КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
РАЄЦЬКА ЯНА БОРИСІВНА
УДК 616.33-22.44:539.1.047
Молекулярні механізми внутрішньоклітинної передачі сигналу за умов
злоякісного росту та променевої терапії
03. 00. 04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії
біологічного факультету Київського національного університету імені
Тараса Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Остапченко Людмила Іванівна,
Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри біохімії
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник
Палладіна Тетяна Олександрівна,
Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України,
провідний науковий співробітник
відділу клітинної біології та анатомії рослин
доктор біологічних наук
Дружина Микола Олександрович,
Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України,
завідувач відділу радіобіології
Провідна установа: Чернівецький національний університет
імені Юрія Федьковича МОН України, м. Чернівці
Захист відбудеться 23.05. 2005 року о 1400 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова,
2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний
факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул.
Володимирська, 58
Автореферат розісланий 14.04.2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Онкологічні захворювання серед населення різних країн
досягли загрозливого рівня. В Україні така тенденція прискорюється
активними чинниками забрудненого довкілля, зокрема, внаслідок аварії на
ЧАЕС. Вибір вірної стратегії лікування та розробка його нових способів
потребує розуміння молекулярних механізмів виникнення злоякісних
новоутворень, з’ясування яких є актуальною проблемою фундаментальної
біології.
Променева терапія є одним із засобів радикального лікування злоякісних
новоутворень, поряд із хірургічним і хіміотерапевтичним лікуванням.
Локальний вплив іонізуючої радіації на пухлину в період експотенційного
росту обумовлює загибель її клітин за механізмами некрозу й апоптозу
[Little, 2000]. Одночасно променева терапія призводить до появи в
організмі додаткових ініціаторів ліпопероксидації. Від цього в тій чи
іншій мірі страждають здорові органи й системи організму, знижується їх
загальна й протипухлинна резистентність, що полегшує розвиток рецидивів
і метастазів пухлини [Boutin, 1996]. Під час неопластичної трансформації
клітин спостерігається накопичення великої кількості онкогенних
продуктів, які є нормальними або спотвореними елементами сигнальних
систем ростових факторів. Різноманітні ростові фактори, у свою чергу,
виконують функцію регуляції росту, диференціювання й імунної відповіді
лімфоїдних клітин. У складний і багатоступеневий процес неопластичної
трансформації залучено численні механізми, що включають порушення
експресії певних генів, аномальну продукцію цитокінів, гіперекспресію їх
рецепторів, спотворення передачі регуляторних сигналів від специфічних
рецепторів плазматичної мембрани до ядра клітини. До таких механізмів
слід віднести ряд внутрішньоклітинних сигнальних систем, ключовими
ланками яких є протеїнкінази. Їх активність може змінюватись під впливом
різних онкогенних факторів [Burke, 1997]. Клітини в стаціонарному
динамічному стані потребують нормального функціонування її ферментних
систем, зокрема, тих, що приймають участь у трансдукції сигналів. Серед
них особливе значення має месенджерний каскад, вторинними посередниками
в якому є циклічні нуклеотиди (цАМФ, цГМФ). Зміни внутрішньоклітинної
концентрації цАМФ і цГМФ призводять як до гальмування, так і до
активації метаболізму та диференціювання клітини, що залежить від фази
клітинного циклу, тривалості й кінетики змін концентрацій циклічних АМФ
і ГМФ [Кострикіна, 1993]. Особливого значення набувають дослідження
активності мембранозв’язаних ферментів та особливостей процесів їх
вільнорадикального окиснення ліпідів (ВРОЛ), що обумовлюють цілісність
структури та нормальне функціонування мембран у клітинах. Відомо що,
утворення різноманітних продуктів реакцій пероксидного окиснення ліпідів
(ПОЛ), може гальмувати проліферативну активність клітин, тоді як
зниження концентрації вільних радикалів призводить до прискорення поділу
клітин. Інгібітори вільнорадикальних реакцій ? антиоксиданти відіграють
значну роль у регуляції каскаду реакцій ПОЛ.
Проте сучасний рівень знань щодо молекулярних механізмів трансдукції
сигналів в клітинах різного походження за умов злоякісного росту та
променевої терапії для з’ясування їх ролі в цих процесах недостатні,
виникає необхідність подальших досліджень у даному напрямку.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії
біологічного факультету Київського національного університету імені
Тараса Шевченка та виконана у рамках теми № 01 БФ 036-04 “Розробка
наукових основ пошуку біологічно-активних сполук радіорезистентної дії”,
підрозділ “Оцінка фізико-хімічного, структурного та функціонального
стану мембран лімфоцитів та тимоцитів за умов дії опромінення та
корекція змін метаболічного статусу клітин біологічно-активними
речовинами” (№ державної реєстрації 0101U002291).
Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було з’ясування
молекулярних механізмів трансдукції сигналів у клітинах різного
походження при розвитку карциноми Герена, локальному рентгенівському
опроміненні тварин у терапевтичних дозах, а також застосуванні
антиоксидантів природного походження.
Для досягнення мети були поставлені такі завдання:
1. Оцінити стан системи ПОЛ у тканинах, пухлині й плазмі крові щурів із
карциномою Герена після локального рентгенівського опромінення пухлини у
терапевтичній дозі, і перорального введення антиоксидантів природного
походження.
2. Визначити активності аденілатциклази (АЦ), гуанілатциклази (ГЦ) та
фосфодіестерази (ФДЕ) цГМФ і цАМФ у тканинах селезінки, тимусу та
пухлини щурів до і після опромінення пухлини в дозі 10 Гр та
перорального введення антиоксиданту АММІВІТ.
3. Дослідити вміст циклічних нуклеотидів у тканинах селезінки, тимусу та
пухлини щурів до і після опромінення пухлини в дозі 10 Гр та
перорального введення препарату АММІВІТ.
