НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут молекулярної біології та генетики
РЕБЕЦЬ Юрій Васильович
УДК 575.224+577.21
Генетичні механізми регуляції біосинтезу ландоміцину е у штаму
streptomyces globisporus 1912
03.00.22 – молекулярна генетика
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано на кафедрі генетики та біотехнології Львівського
національного університету імені Івана Франка.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, доцент
Федоренко Віктор Олександрович,
Львівський національний університет
імені Івана Франка,
завідувач кафедри генетики та біотехнології.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,
член-кореспондент НАН України
Мацелюх Богдан Павлович,
Інститут мікробіології та вірусології
імені Д.К. Заболотного НАН України,
завідувач відділу генетики мікроорганізмів;
доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Кучук Микола Вікторович,
Інститут клітинної біології та генетичної
інженерії НАН України,
заступник завідувача відділу генетичної інженерії.
Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, Міністерство освіти і науки України, кафедра загальної та
молекулярної генетики, м. Київ.
Захист дисертації відбудеться 25 жовтня 2005 року о 10 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті
молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143,
Київ-143, вул. Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної
біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул.
Заболотного, 150.
Автореферат розіслано 23 вересня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук
О.В. Підпала
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Проблема пошуку нових антибіотичних речовин є однією
з найактуальніших у сучасній біотехнології. В першу чергу це зумовлено
поширенням явища множинної лікарської резистентності серед
мікроорганізмів та ракових клітин. Перспективними в цьому плані є
полікетиди, зокрема ті, що належать до групи ангуциклінів (Мацелюх і
співав., 1998; Поліщук і співав., 1996; Henkel et al., 1990).
Представниками цих природних сполук є ландоміцини – основні продукти
вторинного метаболізму штамів S. cyanogenus S136 та S. globisporus 1912
(Поліщук і співав., 1996; Depenbrock et al., 1996). Ці антибіотики
активні проти ряду ракових клітин, в тому числі карциноми Герена та
аденоми простати (Поліщук і співав., 1996; Depenbrock et al., 1996).
Окрім того, ландоміцини пригнічують ріст антрациклін-резистентних
пухлин, що є їхньою унікальною властивістю (Panchuk et al., 2004).
Значною перешкодою у вивченні цих антибіотиків є низький рівень їхньої
продукції, обмеженість даних щодо мішеней дії ландоміцинів у клітинах та
їхня висока загальна цитотоксичність. Це стимулює використання підходів
комбінаторного біосинтезу для створення нових похідних, одержання штамів
з високим рівнем продукції цих антибіотиків. Однак такі експерименти
неможливі без розуміння регуляторних процесів, що контролюють продукцію
ландоміцинів у S. cyanogenus S136 та S. globisporus 1912.
Висока вартість протипухлинних антибіотиків, у тому числі ландоміцинів,
зумовлена, насамперед, низьким рівнем їхнього біосинтезу та
нестабільністю штамів-продуцентів, отриманих в результаті багаторазових
етапів індукованого мутагенезу. Окрім того, методи класичної селекції в
багатьох випадках є неефективними щодо промислових
штамів-надпродуцентів. Розуміння процесів генетичного контролю продукції
антибіотиків у стрептоміцетів дозволить розробити нові підходи до
раціонального отримання штамів з високим рівнем біосинтезу антибіотиків
за рахунок маніпуляцій з окремими генами чи елементами регуляторних
систем.
Регуляція біосинтезу антибіотиків у стрептоміцетів є об’єктом
інтенсивних досліджень багатьох вчених. Відомі різноманітні регуляторні
елементи та механізми, задіяні у контролі вторинного метаболізму в цих
бактерій. Однак, існує мало даних стосовно регуляції продукції сполук
групи ангуциклінів. Незрозумілим залишається питання про взаємозв’язок
окремих регуляторних процесів між собою. Вивчення регуляції біосинтезу
ландоміцинів сприятиме глибшому розумінню загальних аспектів генетичного
контролю продукції антибіотиків та ангуциклінів зокрема. Окрім того,
досі погано розроблені раціональні підходи до створення штамів із
високим рівнем продукції антибіотиків, що базуються на знаннях про
регуляцію вторинного метаболізму у актиноміцетів. Дані, отримані під час
таких досліджень, можуть бути використані і щодо інших стрептоміцетів –
продуцентів антибіотиків.
