.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно проведено
аналіз наукової літератури, особисто виконані представлені
експериментальні дослідження, проведена статистична обробка результатів
та підготовлено публікації до друку.
Автором самостійно проведено популяційний аналіз штаму шляхом
дослідження спонтанної мінливості та індукованого мутагенезу
ультрафіолетовими променями і N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідином;
відібрано активні варіанти S. avermitilis УКМ Ас-2161; досліджено вплив
умов культивування S. avermitilis УКМ Ас-2177 – одного з варіантів S.
avermitilis УКМ Ас-2161 на активність накопичення авермектинів.
Створення препарату Аверком на основі S. avermitilis УКМ Ас-2177
проведено за консультативною допомогою к.б.н. Козирицької В.Є. та к.б.н.
Валагурової О.В., які є співавторами відповідних публікацій.
Мутагенез проведено під керівництвом к.б.н Муквича М.С., вивчення
ліпідного складу проведено в лабораторії “Produsi microbieni” Інституту
мікробіології АН Республіки Молдова за участі д.б.н. Бурцевої С.А. та
к.б.н. Растимешиної І.О.; нематоцидну активність Аверкому досліджували
разом із співробітником лабораторії нематології Інституту захисту рослин
УААН Болтовською О.В., вплив на рослини, вирощені в умовах закритого
ґрунту, досліджено на базі лабораторії комплексних досліджень ДП
“Науково-дослідного агрокомбінату “Пуща-Водиця” разом з к.б.н.
Калмиковою Н.А.
Аналіз результатів, їхнє узагальнення, інтерпретацію даних та
формулювання основних положень і висновків дисертації здобувачем
проведено під керівництвом наукового керівника дисертаційної роботи
д.б.н. Г.О. Іутинської.
Робота Петрук Т.В. отримала відзнаку учасника ІХ конкурсу
науково-технічних проектів “Інтелектуальний потенціал молодих вчених –
місту Києву” за проект у напрямку “Новітні біотехнології” (2004 р.) та
грант Національної Академії Наук України у конкурсі проектів
науково-дослідних робіт молодих учених НАН України (2005 р.).
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на 6-й міжнародній Пущинській школі-конференції молодих
вчених “Биология – наука XXI века” (Пущино, Росія, 17-21 травня 2002
р.); конференції “Еколого-біологічні дослідження на природних та
антропогенно-змінених територіях” (Кривий Ріг, 13-16 травня 2002 р.); X
міжнародній конференції студентів і аспірантів з фундаментальних наук
“Ломоносов – 2003” (Москва, Росія, 17 квітня 2003 р.); міжнародній
науковій конференції “Біологічні науки і проблеми рослинництва” (Умань,
24-26 червня 2003 р.); міжнародній конференції “Современное состояние и
перспективы развития микробиологии и биотехнологии” (Мінськ, Білорусь,
26-28 травня 2004 р.); III (Х) з’їзді Товариства мікробіологів України
(Одеса, 15-17 вересня 2004 р.); ІХ конкурсі науково-технічних проектів
“Інтелектуальний потенціал молодих вчених – місту Києву” (Київ,
листопад, 2004 р.); конференції молодих вчених Академії Наук Молдови
(Кишинів, Молдова, 11 листопада 2004 р.); конференції молодих вчених
“Молодь і поступ в біології” (Львів, 11-14 квітня 2005 р.) Матеріали
дисертації доповідалися на конференціях молодих вчених ІМВ НАН України
(10-12 грудня 2002 р., 25-26 листопада 2003 р., 22-24 лютого 2005 р.).
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 13 робіт (5
статей, з них 4 статті у профільних журналах; 7 – у збірниках тез та 1 –
патент).
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 150
сторінках машинописного тексту і складається з “Вступу”, розділів “Огляд
літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, шести розділів результатів
власних досліджень, а також “Заключення” та “Висновків”. Список
використаних джерел містить 195 посилань (з яких 95 іноземних авторів).
Робота містить 9 таблиць та 33 рисунки.
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури представлено основні положення щодо застосування
засобів захисту рослин (хімічно синтезованих та біологічного
походження); синтезу стрептоміцетами антибіотиків, зокрема
антипаразитарної дії (авермектини). Описані шляхи підвищення
біосинтетичної активності стрептоміцетів-продуцентів антибіотиків
(популяційний аналіз, індукований мутагенез, оптимізація умов
культивування).
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
Розділ 2. Матеріали та методи досліджень
Об’єктами дослідження були: Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2161 (штам
1313), його варіанти 288 (УКМ Ас-2172) та 1088 (УКМ Ас-2177). Природний
штам виділений з чорнозему малогумусного Попельнянського району
Житомирської області (Україна); мікробні угруповання чорнозему
малогумусного та сірого опідзоленого ґрунту; нематоди виду Meloidogyne
incognito; огірки сортів “Конкурент” та “Анжеліна” (гібрид F1).
Гетерогенність культури перевіряли на 13-ти синтетичних та органічних
агаризованих середовищах за схемою, яка була запропонована В.Д.
Кузнєцовим для стрептоміцетів [Кузнецов В.Д., 1972].
Для виявлення максимальних потенційних можливостей синтезу
авермектинового комплексу селекціонованими варіантами S. avermitilis, їх
культивували на рідких середовищах на основі соєвого борошна та
картопляного відвару (г/л): ССм: соєве борошно – 15, сухі дріжджі – 5,
глюкоза – 20; СС10: соєве борошно – 16, сухі дріжджі – 4, кукурудзяний
екстракт – 4,8 мл, CaCO3 – 4, K2HPO4 – 1, крохмаль – 23, глюкоза – 70;
СС11: соєве борошно – 12, сухі дріжджі – 6, CaCO3 – 6, кукурудзяний
екстракт – 3, глюкоза – 30; СС12: соєве борошно – 14, дріжджовий
екстракт – 2,5, NaCl – 1, глюкоза – 45; СС13: соєве борошно – 12, сухі
дріжджі – 5, кукурудзяний екстракт – 3, CaCO3 – 4,5, K2HPO4 – 0,5;
глюкоза – 60; СС14: відвар 200 г картоплі в 1 л води, CaCO3 – 3, MgSO4 –
0,2Ю, глюкоза – 20; СС15: соєве борошно – 12, дріжджовий автолізат – 4,
кукурудзяний екстракт – 3, CaCO3 – 4,5, K2HPO4 – 0,5, глюкоза – 50 [Burg
R.W. et al., 1984; Черменский Д.Н. и др., 1991; Мосин В.А., 1993;
Ісаєнко В.М. та ін., 2001 ].
Як посівний матеріал використовували штам S. avermitilis, вирощений у
соєвому середовищі впродовж однієї доби на ротаційній качалці (n=240
об/хв) при 28оС. Посівний матеріал брали у кількості 5% до об’єму
поживного середовища. Культивування проводили в колбах об’ємом 750 мл в
умовах постійного обертання на ротаційній качалці (n=240 об/хв) при
28оС.
