КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
РАДИШ ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 618.396:612.112.94+576.8.097.3:615.373.3
Функціональний стан лімфоцитів жінок із звичним невиношуванням
вагітності за умов імунізації алогенними лейкоцитами
03.00.09 – імунологія
автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2005 р.
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті педіатрії, акушерства та гінекології АМН
України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Чернишов Віктор Павлович
Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України
завідуючий лабораторії імунології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник
Гавриленко Тетяна Іллівна
Інститут кардіології ім. акад. М.Д.Стражеска АМН України
завідуюча лабораторії імунології
доктор біологічних наук
Алексєєва Ірина Миколаївна
Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України
завідуюча відділом імунології та цитотоксичних сироваток
Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
Захист дисертації відбудеться “ 24 ” січня 2006
року о 1400 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м.
Київ, просп. Академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет,
ауд. 433.
Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул.
Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “ 22 ” грудня 2005 року
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук О.В.Молчанець
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. На сучасному етапі розвитку імунології репродукції
дослідження в галузі імунобіології та імунопатології вагітності
набувають все більшого значення, що обумовлено їх теоретичним та
практичним значенням. Відомо, що у модуляції імунної відповіді матері на
плід як на локальному, так і на системному рівні, задіяні практично всі
існуючі імунні механізми (Hill J.A., Choi B.C., 2000; Raghupathy R.,
2001; Croy B.A. et al., 2002; Mincheva-Nilsson L., 2003). Водночас
питання про нейро-імуно-ендокринну регуляцію взаємовідносин матері та
плоду, роль імунної системи матері в розпізнаванні вагітності та
механізми, які опосередковують імунну толерантність до плоду, досі не
отримали одностайних відповідей.
Практична значущість вивчення механізмів, які лежать в основі імунного
врегулювання взаємовідносин матері і плоду, визначається тим, що значна
частина звичного невиношування вагітності виникає через імунологічні
чинники (Coulam C.B., 1992; Lopez B.H.H. et al., 1995; Billington W.D.,
1999). Вивчення патогенезу та розробка нових методів діагностики та
лікування невиношування є приоритетними питаннями сучасного акушерства
(Венцківський Б.Н., Венцківська І.Б., 1997; Коханевич Є.Г. та ін.,
2001), оскільки невиношування – найпоширеніша патологія вагітності
(Кулаков В.И., Сидельникова В.М. 1996; Сидельникова В.М., 1999). Проте
серед дослідників немає одностайності у поглядах на роль імунних
факторів у патогенезі звичного невиношування, а особливості
активаційного стану та супресорної функції лімфоцитів під час
фізіологічної і патологічної вагітності вивчені недостатньо.
Підтвердження участі імунної системи у розвитку невиношування порушує
питання про застосування імунотерапевтичних заходів, спрямованих на
збереження вагітності. Імунізація алогенними лейкоцитами була одним з
перших методів імунотерапії, запропонованих для лікування невиношування
вагітності (Mowbray J.F. et al., 1985). Результатами досліджень
підтверджено високу клінічну ефективність такого лікування (Clark D.A.
et al., 2001; Malinowski A., 2001; Adachi H. et al., 2003; Clark D.A.,
2004). Проте механізми дії алоімунізації досі залишаються нез’ясованими,
що вважають за підставу для обмеження застосування такої імунотерапії
(Ober C. et al., 1999; Chaouat G., 2003). Ефективність алоімунізації для
збереження вагітності у жінок із звичним невиношуванням за відсутності
чітких уявлень про її вплив на материнську імунну відповідь на плід
засвідчує актуальність вивчення механізмів дії та оцінки
патогенетичності алоімунізації.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами темами. Робота виконана
в рамках науково-дослідних робіт Інституту педіатрії, акушерства і
гінекології АМН України “Патогенез та терапія передчасного переривання
вагітності при пізньому гестозі” (№ державної реєстрації 01.99.U 000310)
та “Вдосконалити та розробити діагностику та ефективні технології
лікування герпесвірусних інфекцій у вагітних” (№ державної реєстрації
01.02.U 001069).