Перелічені проблеми є особливо актуальними для України, де відсутнє
промислове виробництво антибіотиків та протипухлинних препаратів,
зокрема.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась у науково-дослідній лабораторії генетики, селекції
та генетичної інженерії продуцентів антибіотиків (НДЛ-45) при кафедрі
генетики та біотехнології Львівського національного університету імені
Івана Франка у межах держбюджетних науково-дослідних тем Бг-12б
“Розробка методів генетичного та генно-інженерного конструювання
штамів-продуцентів протиракових антибіотиків” (2000-2002 рр., номер
держреєстрації – 0197U018080) та Бг-117б „Генетичний контроль біосинтезу
протипухлинних антибіотиків ландоміцинової групи” (2003-2005 рр., номер
держреєстрації – 0197U011132). Ці дослідження також були підтримані
індивідуальним міжнародним грантом DAAD.
Мета та завдання дослідження. Метою роботи є встановлення генетичних
механізмів регуляції біосинтезу ландоміцинів. Для досягнення цієї мети
були поставлені такі завдання:
1) виявити, клонувати та секвенувати гени шлях-специфічних регуляторів,
задіяних у контролі продукції ландоміцинів;
2) отримати та вивчити мутанти S. globisporus та S. cyanogenus із
пошкодженнями у виявлених генах;
3) вивчити особливості експресії генів шлях-специфічних регуляторів
біосинтезу ландоміцинів;
4) дослідити механізми функціонування білків, що кодуються клонованими
генами;
5) встановити роль регуляторної bldA-тРНК у контролі біосинтезу
ландоміцинів;
6) дослідити ділянки, що фланкують кластери генів біосинтезу
ландоміцинів з метою пошуку нових регуляторних елементів, задіяних у
контролі продукції антибіотиків у S. globisporus та S. cyanogenus;
7) розробити підходи отримання штамів з надпродукцією ландоміцинів на
основі отриманих даних щодо регуляції їхнього біосинтезу.
Об’єктом дослідження є генетичні механізми регуляції біосинтезу
ландоміцинів у S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136. Предметом
дослідження є гени, що регулюють продукцію ландоміцинів Е та А.
Методи дослідження – мікробіологічні (культивування штамів актиноміцетів
та аналіз їхніх ознак), біохімічні (очищення, кількісний та якісний
аналіз антибіотиків), генетичні (отримання та вивчення мутацій,
генетична трансформація клітин Escherichia coli, кон’югаційні
схрещування між E.coli та актиноміцетами), генно-інженерні (виділення та
рестрикційний аналіз сумарної та плазмідної ДНК, конструювання
рекомбінантних молекул ДНК, гель-електрофорез ДНК, ДНК-ДНК гібридизація,
полімеразна ланцюгова реакція, cеквенування ДНК, ПЛР-мутагенез),
молекулярно-біологічні (експресія та очищення рекомбінантних білків,
вивчення зміни електрофоретичної рухливості ДНК-білкових комплексів).