Визначення оптимальної концентрації глюкози проводили шляхом
культивування S. avermitilis варіанту 1088 на середовищі СС10. Змінювали
концентрацію глюкози від 3% до 7%, внесення глюкози проводили одноразово
або у два етапи, додаючи 4% глюкози на початку культивування та 3% на
4-у добу росту. Авермектинсинтезувальну активність визначали на 7-у та
14-у добу росту.
При дослідженні складу ліпідів та жирних кислот (ЖК) культуру S.
avermitilis вирощували на середовищі СС10, у запропонованій нами
модифікації [Петрук Т.В. та ін., 2005].
Чисельність мікроорганізмів основних еколого-трофічних груп у ґрунті
визначали за загальноприйнятими методиками на агаризованих поживних
середовищах [Методы почвенной микробиологии и биохимии, под ред.
Д.Г. Звягинцева, 1991].
Середню кількість колоній-утворюючих одиниць (КУО) в 1 г сухого ґрунту
обраховували за формулою: N=K·С·10х; де N – кількість КУО в 1 г
абсолютно сухого ґрунту, К – коефіцієнт вологості ґрунту, 10х –
розведення ґрунтової суспензії, С – середня кількість колоній на чашці.
Статистичну обробку проводили за допомогою пакету програм Microsoft
Exel.
Вивчення впливу на авермектинсинтезувальну здатність S. avermitilis
регуляторів росту рослин (РРР) проводили в середовищі СС10 з додаванням
Емістиму С, Івіну або Агростимуліну. Зазначені РРР були розроблені у
Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України ?Пономаренко
С.П., 1999?. Культивування проводили в колбах об’ємом 750 мл в умовах
постійного обертання на ротаційній качалці (n=240 об/хв) при 28оС.
Культуру S. avermitilis у середовищі СС10 із додаванням стимуляторів
вирощували сім діб, кількість синтезованих авермектинів визначали
загальноприйнятими методами [Дриняев В.А. и др., 1993; Мосин В.А. и др.,
1993; Викторов А.В. и др., 1999].
Популяційний аналіз стрептоміцетів проводили зі споровою суспензією
культури, отриманої загальноприйнятим методом [Кузнецов В.Д., 1972].
Суспензію спор 14-ти добової культури обробляли ультрафіолетовим
опроміненням (УФ) [Дриняев В.А. и др., 1994]. Для цього 1 мл суспензії
спор вносили в стерильні, хімічно-чисті чашки Петрі з рівним дном
(d=90мм), по одній чашці на кожну дозу опромінення. Як контроль
використовували 1 мл вихідної суспензії без обробки УФ. Обробку УФ
здійснювали за допомогою лампи БУВ-15. Дози опромінення при цьому
становили (Дж·сек/мм2): 0,72·107; 1,44·107; 2,88·107; 4,32·107;
8,64·107; 12,96·107; 17,28·107; 21,60·107; 25,98·107; 30,24·107;
34,56·107; 38,88·107; 69,12·107.
Оцінку виживання культури залежно від тривалості опромінення
ультрафіолетом проводили шляхом обліку кількості колоній, які виросли
після 10 діб росту при 28?С [Лаврінчук В.Л. та ін., 1997]. На 14-у добу
відсівали ізоляти та визначали їх здатність синтезувати авермектини
[Дриняев В.А. и др., 1996].
Обробку спор N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідином (НГ) проводили
концентрацією 2 мг/мл протягом 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150 хв.
Після обробки спори осаджували центрифугуванням (15000 об/хв протягом 5
хв.), промивали цитратним буфером та знову осаджували. Ресуспендували
промиті спори в 1 мл 20% гліцерину [Дриняев В.А. и др., 1993; Дриняев
В.А. и др., 1996]. Кожну порцію обробленої спорової суспензії після ряду
десятикратних розведень висівали на ISP–3 [Shirling E.B., Gottlieb D.,
1966]. На 14-у добу проводили відсів ізолятів з подальшим визначенням їх
здатності синтезувати авермектини.
Етанольні екстракти з міцелію S. avermitilis УКМ Ас-2161 та його
варіантів отримували за Дриняевим В.А. [1996].
Якісну оцінку здатності культури до синтезу авермектинів проводили
методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на сілікагелевих пластинах
Sorbfil (виробник АО “Сорбполімер”, Росія) в системі
гексан-ацетон-етанол (56:24:4) [Дриняев В.А., 1996]. Хроматограми
проявляли шляхом їх обробки 0,75%-вим розчином перманганату калію
протягом 5 хв. Контролем був стандартний розчин авермектинів “Аверсектин
С” для хроматографії виробництва НВО “Фармбіомед”. За плямами, що
утворились на хроматографічних пластинках, встановлювали наявність
компонентів авермектинів в досліджуваних екстрактах.
Концентрацію авермектинів в етанольних екстрактах визначали
колориметричним методом, в основі якого лежить кольорова реакція Біаля –
процес зміни інтенсивності поглинання світла при ?=630-640 нм продуктом
взаємодії авермектинів з орцином [Мосин В.А., 1993]. Вміст авермектинів
оцінювали за інтенсивністю поглинання, використовували калібрувальний
графік, побудований за різними концентраціями препарату авермектинів
фірми “Merck” (США). Здатність до продукування авермектинів оцінювали за
кількістю авермектинів (мкг) в 1 мл етанольного екстракту з одиниці
біомаси міцелію стрептоміцету.
Компонентний склад авермектинового комплексу та співвідношення окремих
фракцій у відсотках до загальної їх кількості визначали методом
високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) у системі етанол –
ацетонітрил – вода (55:22,5:22,5) на приладі Beckman System Gold
[Викторов А.В., 1999].
Ліпіди міцелію S. avermitilis УКМ Ас-2177 досліджували методом Фолча,
модифікованим в лабораторії “Produsi microbieni” Інституту мікробіології
АН Республіки Молдова [Rastimesina I.О., 2001].
Кількісний та якісний склад ліпідів визначали методом тонкошарової
хроматографії на пластинках “Silufol” марки UV-254 в системі гексан –
диетиловий ефір – льодяна оцтова кислота (73:25:5). Проявлення ліпідів
на хроматограмах проводили шляхом їх обробки 10%-вим етанольним розчином
фосфомолібденової кислоти. Аналіз спектрів ліпідних фракцій проводили за
допомогою комп’ютерної програми Total Lab.
Аналіз жирнокислотного складу ліпідів проводили на газовому хроматографі
НР 6890 [ГОСТ Р 1486-99. Получение метиловых эфиров жирных кислот,
2001].
Порівняльне вивчення впливу авермектинового комплексу Аверком,
синтезованого S. avermitilis УКМ Ас-2177, інсектициду біологічного
походження Фітоверму, а також хімічно синтезованих препаратів Регенту і
Моспілану на мікробні угруповання чорноземного та сірого опідзоленого
ґрунтів досліджували в лабораторних умовах. У досліді використовували
інсектициди в дозах, рекомендованих до використання у
сільськогосподарському виробництві [Перелік пестицидів, 1999]. У
контрольному варіанті пестициди не використовували, у дослідних вносили
їх водні розчини і витримували в горщиках протягом 10 діб при
температурі 20 – 22о С. Після чого у відібраних зразках ґрунту на 5-у,
20-у та 50-у добу досліджень визначали кількість мікроорганізмів
основних еколого-трофічних груп.