Мета дослідження. Розкриття механізмів імунотерапевтичної дії імунізації
алогенними лейкоцитами на підґрунті характеристики її впливу на
функціональний стан лімфоцитів жінок із звичним невиношуванням
вагітності нез’ясованої етіології (ЗНВ).
Завдання дослідження.
Дослідити стан лімфоцитарних субпопуляцій, експресію маркерів активації
лімфоцитами та ConA-індуковану супресорну активність лімфоцитів у жінок
із ЗНВ в ранні терміни вагітності (4-7 тижнів) для визначення
імунопатогенетичних ознак зазначеної патології.
Вивчити вплив алоімунізації на стан лімфоцитарних субпопуляцій,
експресію маркерів активації лімфоцитами, ConA-індуковану супресорну
активність лімфоцитів та продукцію плацентарних протеїнів у вагітних із
ЗНВ для розкриття механізмів дії алоімунізації і оцінки її
патогенетичності.
Проаналізувати результати застосування імунізації алогенними лейкоцитами
жінок із ЗНВ залежно від наслідків вагітності та визначити
інформативність імунологічних показників для доклінічної оцінки
ефективності зазначеної імунотерапії.
Об’єкт дослідження – імунопатогенез звичного невиношування вагітності
нез’ясованої етіології та імунотерапевтична дія імунізації алогенними
лейкоцитами.
Предмет дослідження – лімфоцитарні субпопуляції, експресія маркерів
активації лімфоцитами, ConA-індукована супресорна активність, секреція
плацентарних протеїнів у жінок із ЗНВ в ранні терміни вагітності до та
після застосування алоімунізації і умовного плацебо.
Методи дослідження: імунологічні, культуральні, імунохімічні,
загальноклінічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботі отримано новітні дані
про підвищення експресії HLA-DR на CD3+ і CD8+ клітинах та зниження
експресії CD25 на CD3+, CD4+, CD8+ і CD16/56+ лімфоцитах в 4-7 тиж.
вагітності у жінок із ЗНВ порівняно із здоровими вагітними жінками.
Продемонстровано зв’язок низької експресії CD25 з низькою експресією CD8
на природних кілерах (ПК), високою експресією CD45RA на CD4+ клітинах і
високою експресією HLA-DR на CD8+ лімфоцитах. Підтверджено підвищення
вмісту CD16/56+ клітин і CD4+/CD8+ співвідношення та частоти виявлення
ефекту ConA-індукованої стимуляції, зниження ConA-індукованої
супресорної активності у жінок із ЗНВ порівняно із здоровими
вагітними жінками. Отримані результати дозволили визначити
імунопатологічні ознаки ЗНВ в ранні терміни вагітності: недостатність
генерації T-регуляторних (TR) лімфоцитів (CD4+25+) та лімітування
активованих Т-цитотоксичних клітин (CD8+DR+), затримка диференціації
наївних хелперів (CD4+45RA+) у клітини пам’яті, дефект супресорної
функції лімфоцитів (ConA-індукованої супресорної активності) та
активації природних кілерів (CD16/56+25+, CD3–8+). Таким чином, вперше
на підставі аналізу фенотипових особливостей і супресорної функції
лімфоцитів підтверджено недостатність системного плодо-материнського
імунного розпізнавання і формування неадекватної імунної відповіді на
плід в ранні терміни вагітності за звичного невиношування нез’ясованої
етіології.
Результатами роботи продемонстровано, що імунізація алогенними
лейкоцитами жінок із ЗНВ в 5-7 тиж. вагітності спричиняла повну
нормалізацію експресії маркерів ранньої (CD25) та пізньої (HLA-DR)
активації на Т-лімфоцитах, CD4+ і CD8+ клітинах, фізіологічне
відновлення стану активації ПК (експресії CD25 і CD8 на них), сприяла
нормалізації субпопуляційного складу (вмісту В-лімфоцитів та ПК) і
посиленню супресорної функції лімфоцитів. Отримані дані дали підстави
підсумувати, що механізми імунотерапевтичної дії алоімунізації
реалізуються за рахунок індукції генерації TR клітин, відновлення
супресорної функції лімфоцитів, елімінації активованих Т-цитотоксичних
лімфоцитів, регуляції активації ПК.