Наукова новизна одержаних результатів. В результаті виконаної роботи
вперше ідентифіковано гени, задіяні в регуляції експресії структурних
генів біосинтезу ландоміцинів Е та А (lnd- та lan- генів). Виявлено та
клоновано ген lndI шлях-специфічний активатор транскрипції lnd-генів
(Rebets et al., 2003). Kлоновано ген lanI, що контролює продукцію
ландоміцину А у S. cyanogenus S136 (Rebets et al., 2003). За допомогою
молекулярно-біологічного аналізу мутантів із спрямованим руйнуванням
генів lndI та lanI вперше показано, що їхні продукти діють як позитивні
регулятори біосинтезу ландоміцинів. Продемонстровано філогенетичну
спорідненість генів, що регулюють продукцію ангуциклінових полікетидних
антибіотиків та їхню функціональну взаємозамінність (Rebets et al.,
2003). Вивчено особливості транскрипції гена lndI та оперону lndEFABCD,
що об’єднує ключові гени біосинтезу ландоміцину Е (Ostash et al. 2003a;
Ostash et al. 2003б; Rebets et al., 2005). Охарактеризовано продукт гена
lndI, як ДНК-зв’язувальний білок, що взаємодіє із промоторами
структурних lnd-генів та промотором власного гена (Rebets et al., 2005).
Це перший відомий випадок авторегуляторної функції у білків-регуляторів
біосинтезу полікетидних антибіотиків у стрептоміцетів. Отримано дані
щодо регуляції експресії досліджуваного гена на рівні використання
мінорної bldA-тРНК. Створено гібридні гени шлях-специфічних регуляторів
біосинтезу антибіотиків за рахунок комбінування ділянок lndI та lanI, що
кодують різні функціональні домени. Локалізовано та клоновано ген
протеїнази prx, продукт якого задіяний у позитивній регуляції біосинтезу
ландоміцину Е.
Практичне значення одержаних результатів полягає в можливості
використання вивчених генів для створення рекомбінантних штамів бактерій
з підвищеним рівнем продукції ландоміцинів. Вперше розроблено спосіб
отримання надпродуцентів ландоміцину на основі рекомбінантних штамів, що
несуть клоновані гени lndI та prx. Отримані результати стали основою
патенту на винахід „Спосіб отримання штамів Sreptomyces globisporus з
підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів” (Патент UA62200A). Окрім
того, одержані дані можуть бути використані для розробки підходів
гетерологічної експресії генів біосинтезу ландоміцинів та комбінаторного
біосинтезу нових антибіотиків у штамах S. globisporus та S. cyanogenus з
метою одержання нових антибіотичних речовин.
Особистий внесок здобувача. Під час виконання дисертаційної роботи
автором самостійно підготовано огляд літератури та виконано весь обсяг
експериментальних досліджень. Зокрема, здобувачем клоновано та вивчено
гени lndI та lanI, задіяні у позитивній регуляції біосинтезу
ландоміцинів Е та А, показано, що продукт гена lndI є ДНК-зя’зувальним
білком, вивчено характер експресії гена lndI в часі та різних частинах
колонії, створено гібридні гени регулятори на основі lndI та lanI,
вивчено роль гена prx у біосинтезі ландоміцину Е. Розробку програми
вирішення поставлених завдань, аналіз та обговорення одержаних
результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – д.б.н.,
доцентом В. О. Федоренком, а також к.б.н. Б.О. Осташем та к.б.н. А.М.
Лужецьким, з якими автор має спільні публікації.
Для виявлення lnd-кластеру було використано бібліотеку генів S.
globisporus 1912, створену співробітницею НДЛ-45 к.б.н. Ю.М. Демидчук та
дані часткового секвенування гена lndI, виконаного аспіранткою кафедри
генетики та біотехнології К.О. Панькевич. В роботі з аналізу причин
надсинтезу ландоміцину Е стрептоміцин-стійкими мутантами використано
штам S. globisporus Smy622, отриманий співробітником НДЛ-45 м.н.с. О.М.
Громиком. Секвенування lnd-генів та аналіз продукції ландоміцинів
виконувались у співпраці з науковцями відділу функціональної біології
університету м. Ов’єдо, Іспанія (проф. Х.А. Салас), Інституту
дослідження природних сполук, Йєна, Німеччина (др. Г. Крюгель), відділу
фармакології університету м. Фрайбург, Німеччина (проф. А. Бехтольд) та
відділом мікробіології університету м. Ніігата, Японія (проф. Т.