Дослідження впливу авермектинового комплексу на мікробні угруповання
ґрунту ризосфери огірків сорту “Конкурент” проводили в умовах
вегетаційного досліду. Сірий опідзолений ґрунт (Київська область)
змішували з промитим річковим піском у співвідношенні 3:1 і заповнювали
цією сумішшю глиняні горщики по 3 кг у кожний. Одночасно з висаджуванням
насіння огірків у ґрунт вносили авермектиновий комплекс Аверком (AVE),
синтезований S. avermitilis УКМ Ас-2177. Для напрацювання дослідних
партій Аверкому культуру вирощували на рідкому поживному середовищі СС10
в умовах періодичного культивування протягом 7 діб; AVE виділяли шляхом
екстракції етиловим спиртом за методикою, описаною вище [Дриняев В.А.,
Берёзкина Н.Е. и др., 1996] і визначали концентрацію авермектинового
комплексу в етанольному екстракті, що є основою препарату Аверком.
Біомасу відділяли центрифугуванням і вносили в ґрунт у кількості 6 г/ кг
ґрунту, культуральну рідину, що залишилася після центрифугування вносили
в ґрунт у кількості 66 мл/ кг ґрунту. Для порівняння використовували
стандартний розчин авермектину В1 – Івермектин у концентрації 2 мкг/мл.
Вегетаційний дослід проводили протягом 50 діб при температурі 24 – 28оС,
вологість ґрунту на рівні 65 – 70% від повної вологоємності підтримували
шляхом поливу. Протягом досліду відбирали зразки ризосферного ґрунту на
5-у, 20-у та 50-у добу.
Об’єктом для визначення антинематодної активності Аверкому були широко
розповсюджені у тепличних ґрунтах галові нематоди роду Meloidogyne, які
викликають захворювання кореневої системи овочевих культур –
мелоідогиноз ?Сігарьова Д.Д., Болтовська О.В. та ін., 1999; .2002;
2002?.
Нематоди у кількості 10-20 особин розміщували в мікрокомірки, де їх
культивували в 100 мкл 0,1 М фосфатного буферу з рН від 5,5 до 8,0 за
присутності різних концентрацій авермектинів. Спостереження проводили
протягом 0,5-4 годин при Т 28 ? 10С. Повторність досліду трикратна.
Нематоцидну активність Аверкому визначали шляхом порівняння LD50
досліджуваного зразку з стандартним препаратом Івермектин відповідної
концентрації [Дриняев В.А. и др., 1994].
Вивчення впливу авермектинового комплексу Аверком на рослини, вирощені в
умовах закритого ґрунту, проводили на базі лабораторії комплексних
досліджень ДП “Науково-дослідного агрокомбінату “Пуща-Водиця”. Вплив
Аверкому на огірки сорту “Анжеліна” (гібрид F1) вивчали у порівнянні зі
стимулятором росту рослин Імуноцитофітом (виробник ЗАО Агропромислова
компанія “ГИНКГО”, Росія).
Контролем у досліді була ділянка без обробки рослин препаратами.
Дрібноділянковий дослід проводили в 4-х повтореннях відповідно Методиці
дослідної справи в овочівництві та баштанництві ?2001?. Рослини
висаджували в закритому ґрунті (щебінь) на площі 5 м2, густина посіву 2
– 3 рослини на 1 м2. Препаратами обробляли розсаду огірків, які
вирощували в гідропонних теплицях.
Вплив Аверкому на огірки визначали за такими показниками: висота рослин
(см), довжина міжвузль (см), кількість листя (шт), площа листя (см2),
кількість генеративних органів (шт), урожай (ц/га) та ураження
шкідниками.
Розділ 3. Селекція Streptomyces avermitilis
Для дослідження спонтанної мінливості та з метою виділення найбільш
активного природного ізоляту штам S. avermitilis УКМ Ас-2161 висіяли на
13 поживних середовищ.
В результаті розсіву S. avermitilis УКМ Ас-2161отримали велику кількість
різноманітних варіантів колоній, що свідчить про гетерогенність
культури. Найбільшу кількість морфотипів колоній S. avermitilis УКМ
Ас-2161 виявлено на глюкозо-картопляному агарі (ГКА) (рис. 1):
Тип I (основний): колонії складчасті і опуклі, край колонії
валикоподібний, у центрі розташована кратероподібна заглибина.
Повітряний міцелій (ПМ) добре розвинений сірого кольору з коричнюватим
(буруватим) відтінком, з білими вкрапленнями і без них, з вузьким білим
обідком по краю. Субстратний міцелій (СМ) світло-коричневий,
сіро-коричневий або темно-коричневий, іноді з жовтуватим відтінком.
Розчинний пігмент (РП) відсутній або світло- чи темно-коричневий (до
чорного) (рис. 1, І).
Тип ІІ (олігоспоровий): колонії складчасті, опуклі, з валикоподібним
краєм і
І
ІІ
ІІІ
ІV
Рис. 1. Основні типи колоній
Streptomyces avermitilis
УКМ Ас-2161 на ГКА
кратероподібною серединою, добре опушені. ПМ білого кольору. СМ
жовтувато-бурого або коричневого кольору. РП відсутній (рис. 1, ІІ).
Тип III (білий). Колонії опуклі, складчасті із впадиною (кратером) в
центрі. Споруляція слабка. ПМ білого кольору, СМ жовто-рудий з
палево-кремовим кільцем, РП бурий (рис. 1, ІІІ).
Тип IV (аспорогенний): колонії опуклі із складчастим профілем, по центру
розташований кратер. ПМ відсутній. СМ тілесного, кремового кольору або
світло-коричневий. РП відсутній (рис. 1, ІV).
Загалом на ГКА чисельність колоній типу І складала 72%, типу ІІ – 25%, а
колоній типу IV – 3% від загальної кількості.
Було встановлено, що культура S. avermitils УКМ Ас-2161 являє собою
гетерогенну популяцію з досить великою кількістю варіантів, відмінних
між собою не
тільки за морфологією колоній, але й за рівнем продукування
авермектинів. Така варіабельність підвищує ймовірність одержання
позитивних результатів при проведенні подальших селекційних робіт для
відбору високопродуктивних варіантів. Шляхом вивчення спонтанної
мінливості вдалося підвищити активність колекційного штаму S.
avermitilis УКМ Ас-2161 з 14-36 мкг/мл до 24-43 мкг/мл та відібрати
варіант 1-19 для подальшої роботи.
Варіант S. avermitilis УКМ Ас-2161 під номером 1-19 виявився чутливим до
дії УФ. Високий летальний ефект останнього (23% виживання) спостерігався
вже при експозиції 10 с за дози опромінення 1,44·107 Дж·сек/мм2 (рис.