4. Визначити активності цАМФ-залежної протеїнкінази (А-кінази),
цГМФ-залежної протеїнкінази (G-кінази), Са2+-фосфоліпідзалежної
протеїнкінази (С-кінази) та тирозинової протеїнкінази в тканинах
селезінки, тимусу та пухлини щурів до і після опромінення в дозі 10 Гр і
при застосуванні препарату АММІВІТ.
Об’єкт дослідження: функціональний стан системи ПОЛ та трансдукції
сигналу.
Предмет дослідження ? біохімічні механізми проходження сигналів у різних
клітинах тканин за умов злоякісного росту та дії рентгенівського
опромінення в терапевтичних дозах.
Методи дослідження ? біохімічні (визначення активності ферментів,
продуктів ПОЛ), радіологічні, спектрофотометричні (визначення вмісту
продуктів ПОЛ), електронно-мікроскопічний метод та методи математичної
статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексне
дослідження впливу локального рентгенівського опромінення на процеси ПОЛ
і трансдукції сигналів при злоякісному рості та при застосуванні
препаратів, одержаних із кісточок винограду. Установлено, що введення
щурам із прищепленою карциномою Герена антиоксидантів ActiVin та
Pycnogenol приводило до зниження вмісту продуктів ПОЛ та підвищення
активності антиоксидантних ферментів супероксиддисмутази (СОД) та
каталази. Показано, що опромінення щурів на фоні пухлинного процесу
призводило до порушень трансдукції сигналів у циклонуклеотидзалежному
каскаді, що виявляється через зниження вмісту цАМФ і збільшення вмісту
цГМФ на фоні зростання активності АЦ та падіння активності ГЦ. За цих
умов спостерігалися також зміни активності ферментів системи білкового
фосфорилювання (циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ,
Са2+-фосфоліпідзалежної протеїнкінази та тирозинзалежної протеїнкінази).
Комбінований вплив препарату АММІВІТ та радіотерапії нормалізував
систему трансдукції сигналів, що була порушена при злоякісному рості.
Таким чином, виявилось, що препарати рослинного походження ActiVin,
Pycnogenol та АММІВІТ з антиоксидантними властивостями, мають
протипроменеву та антистресову спрямованість.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані щодо впливу
випробуваних препаратів рослинного походження на процеси трансдукції
сигналу та ПОЛ за умов променевої терапії та злоякісного росту показали,
що вони можуть бути впроваджені в клінічну практику для підвищення
ефективності комплексної терапії при онкологічних захворюваннях. Крім
того, антиоксидантні препарати рослинного походження ActiVin та АММІВІТ
мають перевагу над існуючими за їх придатністю для тривалого
застосування в умовах опромінення, і тому вони можуть бути запропоновані
як профілактичні засоби для населення на територіях із високими рівнями
забруднення радіонуклідами.
Особистий внесок здобувача. Здійснення інформаційного пошуку та
узагальнення літературних даних, проведення експерименту, аналіз та
теоретичне обґрунтування результатів дослідження виконано дисертантом
особисто. Планування та розробка методичних підходів виконання комплексу
експериментальних досліджень проведені з науковим керівником д.б.н.,
професором Остапченко Л.І.
Досліди стосовно підтвердження виявлених біохімічних закономірностей на
щурах із прищепленою карциномою Герена були проведені сумісно з д.м.н.,
проф. Барабоєм В.А., д.б.н. Зінченко В.А., Білоконем Ю.М.
Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної
роботи доповідались на: ІІІ з’їзді з радіаційних досліджень (Київ,
2003); Російській науковій конференції “Медико-биологические проблемы
противолучевой и противохимической защиты” (Санкт-Петербург, 2004).
Матеріали роботи було представлено на: ІІІ конкурсі науково-технічних
проектів за напрямком “Новітні біотехнології. Діагностика й методи
лікування найпоширеніших захворювань.”, де робота здобула відзнаку
(Київ, 2003); на конкурсі Київського національного університету імені
Тараса Шевченка на здобуття премії імені Тараса Шевченка, де робота
здобула премію (Київ, 2004).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 статей у
фахових виданнях, 3 тези доповідей у збірниках наукових конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі
вступу, огляду наукової літератури, експериментальної частини, висновків
та списку літературних джерел (214 найменувань). Роботу викладено на 152
сторінках друкованого тексту, проілюстровано 8 рисунками та 9 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
В дослідах використовували білих лабораторних щурів-самців масою 130±10
г, (розведення віварію УНДІОР), яких утримували на стандартному раціоні
віварію.
Тваринам трансплантували карциному Герена шляхом підшкірної ін’єкції у
ділянку стегна задньої кінцівки 20%-ної суспензії пухлинних клітин на
0,9%-му розчині NaCI, отриманих від щура-донора за методикою [Западнюк
та ін., 1983; Барабой, 1991].
Частині тварин щоденно, протягом 7-ми діб після прищеплення пухлини і до
локального опромінення перорально вводили антиоксидантні препарати
ActiVin? („InterHealth Nutritionals Incorporated”, Concord, CШA) в дозі
25 мг/кг маси, Pycnogenol? („Zepter”, Group, США) в дозі 25 мг/кг маси
та АММІВІТ (“Львівський фарм. завод”, Україна) в дозі 30 мг/кг маси
тварин, як рекомендовано у роботі [Золотарьов та ін., 1998].
Досліджувані препарати ? антиоксиданти рослинного походження.
Біологічно-активні речовини ActiVin? і Pycnogenol? ? препарати
закордонного виробництва, їх вітчизняний аналог ? АММІВІТ, який є
вітамінним концентратом витяжки з кісточок винограду (як і препарат
ActiVinтм).
При дослідженні ПОЛ та молекулярних механізмів трансдукції сигналу
пухлину на 8-му добу після прищеплення піддавали локальному
рентгенівському опроміненню в терапевтичних дозах на апараті РУМ?17 за
таких умов: напруга ? 180 кВ, сила струму ? 10 мА, фільтри ? 0,5 мм Cu
+1,0 мм Al, потужність дози ? 123 Р/хв, шкірно-фокусна відстань ? 25 см.