Накамура).
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на
таких вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах та з’їздах:
Міжнародній конференції з молекулярної біології та генетики для
студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченій 100-річчю генетики
(Львів, 2000); Конференції з молекулярної біології та генетики для
студентів, аспірантів та молодих вчених (Київ, 2001); 36
Загальнопольському симпозіумі „Aktywnosc drobnoustrojуw w rуznych
srodowiskach” (Краків, Польща 2001); 6 та 7 Конференції молодих вчених
“Біологія – наука XXI століття” (Пущино, Росія 2002, 2003);
Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів „Біологічні
дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2002); VAAM Workshop
“Biologie bacteriellen Naturstoffproducenten” (Фрайбург, Німеччина
2002), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); І
Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Наука.
Освіта” (Київ, 2003); Міжнародній Вейглівській конференції
„Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance” (Львів,
2003), ІІ Крайовому біотехнологічному конгресі (Лодзь, 2003), 16
Мікробіологічному симпозіумі “ Advance of microbial science and control
of infectious diseases” (Кіото, Японія 2003), 76 Конференції Японського
біохімічного товариства (Йокогама, Японія 2003), 10 З’їзді Товариства
мікробіологів України (Одеса, 2004); Установчому з’їзді Українського
товариства клітинної біології (Львів, 2004); на звітних наукових
конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка
(2001-2004).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 35 наукових праць, у тому
числі 7 статей в фахових наукових журналах, 1 патент України та тези 27
доповідей на конгресах, конференціях та з’їздах.
Структура та обсяг дисертаціії. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень, аналізу та
узагальнення результатів досліджень, списку використаних джерел (167
найменувань), додатків. Роботу викладено на 215 сторінках машинописного
тексту та проілюстровано 51 рисунком і 9 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи. У роботі використали штами Escherichia coli DH5б,
ET12567 (pUB307), BL21(DE3) та 51 штам актиноміцетів, а також 75
плазмід. Вони отримані дисертантом та співпрацівниками з кафедри
генетики та біотехнології Львівського національного університету імені
Івана Франка, де виконувалась робота, а також люб’язно надані колегами з
інших установ.
Трансформацію E. coli проводили згідно стандартної методики (Sambrook et
al., 2001). Кон’югаційні схрещування між E. coli та штамами
стрептоміцетів проводили згідно методики, описаної в роботі (Лужицький і
співавт., 2000). Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення сумарної
та плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному гелі та елюювання
фрагментів ДНК, обробку ДНК ендонуклеазами рестрикції, фрагментом
Кленова, лігування ДНК Т-4 ДНК-лігазою, ДНК-ДНК-гібридизацію,
полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), визначення послідовності
нуклеотидів у ДНК, термінальне мічення ДНК флуоресцеїном) проводили
згідно стандартних методик (Sambrook et al, 2001) та рекомендацій
виробника відповідних ферментів. Аналіз нуклеотидних та амінокислотних
послідовностей виконували за допомогою комп’ютерних програм DNAsis,
GENETYX-MAC8, DNA-Star, BLASTP, CODONPREFERENCE, CLUSTAL W, SIGNALP.
Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою програми
STATGRAPHICS та електронних таблиць Microsoft Excel.
Аналіз продукції антибіотиків проводили методами тонкошарової рідинної
хроматографії (ТШХ) та високоефективної рідинної хроматографії, згідно
методик (Henkel et al., 1990; Мацелюх і співавт., 1999).
Для експресії білків використовували векторні системи pET23c, що
передбачає введення 6 залишків гістидину, та pTYB, яка передбачає
одержання гібридного білка злитого з хітин-зв’язувальним доменом.