2). При подальшому збільшенні доз до 4,32·107 і 8,64·107 Дж·сек/мм2
виживання культури також різко знижувалось до 10,5% та 7,62% відповідно.
За дози опромінення більше як 17,28·107 Дж·сек/мм2 виживання коливалося
в межах 0,82-0,86%, а більше 25,92·107 – не перевищувало 0,01%.
Відбір варіантів з підвищеною біосинтетичною здатністю проводили серед
тих ізолятів, які виросли на чашках Петрі після розсіву суспензії спор,
опроміненої дозами 25,92·107, 30,24·107, 34,56·107, 38,88·107 та
69,12·107 Дж·сек/мм2, за умов дії яких виживання культури було в межах
0,01 – 0,005%.
Рис. 2 Крива виживання при УФ-опроміненні
За дози 30,24·107 Дж·сек/мм2 спостерігали найвищу частоту появи
активних варіантів – 61,5% (рис. 3).
Аналізуючи дію дози опромінення 34,56·107 Дж·сек/мм2, відмічаємо, що
частота появи активних та неактивних варіантів становила 19,5 та 35,65 %
відповідно. Вплив дози 69,12·107 Дж·сек/мм2 характеризувався найбільш
високою частотою появи неактивних варіантів – 48,5%, а частота появи
активних варіантів при цьому складала всього 17%. (рис. 3).
Після перевірки отриманих 190 ізолятів на здатність до синтезу
авермектинів було відібрано найбільш активний варіант під номером 288, у
якого рівень накопичення авермектинів становив 120 мкг/мл. В
компонентному складі авермектинового комплексу цього варіанту були
присутні всі чотири фракції авермектинів – А1, А2, В1, В2. Вміст фракції
В1 у цього варіанту був найвищим (рис. 4).
Таким чином, оптимальними для мутагенезу S. avermitilis є дози
опромінення УФ 30,24·107 та 34,56·107 Дж·сек/мм2, за дії яких отримано
варіанти з підвищеною біосинтетичною активністю. Шляхом індукованого
мутагенезу УФ вдалося підвищити біосинтетичну активність S. avermitilis
УКМ Ас-2161 варіанту № 1-19 майже у 3 рази, отримавши для подальшої
селекційної роботи варіант під номером 288, що мав активність 120
мкг/мл.
hR E
O
&
F
O
&
F
EHuy
s
s”s&s|s~s$t&tnaeTHIaeTHITHIaen?naeTHIaen?naeTHaen?naeTHIaeTHITHIaen?naeT
HIaeTHIaen?nIaeTHIaeTHITHIaeTHaeTHaeTHaeTHaeTHaeTHae?
O
O
uoeuoeuoenoeessessesseoenoeUoeIoenoeEoeuoeuoeuoeuoenoenoeAe1/2AeU¶U?U?U?
U?U?U?U?U?UAe1/2Ae1/2Ae
hR EEHuyAдібрані варіанти під робочими номерами 1088, 1110, 1171 та
1176, які містили в міцелії авермектиновий комплекс, що складався з
компонентів А1, А2 та В1. Подальші пересіви на ГКА та визначення
активності показали, що найбільш стійким вміст компоненту В1 залишався у
міцелії варіанту під робочим номером 1088.
Отже, селекція штаму S. avermitilis УКМ Ас-2161 шляхом спонтанної
мінливості та індукованого мутагенезу ультрафіолетовим опроміненням і НГ
дала змогу отримати активний варіант S. avermitilis УКМ Ас-2161 під
номером 1088, внесений у Українську Колекцію Мікроорганізмів під номером
УКМ Ас-2177. Цей штам мав здатність до синтезу авермектинів у кількості
600-900 мкг/мл.
Стабільність варіанту перевіряли впродовж наступного року. Показано, що
авермектинсинтезувальна здатність S. avermitilis УКМ Ас-2177 зоставалася
на рівні 600 – 900 мкг/мл.
Присутність в авермектиновому комплексі окремих фракцій та їх
співвідношення досліджували методом ВЕРХ. На рис. 5. представлені
хроматограми етанольного екстракту міцелію S. avermitilis УКМ Ас-2177 та
Аверсектину С (стандартного розчину комплексу авермектинів).
На хроматограмах піки досліджуваного комплексу відповідають
авермектиновим компонентам А1, А2, В1, В2. Найвищим був вміст фракції
авермектину В1, що має антипаразитарну дію, він становив 40% від
загальної кількості компонентів. Вміст інших компонентів був таким: А1 –
3%, А2 – 37%, В2 – 20%.
Таким чином, популяція S. avermitilis УКМ Ас-2161 виявилася досить
чутливою до мутагенних факторів. З використанням спонтанної мінливості
та індукованого мутагенезу вдалося отримати варіант 1088 (Ас-2177),
авермектинсинтезуюча здатність якого перевищувала активність природного
штаму у 20 разів. Авермектиновий комплекс, синтезований S. avermitilis
УКМ Ас-2177, був названий нами Аверком.
Рис. 5. Компонентний склад авермектинового комплексу
S. avermitilis УКМ Ас-2177 (A) і Аверсектину С (В), визначений методом
ВЕРХ
Розділ 4. Вплив умов культивування на синтез авермектинів S. аvermitilis
Для виявлення потенційної авермектинсинтезувальної здатності
селекціонованого активного штаму S. avermitilis УКМ Ас-2177 перед нами
постало завдання підібрати середовище оптимального складу для його
глибинного культивування. Були використані ферментаційні середовища на
основі соєвого борошна та картопляного відвару (СС10, СС11, СС12, СС13,
СС14, СС15), які мали різне співвідношення С/N від 9,6 до 30. У цьому
досліді ми не ставили за мету розробити склад економічно вигідного
середовища для промислового культивування продуценту, а підбирали
середовища, що нині використовують у виробництві та на яких
авермектинсинтезувальна здатність продуценту виявлялась в найбільшій
мірі. Результати показали, що максимальний рівень накопичення
авермектинів штам проявляв на середовищі СС10, де співвідношення С/N
було найвищим (30), що є одним з основних факторів біосинтезу
авермектину. Накопичення авермектинів у цьому середовищі становило 729
мкг/мл.
Динаміку накопичення авермектинів визначали, починаючи з 2-ої доби
росту. Пік активності штаму S. avermitilis УКМ Ас-2177 припадав на
кінець стаціонарної фази росту, коли загальний вміст авермектинів
становив 801 мкг/мл (рис. 6). Культура знаходилася у стаціонарній фазі
росту і приросту біомаси не спостерігалося.
Важливо було визначити, як змінюється компонентний склад авермектинів
впродовж культивування.
Впродовж росту стрептоміцета-продуцента на середовищі СС10 в якісному
складі авермектинового комплексу відбувалися певні зміни.