Тварин декапітували через 1, 3 та 7 діб після локального опромінення.
Вміст ТБК-активних продуктів ПОЛ у плазмі крові та тканинах визначали за
методом [Барабой, 1991]. Активність СОД визначали використовуючи метод
[Поберезкін та ін., 1989], що базується на здатності ферменту
конкурувати з НСТ за супероксидні аніони, які утворюються в результаті
аеробної взаємодії НАДН і ФМС. Активність каталази у плазмі крові та
тканинах щурів визначали як рекомендовано в роботі [Королюк та ін.,
1988], що базується на здатності перекису водню утворювати із солями
молібдену стійкий забарвлений комплекс.
Вміст циклічних нуклеотидів, активність протеїнкіназ та ФДЕ визначали в
цитозольній фракції клітин, яку отримували використовуючи рекомендації
[Древаль, 1989].
Вміст циклічних нуклеотидів у лімфоїдних клітинах визначали за методом
[Steiner, 1972]. Активність циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ
проводили за рекомендаціями [Gill at all., 1979]. Визначення активності
Са2+,фосфоліпідзалежної протеїнкінази проводили за методом [Mire, 1985].
Визначення активності тирозинових протеїнкіназ проводили за
рекомендаціями [Boutin, 1996]. Активність ФДЕ визначали використовуючи
методом тонкошарової хроматографії на пластинках Silufol [Лазаревич та
ін., 1979]. Активність ГЦ визначали за методом послідовної хроматографії
на колонках Аl2О3 і Dawex, використовуючи рекомендації [Nakasava at
all., 1976]. Визначення активності АЦ проводили як рекомендовано в
роботі [White, 1974].
Активність усіх досліджуваних протеїнкіназ визначали за включенням 32Рн
із (?-32Р/-АТФ) до білкових субстратів фосфотрансферазної реакції.
Радіоактивність вимірювали в толуольному сцинтиляторі ЖС-107, на
лічильнику “Delta-300“ (США). Питому активність ферментів виражали в
пмоль 32Рн за 1 хв на 1 мг білка.
Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами статистики
[Плохинський, 1981; Кучеренко та ін., 2001].
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Останнім часом лікування злоякісних новоутворень ґрунтується на
індивідуальному підході щодо вибору заходів. Радіотерапія залишається
одним із головних методів лікування злоякісних новоутворень, поряд із
хірургічним і хіміотерапевтичним лікуванням. Проте променева терапія
призводить до стресового стану в організмі, який проявляється, зокрема,
у пригніченні захисних протипухлинних реакцій. Тому доцільно
застосовувати радіозахисні препарати, у тому числі антиоксидантів, що
здатні стимулювати адаптаційні механізми, підвищуючи загальну
радіорезистентність організму. Існує ціла низка робіт, щодо перебігу
біохімічних процесів при злоякісному рості та за умов радіотерапії, але
ті механізми, що функціонують у процесах передачі сигналів у клітині,
залишаються мало дослідженими. Крім того, досі не було з’ясовано вплив
біологічно-активних препаратів на вищезгадані процеси.
Було досліджено ключові компоненти ПОЛ та активність антиоксидантних
ферментів у клітинах головного мозку, печінки, селезінки, тимусу,
пухлини та у плазмі крові щурів у різні терміни після опромінення
пухлини в дозі 25 Гр.
Значне зростання інтенсивності ПОЛ у тканинах головного мозку, печінки,
селезінки й крові щурів спостерігалося безпосередньо після локального
опромінення пухлини (таблиця 1).
Таблиця 1
Вміст ТБК-активних продуктів (нмоль/мг білка) в селезінці та пухлині
щурів із карциномою Герена після локального рентгенівського опромінення
(M ? m; n=6)
№ п/п Групи тварин, умови
досліду Термін досліджень після локального рентгенівського опромінення
15 хв
1 доба
3 доби
7 діб
Селезінка
1 Інтактні щури 77,9?1,3
2 КГ (контроль) 576,0?7,4* 286,5?4,2* 267,3?2,8* 213,3?2,7*
3 КГ + ЛРО 318,9?5,6* 273,7?3,9 231,8?4,3 142,6?1,8*
Пухлина
1 КГ (контроль) 169,2?3,4 148,4?2,3 69,0?1,1 46,1?3,3
2 КГ + ЛРО 200,5?3,5 329,5?4,1 101,84?1,9 216,2?3,4
Примітки (тут і далі):
1. * – вірогідні зміни порівняно з інтактними тваринами (р?0,05);
2. КГ – карцинома Герена;
3. ЛРО – локальне рентгенівське опромінення
Отже, на початковому етапі злоякісний процес викликає закономірне
підвищення вмісту ТБК-активних продуктів ПОЛ при злоякісному рості. В
останні терміни досліджень відбувалося значне зниження ТБК-активних
продуктів у пухлині, органах і плазмі крові. Досить високий рівень
ТБК-активних продуктів у пухлині, який був виявлений нами на 15 хв після
локального рентгенівського опромінення, на 7-му добу знижувався у 3,7
рази. Зниження рівня ТБК-активних продуктів ПОЛ в органах і крові щурів
може бути викликане зменшенням вмісту ліпідів та інших його субстратів,
внаслідок їх утилізації пухлиною, що росте.
Було встановлено, що в пухлинній тканині опромінення викликає істотне
підсилення ліпопероксидації, що є проявом деструктивної дії
антиоксидантних ферментів та променевої терапії.