Новітніми є отримані в роботі результати про нормалізацію секреторної
функції плаценти внаслідок алоімунізації, що свідчить про формування
фізіологічних механізмів запобігання розвитку материнських ефекторних
реакцій, які уражують плодо-материнську інтерфазу. Аналіз динаміки змін
стану активації лімфоцитів після алоімунізації встановив значне
підвищення експресії CD25 на Т-лімфоцитах і ПК через 1 тиждень після
лікування з подальшою її нормалізацією через 2 тижні, що дозволило
обґрунтувати новий погляд на імунізацію алогенними лейкоцитами як засіб
додаткового антигенного стимулювання, який посилює процеси
плодо-материнського імунного розпізнавання та сприяє розвитку
фізіологічної висоти материнської імунної відповіді на плід.
Нормалізуючий вплив алоімунізації на плодо-материнські імунні
взаємовідносини підтверджений клінічними результатами застосування
зазначеної імунотерапії – 90 % збережених вагітностей у жінок із ЗНВ.
Практичне значення одержаних результатів. Результатами роботи
підтверджено ефективність імунізації алогенними лейкоцитами як методу
імунотерапії ЗНВ. Визначено умови проведення імунізації алогенними
лейкоцитами, за яких можливо досягти її високої (90 %) клінічної
ефективності: застосування алоімунізації у жінок із ЗНВ, що не мають
антифосфоліпідних антитіл; використання для імунізації
свіжовиділених клітин без їхнього зберігання; проведення
алоімунізації в ранні терміни вагітності – 5-7 тиж.; використання
донорських клітин для імунізації в разі збігу партнерів за антигенами
гістосумісності І класу.
Вперше показано, що ефективність алоімунізації значною мірою
визначається глибиною імунних порушень у жінок із ЗНВ. За умов
формування в 4-7 тиж. вагітності компенсаторних імунних змін, а саме
зниження експресії CD25 на ПК і підвищення експресії CD45RA на CD4+
лімфоцитах порівняно з фізіологічним перебігом вагітності, алоімунізація
є ефективною. В разі відсутності зазначених компенсаторних змін та
наявності підвищення експресії HLA-DR на СD4+ лімфоцитах, нестачі ТR
клітин не тільки в 5-7, але й в 4-6 тиж. вагітності, виявлення
ConA-індукованими лімфоцитами ефекту стимуляції, алоімунізація
виявляється неефективною.
В роботі опрацьовано нові підходи до доклінічної оцінки ефективності
імунізації алогенними лейкоцитами у жінок із ЗНВ залежно від
результатів імунологічного обстеження, що є підґрунтям для розробки
нових методів імунологічного моніторингу в практичному акушерстві. На
підставі отриманих результатів, запропоновано визначення експресії
HLA-DR на CD3+ лімфоцитах, клітинного співвідношення CD4+/CD8+, вмісту
CD3–8+ клітин, ConA-індукованої активності лімфоцитів та концентрації
глікоделіну до та після проведення алоімунізації для прогнозування
наслідків вагітності після зазначеної імунотерапії.
Результати роботи впроваджено у науково-дослідну роботу та клінічну
практику відділень наукових проблем невиношування вагітності, патології
вагітності і пологів, планування сім’ї Інституту педіатрії, акушерства
та гінекології АМН України та навчальний процес кафедри мікробіології та
загальної імунології Київського національного університету імені Тараса
Шевченка.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено опрацювання
літератури, визначена мета та основні задачі дослідження, здійснено
лабораторне імунологічне дослідження 286 зразків крові, одержаних від
100 вагітних жінок і 42 донорів лейкоцитів для імунізації. Клінічна
характеристика обстежених жінок та оцінка клінічної ефективності
застосування алоімунізації проведені спільно із співробітниками
відділення наукових проблем невиношування вагітності Інституту
педіатрії, акушерства та гінекології АМН України (зав. – д.мед.н., проф.