Рис. 7. Зміни компонентного складу S. avermitilis УКМ Ас-2177 протягом
культивування з 4-ї по 9-у добу (ТШХ)
Як видно з рисунку 7, протягом 2-4 діб культивування спостерігали
наявність лише однієї фракції – А1. При подальшому культивуванні, у
стаціонарну фазу росту культури реєстрували появу фракцій А2 та В1
(5-9-а доба). На 7-у добу фракція В1 була присутня в найбільшій
кількості, що підтверджено даними ТШХ. В подальшому активність синтезу
знижувалася та зменшувався вміст фракції В1. Так, на 8-у добу
культивування у складі авермектинового комплексу переважає фракція А1, а
на 9-у добу зменшується вміст усіх фракцій комплексу.
Отже, отримані дані показують, що є доцільним екстрагувати авермектини з
біомаси S. avermitilis на 7-у добу культивування. Саме тоді фракція В1,
що відповідає за антипаразитарну активність, виявляється у складі
комплексу в найбільшій концентрації.
Вміст глюкози в середовищах варіював від 3% до 7%, також проводили
внесення глюкози у два етапи: 4% на початку культивування і 3% на 3-у
добу росту, при цьому значення С/N у змінювалося від 19 до 30.
Авермектинсинтезувальну активність визначали на 7-у та 14-у добу
культивування, коли культура переходила у стаціонарну фазу росту.
Найбільшу кількість авермектинів культура S. avermitilis УКМ Ас-2177
синтезувала на 7-у добу росту за умов внесення 7% глюкози на початку
культивування (970 мкг/мл). При внесенні глюкози в середовище у два
етапи (4% глюкози на початку + 3% на 3-тю добу росту) найбільш висока
активність культури спостерігалася значно пізніше – на 14-у добу росту.
При цьому кількість синтезованого авермектинового комплексу була вищою
на 21% у порівнянні з внесенням глюкози у такій же кількості на початку
культивування і становила 1005 мкг/мл.
Внесення в середовище для культивування регуляторів росту рослин дало
змогу підвищити біосинтетичну здатність S. avermitilis УКМ Ас-2177.
Найбільшу стимулюючу дію на культуру проявив Івін у кількості 100 пл/мл
– накопичення авермектинів було на 26% вище, ніж у контролі (рис. 8).
При цьому накопичення біомаси було на рівні контролю. Як результат –
рівень накопичення авермектинів був найвищим і становив 1222 мкг/мл.
Розділ 5. Ліпідний та жирнокислотний склад міцелію S. avermitilis
У складі ліпідів S. avermitilis УКМ Ас-2177 були виявлені наступні
класи: фосфоліпіди, моно- та дигліцериди, стерини, вільні жирні кислоти,
тригліцериди, ефіри стеринів, воски. На ферментаційних середовищах
різного складу культура здатна утворювати ліпідів 7,54 – 12,19% від
сухої біомаси. В складі загальних ліпідів авермектинсинтезуючого штаму
S. avermitilis УКМ Ас-2161 переважали тригліцериди (до 45%), фосфоліпіди
(до 21%) та стерини (до 13%). Враховуючи те, що фосфоліпіди та
тригліцериди складають більшу частину загальних ліпідів, а їх кількість
зростає одночасно із збільшенням кількості синтезованих авермектинів,
можна припустити, що саме ці фракції відіграють важливу роль у синтезі
авермектинів (табл. 1.).
Таблиця 1.
Ліпіди S. avermitilis УКМ Ас-2177 за різних умов культивування
Поживні середовища Біомаса, г/л Авермектини, мкг/мл Загальні ліпіди, %
від біомаси Ліпідні фракції, відсоток до загальних ліпідів
Фосфоліпіди
Моно- та дигліцериди
Стерини
Вільні жирні кислоти
Тригліцериди
Ефіри стеринів
Воски
1* 27 975 7,54 4,42 45,23 5,77 13,41 1,96 8,47 10,4
2* 23 795 8,17 14,12 9,33 12,73 10,7 35,72 6,55 10,86
3* 29 828 9,63 13,68 11,83 15,59 5,98 39,89 2,22 10,8
4* 28 794 10,36 16,58 10,65 12,26 3,59 41,33 4,36 11,23
5* 32 1005 12,19 20,74 5,77 13,41 4,42 45,23 1,96 8,47
*Примітка:
1* –соєве середовище (СС10) з внесенням 7% глюкози один раз; С/N=30;
2* – соєве середовище (СС10) з Ѕ дози крохмалю 0,5 г/л ацетату натрію;
С/N=32;
3* – соєве середовище (СС10) з Ѕ дози крохмалю 1 г/л ацетату натрію;
С/N=34;
4* – соєве середовище (СС10) з Ѕ дози крохмалю; С/N=27;
5* – соєве середовище (СС10) з додаванням 7% глюкози у 2 етапи (4%
глюкози на початку культивування + 3% на 4-ту добу росту); С/N=19.
Встановлена пряма залежність між синтезом ліпідів і авермектинів – при
збільшенні кількості ліпідів в біомасі стрептоміцету збільшувалося
накопичення ним авермектинів. Так, при вмісті 7,54% загальних ліпідів у
біомасі продуценту накопичення авермектинів становило 975 мкг/мл, а при
12,19% – 1005 мкг/мл. Збільшення синтезу ліпідів на середовищі СС10 з
7,5% до 10,36% у варіанті з поживним соєвим середовищем при Ѕ дози
крохмалю приводило до збільшення синтезу авермектинів на 25%. Внесення
до ферментаційного середовища ацетату Na, крохмалю та внесення у два
етапи глюкози підвищувало продукування ліпідів S. аvermitilis на 7% у
порівнянні з контролем (табл. 1.). Одночасно у цьому варіанті
реєстрували збільшення кількості авермектинів в біомасі у 2 рази. У
варіанті з внесенням глюкози у два етапи, за даними ТШХ, зростає вміст
авермектинових фракцій А1 і В1, та з’являється фракція А2.
В жирнокислотному складі загальних ліпідів, виділених з міцелію
авермектинсинтезуючого штаму S. avermitilis УКМ Ас-2177 були виявлені
кислоти з кількістю вуглецевих атомів від 4 до 24, насичені і
ненасичені, з парним і непарним числом атомів вуглецю.
В значній кількості у складі жирних кислот були представлені лінолева
(від 38 до 47%), олеїнова (від 21 до 28%), та пальмітинова (від 12 до
15%) кислоти. У варіанті з внесенням глюкози у два етапи при зменшеному
вмісті крохмалю була присутня масляна кислота у кількості 0,8% та
відсутні капринова, каприлова, капронова і лауринова жирні кислоти, що,
можливо, пов’язане з використанням цих кислот як попередників у синтезі
авермектину. Так, у середовищі СС10 з додаванням 7% глюкози на початку
культивування накопичення авермектинів становило 720 мкг/мл. У випадку
додавання 4% глюкози + 3% на 4-ту добу росту, накопичення авермектинів
було лише 360 мкг/мл. При зменшенні в середовищі СС10 крохмалю,
накопичення авермектинів становило 1004 мкг/мл. Найвищий вміст
авермектинів – 1215 мкг/мл спостерігали у СС10 за Ѕ дози крохмалю та з
4% + 3% глюкози на 4-ту добу росту.