Активність СОД та каталази знижувалась особливо у віддалені терміни
після дії радіації (таблиця 2). Отримані дані свідчать про те, що
механізми антиоксидантного захисту спрямовані на знешкодження продуктів
пероксидного окиснення в умовах пухлинного процесу. Можна припустити, що
зростання активності ферментів антиоксидантної системи, яке співпадає з
періодом підвищеної інтенсивності ПОЛ, відбувається завдяки вмиканню
адаптивно-компенсаторних механізмів захисту та підтримання
фізіологічного гомеостазу щурів. Радіоіндуковане пошкодження
білків-рецепторів може стосуватися трансдукції сигналів від мембрани
через різні клітинні месенджерні каскади. Тому ми дослідили ключові
компоненти клітинних сигнальних систем у імунних органах щурів за умов
пухлинного процесу при опроміненні.
Таблиця 2
Активність супероксиддисмутази (ум. од./мг білка) та каталази
(нмоль/хв?мг білка) в селезінці та пухлині щурів з карциномою Герена
після локального рентгенівського опромінення (M ? m; n=6)
№
п/п Групи тварин, умови
досліду Термін досліджень після локального рентгенівського опромінення
15 хв
1 доба
3 доби
7 діб
Активність супероксиддисмутази
Селезінка
1 Інтактні щури 1,20?0,01
2 КГ (контроль) 0,55?0,02* 0,62?0,02* 0,87?0,02* 0,54?0,1*
3 КГ + ЛРО 0,47?0,01* 0,51?0,01* 0,89?0,06* 0,38?0,1*
Пухлина
1 КГ (контроль) 0,48?0,01 0,51?0,02 1,41?0,04 0,83?0,1
2 КГ + ЛРО 1,01?0,02 0,94?0,05 1,03?0,02 0,80?0,1
Активність каталази
Селезінка
1 Інтактні щури 174,27?2,81
2 КГ (контроль) 77,08?0,94* 154,51?2,5* 83,02?2,35* 35,01?1*
3 КГ + ЛРО 94,21?0,9* 124,63?3,7* 64,12?1,1* 43,34?1*
Пухлина
1 КГ (контроль) 141,29?2,7 188,64?3,8 76,58?2,44 53,2?2,1
2 КГ + ЛРО 121,77?1,9 151,31?3,8 70,93?1,73 35,1?2,1
З літератури відомо, що інтенсивність вільнорадикальних процесів ПОЛ
взаємозв’язана із станом фосфоліпідів біомембран, і має надзвичайно
важливе значення для регуляторної і інформаційної ролі мембран
[Бурлакова, 1975]. Фізико-хімічний стан ліпідів мембран ? залежить від
складу, рівня ПОЛ, в’язкості та ін., істотно впливає на функціонування
мембранно-зв’язаних ферментів, зокрема, аденілатциклази [Лю, 1991].
Аденілат- та гуанілатциклази, а також ФДЕ цГМФ та цАМФ є ключовими
ферментами сигнальної системи циклічних нуклеотидів. Порушення їх
функціонування впливає на розвиток патологічних процесів. Показано, що
зміни рівня ПОЛ при опроміненні супроводжувались зміною активності
ферментів синтезу (зниження активності АЦ та підвищення активності ГЦ),
та гідролізу (ФДЕ) циклічних нуклеотидів. Показано дворазове зменшення
активності АЦ у селезінці, тимусі та пухлині порівняно з контролем як за
умов розвитку патології, так і на фоні опромінення. Активність ГЦ
збільшувалась у всі терміни після опромінення. Зміни активності ФДЕ цАМФ
у досліджуваних органах мали різноспрямований характер: так, у початкові
терміни досліджень в усіх органах активність ферменту понижувалась
порівняно з контрольними значеннями, в кінцеві терміни після опромінення
активність ФДЕ цАМФ незначно підвищувалась у лімфоїдних та пухлинних
клітинах. Активність ФДЕ цГМФ у селезінці і тимусі зменшувалась
незначно, здебільшого на 3-тю і 7-му добу після опромінення. Оскільки
досліджувані нами ферменти контролюють рівень циклічних нуклеотидів,
нами було досліджено вміст цАМФ та цГМФ у клітинах селезінки, тимусу та
пухлини за умов злоякісного росту та променевої терапії. Ми виявили
зміни рівня вторинних посередників (зниження концентрації цАМФ, та
підвищення концентрації цГМФ) у клітинах опромінених щурів із пухлинами.
Ефект спостерігався як у тканинах здорових органів, так і в пухлинах
(рис. 1).
Рис. 1. Вміст циклічних нуклеотидів цАМФ (А) та цГМФ (Б) у тканинах
селезінки, тимусу, пухлини щурів до і після опромінення пухлини:
1) контроль ? інтактні щури; 2) 8 діб після прищеплення пухлини;
3) 1 доба після опромінення; 4) 3 доби після опромінення; 5) 7 діб після
опромінення.
Отримані результати дають підстави припустити, що встановлені суттєві
радіоіндуковані зміни рівнів циклічних нуклеотидів пов’язані з
порушенням функціонуванням ферментів їх синтезу (АЦ та ГЦ).
4z¶b
?
u
?ueb
u
@
@
@
@
@
J
@
@
J
@
J
@
™
™-™oiaeioioioioioioioioiaOaOaOI?I?Ii?ioioiaeioiaeioiaeioiaeioiaeioiaeioi
aeioiaeioioi
@
@
J
@
@
$
@
@
??—?—?— —F{[kd^
@
kdn
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
@
??????¤?¤????? із карциномою призводить до порушення активності
циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ (А- і G-кіназ) та Са2+,
фосфоліпідзалежної протеїнкінази (С-кінази). Пострадіаційні зміни
активності відповідних протеїнкіназ були різними і залежали від типу
тканини та терміну дослідження. Особливий інтерес викликають дані, що
були отримані при визначенні активності тирозинової протеїнкінази за
умов радіаційного впливу при пухлинному процесі (рис. 2).