Очищення білків проводили методами афінної хроматографії на Ni2+ чи
хітиновому носії. Аналіз концентрації білка здійснювали за (Lawry, 1951)
чи методом BCA (bicinchoninic acid). ДСН-ПАГЕ проводили відповідно до
Laemmli (Sambrook et al, 2001). Визначення змін електрофоретичної
рухливості фрагментів ДНК після інкубації з LndI білком (Mobility Shift
Assay – MSA) проводили згідно стандартних методик з використанням
фрагментів ДНК, мічених флуоресцеїном (Taylor et al., 1994).
Аналіз експресії репортерного гена зеленого флуоресцентного білка (EGFP)
та отриманих на його основі генетичних конструкцій здійснювали за рівнем
флуоресценції міцелію згідно (Sun et al., 1999). Вивчення експресії
гібридів LndI-EGFP проводили імунологічно з використанням
анти-GFP-антитіл.
Результати досліджень.
1. Вивчення функції генів lndI та lanI у регуляції синтезу ландоміцинів.
Проведено секвенування та подальший аналіз нуклеотидної послідовності
кластеру генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластер) S. globisporus
1912 у 5’-напрямі від гена lndE. В результаті було ідентифіковано три
відкриті рамки зчитування. Одна з них, ORF1, відповідає раніше описаному
гену lndI. Розмір кодуючої послідовності гена становить 783 п.н., та
кодує білок з 261 амінокислотного залишку. Ймовірний продукт lndI
виявляє високий ступінь гомології до білків-регуляторів біосинтезу
антибіотиків у стрептоміцетів, що належать до SARP-родини. Аналіз
нуклеотидної послідовності, що передує старт-кодону гена lndI виявив
ймовірну промоторну послідовність, близьку до консенсусної (Bourn et
al., 1996). Вона складається з -10 ділянки 5’-TAGTTT (положення 235-240
п.н), що передує старт кодону гена lndI на 48 п.н, та -35 послідовності
5’-TTGACA (211-216 п.н.). Аналіз 5’- ділянки від ідентифікованого
промотора показав існування трьох гептамерних повторів з консенсусною
послідовністю 5’-T1C2G3C4(G/C)5 (G/A)6(C/A)7-3’, які характерні для
сайтів зв’язування транскрипційних факторів (Wietzorrek et al., 1997).
Кластер генів біосинтезу ландоміцину А S. cyanogenus S136 було отримано
з космідної бібліотеки генів цього штаму та секвеновано групою професора
А. Бехтольда (Westrich et al., 1999). Аналіз нуклеотидної послідовності
lan-кластеру виявив деякі відмінності від lnd-кластеру S. globisporus,
зокрема в складі lan-кластеру не було знайдено гена, що кодує
транскрипційний регулятор структурних генів біосинтезу. Нами проведено
додаткове секвенування ділянки 4839 п.н. lan-кластеру S. cyanogenus S136
у 3’-напрямку від гена lanZ6, що виявило три відкриті рамки зчитування.
Аналіз нуклеотидної послідовності однієї з них показав, що вона кодує
ймовірний транскрипційний регулятор, гомологічний продукту гена lndI S.
globisporus 1912. Даний ген, позначений нами як lanI, зі старт-кодоном
GTG, кодує білок з 261 амінокислотних залишків.
Порівняння ймовірних продуктів генів lndI та lanI показав високий
ступінь їхньої гомології між собою та до транскрипційних факторів
прокаріотів. На основі аналізу ймовірної амінокислотної послідовності
білків з послідовністю осморегулятора E. coli OmpR, для якого відомі
елементи вторинної структури, було виявлено послідовності LndI та LanI,
які ймовірно задіяні у розпізнаванні та зв’язуванні з ДНК мішенню та
активації РНК-полімерази. Дані порівняння показали також, що регуляторні
білки, які походять із кластерів генів біосинтезу ангуциклінових
полікетидних антибіотиків становлять окрему від інших SARP регуляторів
філогенетичну групу (рис.1).