Писарєва С.П.). Особисто автором виконана статистична обробка та
проведено узагальнення одержаних в роботі результатів, за результатами
роботи підготовлені друковані праці, зроблено наукові доповіді.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
апробовані на Міжнародних форумах з репродуктивної імунології
(Магдебург, Німеччина, 1993, 1996 рр.), Міжнародних симпозіумах з
імунології репродукції (Київ, Україна, 1993, 1996 рр.), Міжнародному
симпозіумі з репродуктивної імунології (Казимерж-Дольний-на-Віслі,
Польща, 1995 р.), Міжнародному конгресі з імунології репродукції
(Вашингтон, США, 1995 р.), Міжнародному конгресі з імунології (Монреаль,
Канада, 2004 р.).
Публікації. За результатами роботи опубліковано 15 наукових праць: 6
статей, 4 з яких – у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК, та 9
тез доповідей.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 151 сторінці
комп’ютерного друку, проілюстрована 19 таблицями та 16 рисунками (3 з
яких розташовані на окремих сторінках), містить 1 додаток (займає 6
сторінок). Дисертація побудована за загальноприйнятим планом і
складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалу та методів
дослідження, трьох розділів власних результатів досліджень, аналізу і
узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій
та списку використаної літератури, що містить 316 джерел (займає 25
сторінок).
ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал та методи дослідження. Для досягнення мети та розв’язання
завдань, поставлених в роботі, проведено імунологічне дослідження 199
зразків крові від 58 вагітних жінок, які за клінічними та анамнестичними
критеріями відповідали акушерському анамнезу звичне невиношування
нез’ясованої етіології і діагнозу загроза переривання вагітності, та 45
зразків крові від 42 соматично здорових вагітних жінок з необтяженим
акушерсько-гінекологічним анамнезом і фізіологічним перебігом вагітності
(контроль).
58-ми жінкам із ЗНВ проведене імунологічне обстеження в 4-6 та 5-7 тиж.
вагітності. 45 жінок, що були серонегативними за антифосфоліпідними
антитілами, були відібрані для проведення лікування алоімунізацією. 31
жінка отримала алоімунізацію в 5-7 тиж. вагітності, з них 3 – імунізацію
клітинами донора (через збіг за антигенами гістосумісності з чоловіком)
та 28 – лейкоцитами чоловіка. Зазначену імунотерапію проводили в день
приготування лейкоцитів для імунізації без їхнього зберігання, клітини у
кількості (100?20) млн. вводили внутрішньошкірно. 14-ти жінкам через
неможливість отримати достатню кількість клітин для імунізації в 5-7
тиж. вагітності проведено умовне плацебо (розчин глюкози), 13 з них у
8-10 тиж. отримали алоімунізацію. Обидва типи лікування проводили на
фоні базисної терапії. Для оцінки впливу алоімунізації і умовного
плацебо жінки обстежувалися двічі після лікування – через 1 та 2 тижні.
Досліджені показники вагітних жінок із ЗНВ порівнювали з такими в
контрольних групах з урахуванням термінів вагітності, в яких проводилося
обстеження (контроль 1 – 4-7 тиж., контроль 2 – 7-10 тиж.).
У зразках цільної крові визначали вміст лімфоцитів різних субпопуляцій
(CD3+ Т-ліфоцити, CD19+ В-лімфоцити, CD16/56+ природні кілери (ПК),
CD3+4+ Т-хелпери, CD3+8+ Т-цитотоксичні клітини) та експресію маркерів
CD45RA і HLA-DR на лімфоцитах методом двоколірної проточної цитометрії з
використанням моноклональних антитіл та цитометру FAСScan (Becton
Dickinson, США). Визначення експресії CD25 на лімфоцитах здійснювали
аналогічним методом на виділених мононуклеарних клітинах після їхньої
інкубації з субоптимальними дозами фітогемаглютинину впродовж ночі. Для
дослідження супресорної функції лімфоцити преінкубували протягом 48 год.