Рис. 2. Активність тирозинової протеїнкінази в тканинах селезінки,
тимусу, пухлини щурів до і після опромінення пухлини:
1) контроль ? інтактні щури;
2) 8 діб після прищеплення пухлини; 3) 1 доба після опромінення;
4) 3 доби після опромінення;
5) 7 діб після опромінення У тканинах усіх досліджуваних органів
активність цього ферменту після прищеплення карциноми Герена зростала,
що найбільшою мірою виявилось саме у пухлинних клітинах. Отримані дані
узгоджуються з літературними ? щодо збільшення тирозинкіназної
активності під час пухлинного процесу [Thompson, 1994]. Після
опромінення тирозинкіназна активність різко зменшувалась в тканинах
інтактних тварин і у неопромінених тварин із пухлиною. У той же час
активність інших А- , G- та С-кіназ не зазнавала такого чіткого падіння
при опроміненні. При цьому ефект опромінення на активність тирозинової
протеїнкінази був найбільш виявленим саме в пухлинних клітинах, де її
рівень був мінімальним порівняно зі здоровими клітинами селезінки та
тимусу.
Таким чином, можна вважати, що корегуючий вплив опромінення на злоякісні
клітини пов’язаний із зниженням спонтанно великої активності тирозинової
протеїнкінази, причому такий ефект спостерігається і у здорових органах.
Отже, радіотерапія на певному етапі динаміки розвитку пухлин приводить
до нормалізації біохімічних показників клітинного метаболізму. Кількісні
зміни вмісту циклічних нуклеотидів, а також активності ферментів їх
синтезу й гідролізу й тих, що каталізують завершені етапи проходження
сигналів, засвідчують участь регуляторних систем у формуванні
адаптаційних реакцій на пошкоджуючий вплив злоякісного росту та
радіації.
Відомо, що променева терапія призводить до порушення структури
мембранних ліпідів, що виявляється у дисбалансі ПОЛ [Барабой, 1996].
Оскільки радіація є пошкоджуючим фактором для організму, доцільно
застосувати радіозахисні препарати із властивостями антиоксидантів, які
були б здатні підвищувати загальну радіорезистентність організму та
стимулювати адаптаційні механізми.
У зв’язку з викладеним вище нами було вивчено вплив антиоксидантів
природного походження (ActiVin, Pycnogenol) на біохімічні механізми, що
залучені до протипухлинних захисних реакцій організму. Застосування
препаратів ActiVin та Pycnogenol знижувало патологічно високий рівень
ТБК-активних продуктів за умов опромінення у клітинах досліджуваних
органів (таблиця 3).
Таблиця 3
Вміст ТБК-активних продуктів (нмоль/мг білка) в селезінці та пухлині
щурів із карциномою Герена після локального рентгенівського опромінення
пухлини і перорального введення антиоксидантів (M ? m; n=6)
№
п/п Групи тварин, умови досліду Термін досліджень після локального
рентгенівського опромінення
15 хв
1 доба
3 доби
7 діб
Селезінка
1 КГ (контроль) 576,03?7,39* 286,5?4,2* 267,3?2,8 213,3?2,7*
2 КГ + ЛРО 318,93?5,6* 273,7?3,9 231,8?4,3* 142,6?1,8*
3 КГ +Ас +ЛРО 207,76?4,81* 146,86?2,98* 113,06?2,17* 57,71?1,32*
4 КГ +Рс + ЛРО 237,11?3,37* 257,74?4,15* 261,83?3,44* 79,14?1,18
Пухлина
1 КГ (контроль) 169,24?3,38 148,4?2,3 69,02?1,11 46,08?3,32
2 КГ + ЛРО 200,45?3,5 329,5?4,1 101,84?1,9 216,2?3,37
3 КГ +Ас +ЛРО 176,42?3,25 139,56?2,74 87,94?1,07 229,07?4,53
4 КГ +Рс + ЛРО 154,97?3,57 213,67?2,52 69,24?1,45 209,82?2,53
Примітки (тут і далі):
Ас — ActiVin,
2. Pc — Pycnogenol
Антиоксидантні препарати ActiVin та Pycnogenol пригнічували
радіоіндуковане зростання рівня ТБК-продуктів у пухлині та здорових
органах щурів (зокрема, селезінці) тому було доцільним вивчити їх вплив
на активність каталази та СОД ? ферментів антиоксидантної системи за
умов опромінення. Введення піддослідним тваринам антиоксидантів
викликало підвищення активності обох ферментів, що спостерігалось у
тканинах головного мозку, печінки, селезінки, пухлини й крові через 1
добу після опромінення. Отже, досліджувані препарати покращували стан як
здорових органів, так і пухлин щурів, що проявлялося у підвищені
активності антиоксидантних ферментів (таблиця 4).