Ген lndI було зруйновано в хромосомі штаму S. globisporus 1912 шляхом
заміщення на мутантний алель з інерцією гена стійкості до канаміцину.
Факт заміщення було підтверджено ДНК-ДНК гібридизацію. Одержаний
мутантний штам S. globisporus I2-1 характеризувався повною відсутністю
синтезу ландоміцину Е та його попередників (рис.2,3). Продукція
антибіотика відновлювалась при введенні гена lndI у складі плазмід. Ген
lanI також зруйновано у хромосомі штаму S. cyanogenus S136 шляхом
заміщення на мутантний алель з інерцією гена стійкості до
спектиноміцину. Одержаний мутант характеризувався подібним до S.
globisporus I2-1 фенотипом.
Проведено комплементацію мутацій у генах lndI та lanI з використанням
генів-регуляторів біосинтезу антибіотиків у різних штамів
стрептоміцетів. В результаті було виявлено, що всі використані
регулятори можна розділити на дві групи – ті, які відновлюють
продукцію ландоміцинів, та такі, що відновлюють синтез
антрациклінових полікетидів у відповідних регуляторних мутантів S.
coelicolor та S. argillaceus. Одержані дані показали близьку
спорідненість та взаємну замінність регуляторів біосинтезу
ангуциклінових антибіотиків jadR1, lanI та lndI, що підтверджує дані,
отримані під час аналізу амінокислотних послідовностей відповідних
білків.
При введені у штам S. globisporus 1912 додаткових копій гена lndI
спостерігається зростання рівня продукції ландоміцину Е. У випадку
використання плазміди pSI2-9 на основі інтегративного вектора, що дає
2-3 копії клонованого гена на геном, рівень продукції зростав у 11
разів, тоді як при введенні висококопійної плазміди pSOI1112 (200-300
копій на геном) штам продукував у 12 разів більше ландоміцину Е
порівняно із вихідним.
Показано відсутність впливу високих концентрацій глюкози на продукцію
ландоміцину Е штамом S. globisporus 1912. Найвищий рівень синтезу
спостерігали на середовищах з 5% цього вуглеводу, тоді як на середовищах
із 10% та 15% рівень продукції дещо зменшувався. У випадку штаму S.
globisporus 1912 pSI2-9+ найвищий рівень синтезу ландоміцину Е
спостерігався на середовищах з 15% глюкози. При цьому в екстрактах
основну частину становив ландоміцин Е, тоді як його попередники були
відсутні. Також виявлено, що штам S. globisporus 1912 є типовим
нейтрофілом, який краще переносить лужні умови культивування, ніж кислі.
Відповідний характер має і залежність продукції ландоміцину Е від
значення рН середовища.
2. Вивчення ДНК-зв’язувальних властивостей білка LndI. Отримані дані
вказують на те, що продукт гена lndІ задіяний у позитивній регуляції
біосинтезу ландоміцину Е. Відомо, що такі білки функціонують як фактори
транскрипції і реалізують свою функцію через взаємодію з ДНК промоторів
регульованих ними генів. З метою вивчення ДНК-зв’язувальних властивостей
білка LndI було проведено експерименти з його титрування in vivo на
промоторах генів lndI та lndE клонованих у складі висококопійних плазмід
pSOH (містить РlndI) та pSOE (містить РlndE) у штамі S. globisporus
1912. Отримані рекомбінантні штами продукували на 20-60% менше
ландоміцину Е порівняно із штамом дикого типу. Таке зменшення продукції,
очевидно, зумовлене титруванням регуляторного білка на клонованих у
складі плазмід фрагментах ДНК за рахунок конкуренції за зв’язування з
відповідними промоторами у складі хромосоми.
Ген lndI було клоновано у вектори експресії у E. coli та очищено
відповідний рекомбінантний білок методами афінної хроматографії (рис.4).