Кількість ненасичених жирних кислот визначає в значній мірі коефіцієнт
ненасиченості ліпідів досліджуваного штаму. Що стосується S. avermitilis
УКМ Ас-2177, то цей коефіцієнт коливався від 0,3 до 0,4 в залежності від
умов культивування. Додавання 7% глюкози на початку культивування у
середовища СС10 та СС10 з половиною дози крохмалю сприяло збільшенню
кількості насичених жирних кислот від С4 до С18. За умов вирощування на
середовищі СС10 та з внесенням глюкози у два етапи в біомасі переважали
жирні кислоти з більшою кількістю вуглецю від С18 до С23: стеаринова;
олеїнова; лінолева; ліноленова; нонодеканова; арахінова; арахідонова;
бегенова; ерукова; трикозанова; лігноцеринова та нервонова. Відсутність
жирних кислот від С6 до С12 при вирощуванні продуценту в середовищі СС10
(1/2 крохмалю; подвійне внесення глюкози) говорить про можливу
використання їх для побудови молекул авермектину, оскільки здатність до
накопичення авермектинів в цьому варіанті досліду була найвищою.
Розділ 6. Біологічна активність Аверкому
Біологічну активність авермектинового комплексу “Аверком”, що продукує
S. avermitilis УКМ Ас-2177, визначали за впливом на мікробні угруповання
ґрунту, рослини і нематоди.
Дослідження впливу авермектинів на чисельність мікроорганізмів основних
еколого-трофічних груп показали, що за внесення у ґрунт біомаси S.
avermitilis та культуральної рідини на 5-у добу спостерігали значне
зростання чисельності мікроорганізмів: педотрофних (А), амілолітичних
(Б), фосфатмінералізуючих (В), амоніфікуючих (Г) (рис. 9).
Рис.9. Чисельність мікроорганізмів у сірому опідзоленому ґрунті
А – педотрофні мікроорганізми; Б – амілолітичні мікроорганізми;
В – фосфатмінералізуючі мікроорганізми; Г – амоніфікуючі мікроорганізми
1 – контроль без внесення препаратів;
2 – Івермектин, 6,7?10-6 мкг діючої речовини (д.р.)/ 1 кг ґрунту;
3 – Aверком 4,2?10-6 мкг д.р./ 1 кг ґрунту; 4 – Aверком 6,7?10-6 мкг / 1
кг ґрунту;
5 – Aверком 8,3?10-6 мкг / 1 кг ґрунту;
6 – Біомаса (БМ) S. avermitilis;
7 – Культуральна рідина (КР) S. avermitilis.
Це зумовлено тим, що зазначені біологічні субстанції містять багато
поживних і біологічно активних речовин, які використовувалися
мікроорганізмами ґрунту як додаткові джерела живлення, внаслідок чого
чисельність зазначених мікроорганізмів зростала у 25-100 разів. Хоча
слід відмітити, що наприкінці досліду різниця у чисельності педотрофних,
амілолітичних, амоніфікуючих мікроорганізмів у ґрунті цих варіантів
порівняно з контролем була статистично недостовірною, а кількість
фосфатмінералізуючих бактерій зоставалась достовірно більшою, ніж у
контролі (рис. 9.В). Сам авермектиновий комплекс у концентраціях 1,25, 2
та 2,5 мкг/мл не виявляв пригнічуючої дії на чисельність мікроорганізмів
основних еколого-трофічних груп.
Як показали наші дослідження, Аверком стимулював ріст огірків на 15-у
добу після висадки – висота рослин була на 27% більшою у порівнянні з
контролем. В обидва строки вимірів зафіксовано суттєве збільшення площі
листя – на 17,2%. Аверком стимулював розвиток генеративних органів, що в
кінцевому результаті сприяло збільшенню урожаю рослин на 36% (табл. 2).
Його стимулююча дія не поступалася, а в деяких випадках і перевищувала
дію стандартного препарату Імуноцитофіту.
За три місяці вегетації урожай огірків порівняно з контролем збільшився
на 21% за умов обробки імуноцитофітом, і на 36% при обробці Аверкомом.
Це, швидше за все, пов’язано з тим, що в складі Аверкому можливо
присутні біологічно активні ліпідні фракції – фосфоліпіди, стерини та
жирні кислоти, як відомо, ці сполуки мають фітостимулюючу дію.
Таблиця 2.
Технологічні показники розвитку
культури огірка в залежності від обробки препаратами
Технологічні показники
Висота рослин, см
Довжина міжвузль, см
Кількість листя, шт
Площа листя, см2
Генеративні органи, шт
Термін спостережень, доба 15 20 15 20 15 20 15 20 15 20
Контроль 70,8 163,5 6,5 8,9 10 17 6,4 11,6 1,6 10,2
Обробка Імуноцитофітом 86,2 162,1 6,8 8,6 11 18 8,9 14,7 2,2 10,7
Обробка Аверкомом 90,3 169,6 7,3 8,7 12 18 7,4 13,8 2,4 10,4
Ефективність дії Аверкому проти нематод M. incognito вивчали в
лабораторних умовах. За контроль правив стандартний розчин Івермектину
(2 мкг/мл).
Найнижча з узятих в дослід концентрацій Аверкому (0,1 мкг/мл) починала
діяти на тест-об’єкт на 3 год. досліду, і викликала за цей період
загибель 50-53% нематод, від загального числа особин,
взятих у дослід. За 4 год. загинуло 60% нематод (рис. 10).
Повну загибель нематод спостерігали при концентрації препарату 2 мкг/мл
за 4 год., що співпадало з дією Івермектину за тих же умов.
Отже, комплексний препарат Аверком, що продукується S. аvermitilis, не
має негативної дії на мікробні угруповання ґрунту, стимулює ріст та
врожайність рослин, вирощених в умовах закритого ґрунту та за
нематоцидною дією не поступається дії стандартного препарату.
Зважаючи на позитивний вплив Аверкому на ґрунтову мікробіоту і рослини,
які вирощуються в умовах закритого ґрунту, а також його нематоцидну
активність, S. avermitilis УКМ Ас-2177 рекомендовано як перспективний
продуцент авермектинового комплексу для рослинництва.
ВИСНОВКИ
Шляхом багатоступеневої селекції з використанням спонтанної мінливості,
мутагенезу ультрафіолетовими променями і
N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідіном отримано вітчизняний штам –
продуцент S. avermitilis УКМ Ас-2177 з рівнем накопичення авермектинів
900-1200 мкг/мл.
Визначено, що оптимальним для культивування продуценту S. avermitilis
УКМ Ас-2177 є соєве середовище з вмістом глюкози 7%, при вирощуванні на
якому спостерігається максимальне накопичення авермектинів.
Визначено вплив на синтез авермектинів природних і синтетичних
регуляторів росту рослин, серед яких Івін у кількості 100 пл/мл
підвищував рівень синтезу авермектинів на 26%.
Встановлена пряма залежність між синтезом авермектинів та вмістом
ліпідів у біомасі високопродуктивного варіанту. Вперше показано, що
особливістю жирнокислотного складу S. avermitilis УКМ Ас-2177 є
присутність жирних кислот з кількістю вуглецевих атомів від С4 до С10.