Таблиця 4
Активність супероксиддисмутази (ум. од./мг білка) та каталази
(нмоль/хв?мг білка) в селезінці та пухлині щурів з карциномою Герена
після локального рентгенівського опромінення пухлини і перорального
введення антиоксидантів (M ? m; n=6)
№
п/п Групи тварин, умови досліду Термін досліджень після локального
рентгенівського опромінення
15 хв
1 доба
3 доба
7 доба
Активність супероксиддисмутази
Селезінка
1 КГ (контроль) 0,55?0,02* 0,62?0,02* 0,87?0,02* 0,54?0,1*
2 КГ + ЛРО 0,47?0,1 0,5?0,1 0,89?0,1 0,4?0,1
3 КГ+ Ас + ЛРО 0,24?0,01* 0,86?0,06* 0,52?0,04* 1,54?0,02*
4 КГ+ Рс + ЛРО 0,54?0,03 0,64?0,05 1,25?0,01* 1,21?0,03
Пухлина
1 КГ (контроль) 0,48?0,01 0,51?0,02 1,41?0,04 0,83?0,1
2 КГ + ЛРО 1,01?0,02 0,9?0,05 1,03?0,02 0,8?0,1
3 КГ+ Ас + ЛРО 0,92?0,04 0,73?0,02 0,8?0,07 1,20?0,03
4 КГ+ Рс + ЛРО 0,53?0,02 2,12?0,09 0,57?0,02 0,64?0,02
Активність каталази
Селезінка
1 КГ (контроль) 77,08?0,94* 154,51?2,5* 83,02?2,35* 35,01?1*
2 КГ + ЛРО 94,21?0,9* 124,63?3,7* 64,12?1,1* 43,34?1*
3 КГ+ Ас + ЛРО 110,44?4,84* 207,9?3,8* 122,1?1,1* 170,8?1,3*
4 КГ+ Рс + ЛРО 113,02?2,15* 187,9?2,9* 160,1?2,1* 176,1?1,9*
Пухлина
1 КГ (контроль) 141,29?2,7 188,64?3,8 76,58?2,44 53,2?2,1
2 КГ + ЛРО 121,77?1,9 151,31?3,8 70,93?1,73 35,1?2,1
3 КГ+ Ас + ЛРО 134,69?3,65 131,1?3,13 86,49?2,14 64,85?0,98
4 КГ+ Рс + ЛРО 178,97?3,04 193,3?4,06 63,96?2,15 45,23?1,88
Отримані результати дозволили зробити висновок про те, що
біологічно-активна речовина ActiVin, яка представляє собою препарат
рослинного походження і є проантоціанідином із кісточок винограду,
характеризується антистресовою та протипроменевою дією. Визначення
впливу біологічно-активної речовини АММІВІТ, що є вітамінним
концентратом витяжки з кісточок винограду, та з потужним антиоксидним
потенціалом [Гаділія, 2001], на основні шляхи проходження сигналу від
мембрани до ядра клітини показало, що він суттєво впливає як на
активність ключових ферментів у досліджуваних каскадах, так і на
функціонування систем, які залежать від концентрацій відповідних
месенджерних молекул.
На фоні введення АММІВІТу активність АЦ в усіх досліджуваних органах
щурів поступово знижується порівняно з контрольними значеннями за умов
злоякісного росту та опромінення, як це показано на рис. 3.
Рис. 3. Активність АЦ (А) та ГЦ (Б) в тканинах селезінки, тимусу,
пухлини щурів до і після опромінення на фоні перорального введення
препарату:
1) контроль ? інтактні щури; 2) 8 діб після прищеплення пухлини;
3) 1 доба після опромінення; 4) 3 доби після опромінення; 5) 7 діб після
опромінення
Активність ГЦ поступово зростає в лімфоїдних та пухлинних клітинах, що
на 3-тю добу опромінення набуває більш вираженого характеру.
Встановлено також, що введення АММІВІТу по-різному впливає на активність
циклонуклеотидзалежних ферментів. Активність ФДЕ цАМФ у досліджуваних
органах мала різноспрямований характер: так, у початкові терміни
досліджень в усіх органах вона знижувалась порівняно з контрольними
значеннями, а в кінцеві терміни після опромінення активність ФДЕ цАМФ
незначно підвищувалась у лімфоїдних та пухлинних клітинах. Активність
ФДЕ цГМФ у селезінці і тимусі незначно зменшувалась, більш вираженим це
було на 3-тю і 7-му добу після опромінення.
Дослідження вмісту вторинних посередників цАМФ та цГМФ за умов
пухлинного процесу та радіотерапії на фоні введення препарату АММІВІТ
показало зниження вмісту цАМФ, а також підвищенням вмісту цГМФ, особливо
на 8-му добу прищеплення та на 1-шу добу після опромінення. Отримані
дані дають підстави стверджувати, що введення препарату в організм
тварини підвищує його здатність протистояти пухлинному процесу, як
показано на рис. 4.
Рис. 4. Вміст цАМФ (А) та цГМФ (Б) у тканинах селезінки, тимусу, пухлини
щурів до і після опромінення на фоні перорального введення препарату:
1) контроль, інтактні щури; 2) 8 діб після прищеплення пухлини;
3) 1 доба після опромінення; 4) 3 доби після опромінення; 5) 7 діб після
опромінення
У зв’язку з викладеним особливо цікавим було дослідити активність
ферментів, функціональна здатність яких залежить від чинників, що були
вивчені, а саме цАМФ-, цГМФ-, Са2+ фосфоліпідзалежних, та тирозинової
протеїнкіназ за умов комплексної радіотерапії пухлини, а також при
введенні тваринам антиоксидантного препарату АММІВІТ (таблиця 5).
Таблиця 5
Активність цАМФ-залежної протеїнкінази (А-кінази), цГМФ-залежної
протеїнкінази (G-кінази) та Са2+-фосфоліпідзалежної протеїнкінази
(С-кінази) (пмоль/хв·мг білка) в тканинах селезінки щурів до і після
опромінення на фоні перорального введення (М ± m; n = 3-5)
Експериментальний стан А-кіназа G-кіназа С-кіназа
Контроль 9,3±0,9 4,0±0,2 29,7± 2,0
8 діб після прищеплення 9,6±0,7 21,7±3,1* 47,9±2,7*
1 доба після опромінення 10,6±1,3 20,1±3,1 55,0± 5,1
3 доби після опромінення 12,6±2,7 12,3±3,1* 61,4± 3,5
7 діб після опромінення 8,5 ±0,5* 12±1,7 34,2±3,7*
Дослідженнями протеїнкіназ (С-, А-, G-кінази) було встановлено зростання
їх активності у початкові терміни експерименту (1-3 доба після
опромінення). Таке підвищення активності ферментів можна розглядати як
захисну реакцію клітин на дію опромінення. Зростання активності також
може бути пов’язаним із уведенням щурам препарату АММІВІТ, який сприяє
мобілізації захисних реакцій організму, на пошкоджуючі впливи, а саме,
злоякісний ріст та локальне опромінення. В подальшому картина змінюється
? активність ферментів починає знижуватись до рівня контролю, що може
свідчити про негативний вплив пухлини на весь організм.