Одержаний білок LndI було використано в експериментах із вивчення зміни
електрофоретичної рухливості ДНК-фрагментів (MSA – mobility shift assay)
промоторів генів lndI, lndE.
В результаті цих експериментів було виявлено, що електрофоретична
рухливість мічених флуоресцеїном фрагментів ДНК, що відповідали
промоторам генів lndI та lndE, різко змінюється після інкубації з
очищеним білком LndI, порівняно із вільними фрагментами ДНК (рис.5).
Очевидно, що це зумовлено активним формуванням ДНК-білкових комплексів
між LndI та відповідними промоторами. Така зміна електрофоретичної
рухливості має конкурентний характер і залежить від кількості немічених
фрагментів ДНК, що додавали до інкубаційної суміші. Таким чином, дані
титрування та МSА показали, що lndI кодує ДНК-зв’язувальний білок, який
активно взаємодіє із промоторами структурних генів біосинтезу
ландоміцину Е, зокрема промотором гена lndE, що забезпечує транскрипцію
ключових генів біосинтезу антибіотика, які входять до складу lndEFABCD
оперону. Окрім того, LndI взаємодіє із промотором власного гена.
3. Вивчення особливостей експресії генів біосинтезу ландоміцину Е у S.
globisporus 1912. Промоторні ділянки генів lndI та lndE було клоновано у
репортерний вектор pIJ8660 в орієнтації, при якій їхня активність
забезпечувала транскрипцію гена зеленого флуоресцентного білка EGFP.
Отримані плазміди, pIJ8660H та pIJ8660E відповідно, було перенесено у
штам S. globisporus 1912 та активність відповідних промоторів вивчали за
інтенсивністю зеленої флуоресценції міцелію. Виявлено, що ініціація
транскрипції lndEFABCD оперону відбувається лише після 24 години росту
культури, а її максимум припадає на 60 годину,що збігається з часом
максимального нагромадження ландоміцину Е. Ініціація транскрипції гена
lndI відбувалась на 12 годину росту штаму S. globisporus 1912 pIJ8660Н+
(рис.7). Інтенсивність флуоресценції міцелію досягає максимуму на 60
годину росту культури в період найвищого рівня продукції антибіотика.
Після цього спостерігається зменшення синтезу EGFP, що відображає
зменшення активності промотора гена lndI та продукції ландоміцину Е
зокрема. Причиною цього є частковий автоліз культури після 60-72 годин
росту, що було підтверджено фарбуванням пропідій-йоддидом. Використання
плазмід pIJ8660H та pIJ8660E показало, що обидва промотори PlndI та
PlndE є активними лише у субстратному міцелії, тоді як у повітряному
міцелії та спорах досліджувані гени не експресуються (рис.6). Таким
чином, існує чітка регуляція активності гена lndI та структурних генів
не лише в часі, а й у різних частинах колонії S. globisporus 1912.
Отримані результати дозволяють виявити лише особливості роботи
досліджуваних промоторів, але не показують характер експресії генів
загалом. Тому було створено злиття кодуючих ділянок генів lndI та EGFP.
Така конструкція pIJlndI була перенесена у штам S. globisporus I2-1. При
цьому спостерігалось часткове відновлення біосинтезу ландоміцину Е
мутантним штамом, що свідчить про функціональну активність гібридного
білка LndI-EGFP. Плазміду pIJlndI було перенесено у штам дикого типу S.
globisporus 1912 та вивчено експресію даного гена. Гібрид було
виявлено в сумарному лізаті клітин S. globisporus 1912 pIJlndI+
імунологічно, як білок, розміром 56 кДа. Використання цієї системи
показало, що
протягом перших 12-24 годин росту в клітинах відсутній продукт гена
lndI-GEFP (рис.7). Слабка флуоресценція з’являлась на 24 годину росту
культури і досягала максимуму інтенсивності між 48 та 60 годинами. Такий
характер експресії гена lndI в загальному збігається з даними,
отриманими при вивченні активності його промотора. Однак було виявлено
існування певного лаг-періоду між ініціацією транскрипції гена lndI та
трансляції його мРНК. Причиною цього може бути присутність в кодуючій
ділянці гена lndI регуляторного лейцинового ТТА-кодону. Було створено
мутантний алель гена, у якого цей кодон замінено на синонімічний СТС.