з високими дозами конканаваліну А (СonA, кінцева концентрація 60
мкг/мл), після чого їх обробляли мітоміцином С і досліджували їхній
ефект на проліферацію донорських лімфоцитів в присутності
фітогемаглютинину. Плацентарні протеїни хоріонічний гонадотропін (ХГ) і
глікоделін, а також антифосфоліпідні IgG антитіла визначали
імуноферментним методом в сироватках крові. Типування лімфоцитів за
антигенами гістосумісності І клісу жінок із ЗНВ та чоловіків (донорів)
здійснювали в комплемент-залежному цитотоксичному тесті.
Для статистичної обробки отриманих даних використовували: в разі
нормального (гаусового) розподілу даних вибірки – критерій Student td; в
разі розподілу, відмінного від нормального, – критерій Mann-Whitney U
(для оцінки різниці між різними групами), критерій Wilcoxon Т (для
оцінки різниці в межах однієї групи в динаміці до або після лікування),
метод множинних порівнянь Frideman (для оцінки різниці в динаміці
протягом всього обстеження). Зв’язки між показниками оцінювали за
коефіцієнтом кореляції Spirman rs (для оцінки зв’язку між кількісними
показниками) або точковим бісекторіальним коефіцієнтом кореляції rpb
(для оцінки зв’язку між кількісним і якісним показниками). Результати
представляли у вигляді середніх значень та стандартної похибки (M?m).
Всі обчислені критерії вважали за статистично вірогідні, коли рівень
значущості Р був менший за 0,05.
Результати досліджень, їх аналіз і узагальнення. У крові жінок із ЗНВ в
4-6 та 5-7 тиж. вагітності спостерігалося зниження вмісту В-лімфоцитів і
клітин з фенотипом CD3–8+, які відображають експресію CD8 на ПК, та
підвищення вмісту ПК, співвідношення CD4+/CD8+ і кількості наївних
клітин-хелперів (СD4+45RA+) (табл. 1) за збереження нормальної кількості
Т-лімфоцитів, Т-хелперів, ЦТЛ та співвідношення СD3+4+/CD3+8+ порівняно
із здоровими вагітними жінками. Експресія HLA-DR була значно підвищеною
на CD3+ та CD8+ лімфоцитах, але незмінною на CD4+ клітинах у жінок із
ЗНВ в 4-6 та 5-7 тиж. порівняно з показниками контролю. Водночас вміст
CD3+25+, CD8+25+ та СD16/56+25+ виявився значно зниженим в 4-6 та 5-7
тиж., так само як і вміст СD4+25+ в 5-7 тиж., у жінок із ЗНВ порівняно
із здоровими вагітними жінками (табл. 2).
Таблиця 1
Вміст CD19+, CD16/56+, CD3–8+ лімфоцитів (%), клітинне співвідношення
CD4+/CD8+ і експресія CD45RA на CD4+ клітинах у крові вагітних жінок
із звичним невиношуванням (M?m)
Групи обстежених n CD19+ CD16/56+ CD4+/CD8+ CD3–8+ % CD45RA
на CD4+
Вагітні із ЗНВ
(4-6 тиж.) 58 10,4?0,4* 16,7?0,7* 1,44?0,04* 4,3?0,3* 37,1?1,7*
Вагітні із ЗНВ
(5-7 тиж.) 54 9,9?0,3* 17,1?0,7* 1,48?0,05* 3,9?0,3* 35,0?1,9*
Контроль 1
(4-7 тиж.) 22 12,3?0,6 11,3?0,6 1,30?0,08 8,0?0,6 29,0?2,0
Примітка. * – pja( * A ue O O O hCS*B* O ????$?&?1Ikd Oe Oe O l-0!o#?& ¤ ¤Ikd
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