Далі ми дослідили вплив комплексної терапії пухлини, а саме локального
опромінення та введення АММІВІТу, на активність тирозинової
протеїнкінази (рис. 5).
Рис. 5. Активність тирозинової протеїнкінази в тканині селезінки щурів
до і після опромінення пухлини та перорального введення антиоксиданту:
1) контроль ? інтактні щури; 2) 8 діб після прищеплення пухлини; 3) 1
доба після опромінення; 4) 3 доби після опромінення;
5) 7 діб після опромінення
За умов лише пухлинного росту показники активності тирозинової
протеїнкінази перевищували контрольні значення. Після радіотерапії
картина суттєво змінювалася: так при введенні препарату АММІВІТ уже на
1-шу добу після опромінення активність тирозинової протеїнкінази
лімфоїдних клітин знижувалася в 2 рази порівняно з контролем і в 2,5
рази порівняно з групою тварин із прищепленою карциномою Герена без
опромінення. Таким чином, комбіноване застосування препарату АММІВІТ та
радіотерапії сприяло зниженню тирозинкіназної активності у лімфоїдних
клітин щурів на тлі пухлинного процесу.
Установлено, що введення анти- оксидантів нормалізує процеси ПОЛ та
підсилює ефективність адіотерапії пухлин шляхом корекції інших
досліджуваних нами показників. Основою для такого висновку є те, що
опромінення у терапевтичних дозах приводило до часткової нормалізації
функціонування ключових ланок регуляторних каскадів.
Таким чином, біологічно-активні речовини, які були отримані з кісточок
винограду, можуть бути запропоновані з метою профілактики та
комплексного лікування злоякісних новоутворень. Отримані результати щодо
зміни активності ключових ферментів аденілатциклазного та Са2+,
поліфосфоінозитольного регуляторних каскадів можуть бути використані з
метою ранньої діагностики злоякісного росту, а також для контролю
ефективності радіотерапії.
ВИСНОВКИ
Досліджено динаміку пероксидного окиснення ліпідів, ключових компонентів
антиоксидантної захисної системи й трансдукції сигналу в тканинах ряду
органів (головного мозку, печінці, селезінці, тимусі) та пухлинах
карциноми Герена щурів при локальному рентгенівському опроміненні
пухлини в терапевтичних дозах.
Після локального рентгенівського опромінення вміст ТБК-активних
продуктів знижувався на 3-тю і 7-му добу, активність супероксиддисмутази
й каталази зростала на 3-тю добу у тканинах головного мозку, печінки,
селезінки та пухлині щурів.
Активність аденілатциклази у селезінці та пухлині щурів зменшувалась
переважно на 3-тю і 7-му добу порівняно з контролем, активність
гуанілатциклази зростала на 1-шу і 3-тю добу після локального
опромінення.
Рівень цАМФ за умов опромінення пухлини знижувався на 3-тю і 7-му добу,
рівень цГМФ зростав переважно на 1-шу добу.
Опромінення пухлини приводить до зростання активності цАМФ-, цГМФ-,
Са2+, фосфоліпід-залежної протеїнкіназ на 1-шу і 7-му добу та зниження
активності тирозинової протеїнкінази на 1-шу добу досліджень.
Введення антиоксидантів рослинного походження сприяло нормалізації
процесів пероксидації та стану сигнальних систем у клітинах
досліджуваних органів і тканин.
СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Орел В.В., Дзятковська Н.М., Зінченко В.А., Данко М.Й., Вербій Я.Б.
(Раєцька Я.Б.), Мединець Ю.Р., Романов Ю.В., Мельник Ю.Г. Ефект
впливу ДВЧ-опромінення і механохімічно активованого доксорубіцину при
фізіологічній температурі на ДНК та культуру клітин карциноми молочної
залози людини МСF-7 // Фізика живого. – 2002. – Т. 10, №1. – С. 89-95.
(Здобувачем проаналізовано літературу, особисто досліджено вміст
продуктів пероксидації ліпідів в гомогенаті клітин, проведено
математичну обробку та аналіз результатів, підготовлено матеріали до
друку).
Білокінь Ю.М., Бендюг Г.Д., Раєцька Я.Б., Гриневич Ю.Я. Вплив
тимостимуліну і тироксину на пероксидне окиснення ліпідів та активність
антиоксидантних ферментів за експериментального гіпотиреозу у тварин //
Український біохімічний журнал. – 2002. – Т. 74, №6.- С. 108-113.
(Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено вміст продуктів
пероксидації ліпідів, визначено активність їх ферментів та обговорення
отриманих результатів).
Раєцька Я.Б., Остапченко Л.І. Роль антиоксидантів у біологічних процесах
// Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Біологія. – 2003.- Вип.40.- С. 63-65.
Raetska Ya.B., Belokon U.N., Baraboy V.A., Ostapchenko L.I. Сorrection
of oxidant-antioxidant homeostasisis in rats with Geren carcinoma in
radiotherapy // Фізика живого. – 2003. – Vol. 11, №1.- С. 89-94.
(Здобувачем визначено вміст продуктів пероксидації ліпідів, активність
антиоксидантних ферментів, обговорення отриманих результатів, проведено
математичну обробку та підготовлено матеріали до друку).
Раєцька Я.Б., Білокінь Ю.М., Прокопова К.В., Лукашова К.В. Оцінка дії
антиоксиданту (проантоціанідину) на злоякісний ріст при променевій
терапії // Вісник Київського національного університету імені Тараса
Шевченка. Біологія. – 2003.- Вип.41.- С. 118-120. (Здобувачем
проаналізовано сучасну літературу, визначено вміст продуктів
пероксидації ліпідів, активність антиоксидантних ферментів, обговорення
отриманих результатів та підготовлено матеріали до друку).
Raetska Ya.B., Ostapchenko L.I., Prokopova K.V. Effect of thymostimulin
and thyroxine on peroxidation of lipids and activity of antioxidant
enzymes in hypotyrosis // The 3rd congress on radiation research
“Radiobiology and radioecology”. – Kyiv, 2003. ? 420 p.