Одержаний ген lndICTC було злито з кодуючою ділянкою гена EGFP та
досліджено його експресію у S. globisporus 1912. Виявлено відсутність
лаг-періоду між початком транскрипції гена lndICTC та трансляції його
мРНК. Таким чином, очевидно, що експресія lndI регулюється на рівні
трансляції за рахунок використання рідкісного ТТА кодону, що
транслюється bldA- тРНК.
4. Створення гібридних генів регуляторів на основі lndI та lanI.
Подібність нуклеотидних та амінокислотних послідовностей генів lndI та
lanI та їхніх продуктів вказують на їхню близьку структурну та
функціональну спорідненість. Окрім того, відомо, що S. cyanogenus
характеризується підвищеним рівнем продукції ландоміцину А порівняно із
S. globisporus 1912. Причини такого надсинтезу невідомі, проте однією з
них можуть бути відмінності в амінокислотних послідовностях білків LanI
та LndI. Найбільше відмінностей зосереджено у їхній N-кінцевій ділянці,
тоді як С-кінцева ділянка є більш консервативною та відповідає за
зв’язування з ДНК-мішені і активацію РНК-полімерази. Найбільше
відмінностей між білками знайдено в ділянці б-петлі, яка розміщена між
б2 та б3 спіралями. Саме ця структура, розміром 9 амінокислотних
залишків, найбільш вірогідно, взаємодіє з РНК-полімеразою та активує її.
Відповідні ділянки LndI та LanI відрізняються 5 амінокислотними
залишками, що, ймовірно, відображається на ступені активації
РНК-полімерази та, відповідно, на рівні продукції антибіотиків.
У центральній частині lndI та lanI було знайдено сайт розпізнавання
рестриктазою PstI, що розщепляє кодуючі ділянки генів у ідентичних
місцях, таким чином, що при об’єднанні 5’-частини lndI та 3’-
послідовності lanI в даному сайті відбувається відновлення рамки
зчитування. Використовуючи цю особливість було створено два нові
регуляторні гени ladR1, продукт якого складається із сигнального домену
LndI та регуляторного домену LanI, та ladR2, який кодує білок із
сигнальним доменом LanI та регуляторним доменом LndI. Ще один варіант
гібридного lndI/lanI було отримано методом ПЛР. ladI кодує білок LndI з
його N-кінцевим сигнальним доменом та ділянкою регуляторного домену до
б2 спіралі включно, у якого б-петля та наступні б3, в6 і в7 структури
замінені на відповідні ділянки білка LanI. Одержані гени ladR1, ladR2 та
ladI було клоновано у вектор експресії pKC1212E, таким чином, що в
отриманих рекомбінантних плазмідах pKCEladR1, pKCEladR2 та pKCElаdI,
відповідно, їхня експресія забезпечується промотором гена стійкості до
еритроміцину. pKCEladR1, pKCEladR2 та pKCElаdI було перенесено у lndI–
мутант S. globisporus I2-1. Однак у жодному з випадків відновлення
біосинтезу антибіотика не спостерігалось. Таким чином, незважаючи на
взаємну функціональну замінність білків LndI та LanI, гібриди, отримані
в результаті комбінування їхніх доменів чи окремих фрагментів, які
кодують ділянки активних центрів, призводять до утворення
нефункціональних регуляторів, що не здатні відновлювати біосинтез
ландоміцину Е у штамі S. globisporus I2-1.
o
X”l
–
???????l
TH
6!8!
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