Отримано новий комплексний препарат авермектинів – Аверком, синтезований
S. avermitilis УКМ Ас-2177, із вмістом активної фракції В1 не менше 40%.
Доведена відсутність негативної дії Аверкому на мікробні угруповання
ґрунту, здатність до стимуляції розвитку мікроорганізмів основних
еколого-трофічних груп за умов внесення біомаси та культуральної рідини
продуценту. Виявлена фітостимулююча дія Аверкому на рослини огірків,
вирощених в умовах закритого ґрунту.
Показана висока нематоцидна активність Аверкому по відношенню до галової
нематоди Meloidogyne incognito, збудника захворювання кореневої системи
овочевих культур – мелоідогинозу.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Петрук Т.В., Білявська Л.О., Козирицька В.Є., Муквич М.С. Підвищення
біосинтетичної активності Streptomyces avermitilis УКМ Ac 2161 під
впливом N-метил –N?-нітро-N-нітрозогуанідину // Мікроб. журнал. – 2004.
– т. 66 – № 6. – С. 24-30 (Здобувачем самостійно проведене вивчення
впливу нітрозогуанідину на популяцію Streptomyces avermitilis та
підготовлена стаття до друку).
Петрук Т.В., Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Муквич М.С., Іутинська
Г.О. Спонтанна та індукована мінливість Streptomyces avermitilis –
продуценту авермектинів // Наукові записки Тернопільського пед. універ.
Серія: Біологія. – 2003. – №1 (20). – С. 46 – 50. (Здобувачем самостійно
проведене дослідження гетерогенності популяції Streptomyces avermitilis,
опромінення ультрафіолетом, відбір активних варіантів та підготовлена
стаття до друку).
Петрук Т.В., Іутинська Г.О., Лінік В.В., Дзятківська Т.П., Калмикова
Н.О. “Вплив авермектинів на мікробні угруповання ґрунту та рослини” //
Науковий вісник Чернівецького університету: вип. 252. Біологія. – 2005.
– с. 193-199. (Здобувачем самостійно отримано авермектиновий комплекс,
проведена обробка рослин враховано результати та підготовлена стаття до
друку).
Ямборко-Костирко Н.А., Петрук Т.В., Іутинська Г.О. “Екологічна оцінка
впливу на ґрунтову мікрофлору інсектицидів та фунгіцидів.” // Уманський
збірник “Біологічні науки і проблеми рослинництва”. – Умань. – 2003. –
С. 242 – 246. (Здобувачем самостійно проведено екологічну оцінку впливу
інсектицидів на ґрунтову мікробіоту, участь у підготовці тез доповіді)
Пат. 69639 А, Україна С12N1/20. Штам Streptomyces avermitilis –
продуцент авермектинів, речовин антипаразитарної дії // Іутинська Г.О.,
Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Муквич М.С., Білявська Л.О., Петрук
Т.В. – № 2003109795; Заявл. 31.10.03; Опубл. 15.09.04, бюл. № 9.
(Здобувач особисто брала участь у селекції авермектинсинтезуючого штаму
Streptomyces avermitilis і підготовці матеріалів до патентування).
Петрук Т.В., Козирицька В.Є., Валагурова О.В Іутинська Г.О. Ліпіди
авермектинсинтезуючого штаму Streptomyces avermitilis УКМ Ас 2161 //
“Науковий вісник Національного Аграрного Університету”. – Київ. – 2005.
– Т.86. – С. 42 – 49. (Здобувач провела дослідження ліпідного складу і
підготувала статтю до друку).
Петрук Т.В., Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Іутинська Г.О.
Стрептоміцети – продуценти екологічно чистих речовин антипаразитарної
дії // Еколого-біологічні дослідження на природних та
антропогенно-змінених територіях. – Збірник тез. – Кривий Ріг. – 2002. –
С. 302-303.
Петрук Т.В., Иутинская Г.А. Синтез авермектинов почвенными
стрептомицетами // 6-я Пущинская школа-конференция молодых учёных, зб.
тез. – 2002. – 3. – С. 49-50.
Ямборко-Костырко Н.А., Петрук Т.В. Влияние на почвенную микробиоту
инсектицидов и фунгицидов – продуктов биологического и химического
синтеза // Международная конференция “Ломоносов-2003”. – сборник
тезисов. – Москва. – 2003. – С. 163.
Петрук Т.В., Белявская Л.А., Козирицкая В.Е., Муквич Н.С., Валагурова
Е.В., Иутинская Г.А. Получение активных вариантов Streptomyces
avermitilis – продуцентов авермектина // Международная конференция
“Современное состояние и перспективы развития микробиологии и
биотехнологии”. – Минск. – 2004. – С. 159-160.
Петрук Т.В., Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Болтовська О.В.,
Сігарьова Д.Д. Нематоцидна активність Streptomyces avermitilis УКМ Ас
2161 // ІІІ (Х) з’їзд Товариства мікробіологів України. – збірник тез –
Одеса. – 2004. – С. 70
Петрук Т. В., Козырицкая В. Е., Растимешина И.О., Бурцева С.А. Липиды
Streptomyces avermitilis УКМ Ас2161 // Conferinюa Tinerilor Cercetгtori
din Moldova. – Kisheneu. – 2004. – P.48.
Петрук Т. В., Козирицька В. Є., Валагурова О.В., Іутинська Г.О. Синтез
біологічно-активних речовин Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2161 //
Конференція молодих вчених “Молодь і поступ в біології” – зб.тез., –
Львів. – 2005. – с. 171-172.
АНОТАЦІЯ
Петрук Т.В. Синтез і біологічна активність авермектинового комплексу
Streptomyces avermitilis. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2005.
Дисертація присвячена вивченню здатності Streptomyces avermitilis УКМ
Ас-2161 та його варіантів до синтезу авермектинового комплексу і
дослідженню біологічної активності останнього.
Проведена робота по підвищенню біосинтетичної активності штаму
S. avermitilis УКМ Ас-2161 дала змогу збільшити шляхом спонтанної
мінливості та індукованого мутагенезу ультрафіолетовим опроміненням та
N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідином активність природного варіанту S.
avermitilis УКМ Ac-2161 в 20 разів, отримавши комплексний препарат
антипаразитарної дії Аверком з нематоцидною активністю, що містить не
менше 40% активної фракції В1.
В результаті досліджень отримано дані про вплив на синтез авермектинів
штамом S. avermitilis УКМ Ас-2177: активне продукування останніх
відбувається при культивуванні у соєвому середовищі за присутності 7%
глюкози. За присутності 0,5% ацетату Nа синтез збільшується на 16% та за
присутності регулятору росту рослин – Івіну (100 пл/мл) – на 26%.
Показано існування залежності між авермектинсинтезувальною активністю і
вмістом в біомасі продуценту тригліцеридів, фосфоліпідів та стеринів та
вперше виявлено у жирнокислотному складі S. avermitilis УКМ Ас-2177
жирні кислоти з кількістю вуглецевих атомів від С4 до С10.