Раєцька Я.Б., Остапченко Л.І., Дробінська О.В., Прокопова К.В.,
Васильєва О.В. Вивчення впливу антиоксидантів за умов променевої терапії
та злоякісного росту // ІІІ з’їзд з радіаційних досліджень
“Радіобіологія і радіоекологія”. – Київ, 2003. ? 419 с.
Остапченко Л.И., Раецкая Я.Б. Изучение влияния антиоксидантов при
лучевом воздействии и злокачественном росте // Междунар. конф.
“Медико-биологические проблеми противолучевой и противохимической
защиты”. ? Санкт-Петербург, 2003. ? 316 с.
АНОТАЦІЯ
Раєцька Я.Б. Молекулярні механізми внутрішньоклітинної передачі сигналу
за умов злоякісного росту та променевої терапії. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.
Дисертаційна робота присвячена дослідженню ключових компонентів системи
трансдукції сигналу та особливостей процесів вільнорадикального
окиснення ліпідів за умов злоякісного росту карциноми Герена і
променевої терапії, а також вивченню дії антиоксидантних препаратів
природного походження на ці процеси з метою корекції променевого впливу
за допомогою лікувально-профілактичних засобів.
На підставі проведених досліджень встановлено, що опромінення призводить
до змін показників пероксидного окислення ліпідів та молекулярних
механізмів трансдукції сигналу за умов злоякісного росту. Порушення
процесів пероксидації в результаті опромінення супроводжувалося змінами
активності аденілат- та гуанілатциклаз, вмісту цАМФ та цГМФ, а також
ферментів, активність яких модулюється вищезазначеними чинниками (цАМФ-,
цГМФ-, Са2+,фосфоліпідзалежні протеїнкінази). Показано, що введення
лікувальних препаратів із властивостями антиоксидантів сприяє
нормалізації процесів пероксидації та стану сигнальних систем у клітинах
за рахунок підсилення ефективності застосованої радіотерапії. На цій
підставі антиоксидантні препарати можуть бути запропоновані для
профілактики та комплексного лікування злоякісних новоутворень.
Ключові слова: карцинома Герена, променева терапія, мембранозв’язані
ферменти, процеси вільнорадикального окиснення ліпідів, антиоксидантні
препарати.
АННОТАЦИЯ
Раецкая Я.Б. Молекулярные механизмы внутриклеточной передачи сигнала
при злокачественном росте и лучевой терапии. – Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук
по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный
университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2005.
Диссертационная работа посвящена исследованиям ключевых компонентов
трансдукции сигнала и особенностям процессов свободнорадикального
окисления липидов в условиях злокачественного роста карциномы Герена и
лучевой терапии, а также изучению действия препаратов природного
происхождения на эти процессы с целью коррекции лучевых повреждений с
помощью лечебно-профилактических средств.
На основании проведенных исследований было установлено, что облучение
приводит к изменениям показателей пероксидного окисления липидов и
молекулярных механизмов трансдукции сигнала при злокачественном росте.
Нарушение процессов пероксидации в результате облучения сопровождалось
изменением активности аденилатциклаз и гуанилатциклаз. Изменялось
содержания циклического аденозинмонофосфата и циклического
гуанозинмонофосфата, что было обусловлено пострадиационными изменениями
активности ферментов синтеза исследуемых циклических нуклеотидов. А
также изменялась активность цАМФ-, цГМФ-, Са2+,фосфолипидзависимой и
тирозиновой протеинкиназ, что было вызвано пострадиационными изменениями
в содержании основных модуляторов активности выше указанных ферментов.
Мы показали, что радиотерапия на определенном этапе динамики развития
опухоли приводит к нормализации биохимических показателей клеточного
метаболизма. Это свидетельствует о том, что регуляторные механизмы
принимают участие в формировании адаптивных реакций при злокачественном
росте. Было показано, что введение лечебных препаратов с
антиоксидантными свойствами нормализует процессы пероксидации, а также
состояние сигнальных систем в клетках, усиливая эффективность
радиотерапии. На этом основании антиоксидантные препараты могут быть
предложены для профилактики и комплексного лечения злокачественных
новообразований. Полученные результаты могут быть использованы для
диагностики злокачественных и доброкачественных новообразований.
Ключевые слова: карцинома Герена, лучевая терапия, мембранносвязанные
ферменты, процессы свободнорадикального окисления липидов,
антиоксидантные препараты.
SUMMARY
Raetska Ya. B. The molecular mechanisms of intracellular signal
transduction under the conditions of cancerous growth and radiotherapy.
? Manuscript.
Dissertation for the obtaining of the scientific degree of the
specialized in 03.00.04. – biochemistry. – Taras Shevchenko of National
University of Kyiv, Kyiv, 2005.
The dissertation contained investigation about peroxidation processes
and activities of some membrane-bound enzymes in rat tissues under
cancerous growth conditions and its correction by natural antioxidative
preparations treatment.
It has been shown that irradiation of rats with Geren carcinoma by
therapeutic doses of x-rays improved cell methabolic processes in tumor
and organs. The irradiation weakened there peroxidation processes and
activated antioxidative enzymes. Besides irradidtia partially normalized
function of signal systems by its effects on eheir enzymes. Positive
effect of complex theraphy inclucling irradiatich and natural
antioxidatsve preparations these biochemical indexes has been
established. It was established that administration of antioxidants
normalizes the lipid peroxidation processes and enhances the
radiotherapy effectiveness. Other confirmation is that irradiation in
therapeutic doses leads to partial normalization of abovementioned
cascades functioning. Antioxidant preparations are proposed for
prophylactic and complex treatment of malignant process.
Key words: Geren carcinoma, radiotherapy, membrane-bound enzymes,
free-radical lipid oxidation processes, antioxidant preparations.
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