Виявлено суттєве підвищення чисельності педотрофних, амілолітичних,
фосфат мобілізуючих та амоніфікуючих мікроорганізмів за умов внесення у
ґрунт біомаси, культуральної рідини S. avermitilis та різних
концентрацій Аверкому.
Вперше показано фітостимулюючу дію авермекинового комплексу Аверком та
його позитивний вплив на ріст і врожайність рослин закритого ґрунту.
Показано високу нематоцидну активність комплексу Аверком проти галової
нематоди M. incognito, що вражає сільськогосподарські культури.
Ключові слова: Streptomyces avermitilis, авермектини, селекція,
культивування, Аверком, біологічна активність.
АННОТАЦИЯ
Петрук Т.В. Синтез и биологическая активность авермектинового комплекса
Streptomyces avermitilis. – Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2005.
Диссертация посвящена изучению способности Streptomyces avermitilis УКМ
Ас-2161 и его вариантов к синтезу авермектинового комплекса и
исследованию его биологической активности.
Проведена селекция Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2161 с целью
увеличения биосинтетической активности. Используя изменчивость штамма,
мутагенез ультрафиолетовыми лучами и N-метил-N?-нитро-N-нитрозогуанидин
получено ряд высокопродуктивных вариантов, среди которых наиболее
устойчивым оказался вариант под номером 1088, зарегистрированный в
Украинской Коллекции Микроорганизмов как S. avermitilis УКМ Ас-2177.
Авермектиновый комплекс Аверком, продуцируемый этим вариантом, содержал
40% фракции В1, имеющей нематоцидную активность.
Исследования условий культивирования штамма S. avermitilis УКМ Ас-2177
показали, что высокое накопление авермектинов наблюдается в соевой среде
с содержанием 7% глюкозы; внесение в среду 0,5% ацетата Nа увеличивает
синтез на 16%, а регулятора роста растений Ивина (100 пл/мл) –на 26%.
В составе липидов S. avermitilis УКМ Ас-2177 обнаружены фосфолипиды,
моно- и диглицериды, стерины, свободные жирные кислоты, триглицериды,
эфиры стеринов и воска. Показано наличие прямой зависимости между
накоплением в биомассе авермектинов и таких липидных фракций как
триглицериды, фосфолипиды и стерины. В сумме общих липидов
авермектинсинтезирующего штамма S. avermitilis УКМ Ас-2177 преобладали
триглицериды (до 45%), фосфолипиды (до 21%) и стерины (до 13%).
В составе жирных кислот общих липидов мицелия штамма S. avermitilis УКМ
Ас-2177 были обнаружены кислоты с количеством углеродных атомов от 4-х
до 24-х, насыщенные и ненасыщенные, с парным и непарным числом углерода.
В большем количестве в составе жирных кислот были представлены линолевая
(от 38 до 47%), олеиновая (от 21 до 28%) и пальмитиновая (от 12 до 15%)
кислоты.
Впервые в жирнокислотном составе липидов S. avermitilis были обнаружены
жирные кислоты с числом атомов углерода от С4 до С10.
Установлено, что при внесении в чернозёмную почву Аверкома наблюдали
увеличение численности педотрофных, амилолитических и
целюлозоразрушающих микроорганизмов, а в серой оподзоленной почве
Аверком стимулировал рост целюлозоразрушающих, фосфатминерализирующих,
амилолитических, педотрофных микроорганизмов и стрептомицетов.
При внесении в почву биомассы, культуральной жидкости S. avermitilis УКМ
Ас-2177 наблюдали увеличение численности педотрофных, амилолитических,
фосфатмобилизирующих и амонификующих микроорганизмов.
Впервые показано фитостимулирующее действие Аверкома – урожайность
огурцов увеличивалась на 36% в условиях тепличного выращивания. При этом
снижался уровень заболеваемости растений корневыми гнилями и мучнистуой
росой.
Обнаружена высокая нематоцидная активность Аверкома по отношению к
галовой нематоде рода Meloidogyne incognito, что подтверждает
эффективность препарата. Наименьшая из взятых в опыт концентраций
Аверкома (0,1 мг/л) начинала действовать на тест-объект на 3-й час
опыта, доводя до гибели 50-53% нематод. За 4 часа погибало 60% нематод,
а полную их гибель наблюдали при концентрации препарата 2 мкг/мл за 4
часа, что совпадало с действием стандартного препарата в тех же
условиях.
Ключевые слова: Streptomyces avermitilis, авермектины, селекция,
культивирование, Аверком, биологическая активность.
SUMMARY
Petruk V. Tatyana. Synthesis and biological activity of Streptomyces
avermitilis avermectins complex. – Manuscript.
The candidate degree thesis by speciality 03.00.07 – microbiology.
Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of
Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.
The thesis is devoted to study of Streptomyces avermitilis UCM Ac-2161
and its variants ability to avermectins synthesis and to research of
avermectins complex biological activity.
It has been received highly productive variant S. avermitilis UCM
Ac-2177 using Ac-2161 variability, an ultraviolet and
N-methyl-N’-nitro-N-nitrozoguanidin. Avermectins complex Avercom
produced by this variant contained 40% of fraction B1 that had
nematocidic activity.
It is established that S. avermitilis UKM Ac-2177 active production of
avermectins is observed under cultivation at the presence of 7% of
glucose. Na acetate in the number of 0,5% increases of avermectins
synthesis by an 16%. The regulators of plant growth as Ivin (100 рl/ml)
stimulate the avermectins production by 26% accordingly.
Direct connection between avermectins accumulation in streptomycete
biomass and lipids fractions, such as triglyceride, phospholipids and
sterols is established.
Fatty acids with carbon atoms in the number from С4 up to С10 were found
out for the first time in lipids fatty-acids structure of S.
avermitilis.
The entering of S. avermitilis UCM Ac-2177 biomass, cultural liquid and
Avercom in different concentration separately to soil increased the
quantity of pedotrophic, amylolytic, phosphorus immobilizing and
amonificating microbes.
It was shown, for the first time, that Avercom is able to reveal not
only nematocidic but phytostimulating activity too.
Key words: Streptomyces avermitilis, avermectins, selection,
cultivation, Avercom, biological activity.
PAGE \* Arabic 2
(*107)
(*107)
Рис. 3 Частота появи активних варіантів S. avermitilis УКМ Ас-2161
(варіант 1-19) після дії різних доз УФ-опромінення
Рис. 4. Компонентний склад авермектинів у варіантах 284-288 культури S.
avermitilis
після УФ – опромінення (ТШХ)
Рис. 6. Динаміка накопичення
авермектинів S. avermitilis УКМ Ас-2177:
а – біомаса, г/л;
б – вміст авермектинів, мкг/мл.
Рис. 8 Вплив Івіну на синтез авермектинів S. avermitilis УКМ Ас-2177:
а – вміст аверметинів, мкг/мл;
б –біомаса, г/л
Рис. 10. Нематоцидна активність Аверкому
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
