.

Мінорні компоненти та жирнокислотний склад поверхневих ліпідів деяких видів рослин (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
124 2546
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

ШЕПЕЛЕНКО Вадим Миколайович

УДК 577.115+665.322

Мінорні компоненти та жирнокислотний склад поверхневих ліпідів деяких
видів рослин

03.00.04 – Біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті

Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

ШТЕМЕНКО Наталя Іванівна,

завідувач кафедри біофізики та біохімії

Дніпропетровського національного університету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

СТАРОДУБ Микола Федорович,

головний науковий співробітник

відділу біохімії біосенсорних та регуляторних систем

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник ОКАНЕНКО
Олександр Аркадійович,

старший науковий співробітник

лабораторії фізіологічних основ продуктивності рослин кафедри фізіології
та біохімії рослин

Київського національного університету

ім. Тараса Шевченка.

Провідна установа – Чернівецький національний університет

ім. Ю. Федьковича МОН, кафедра біохімії.

Захист відбудеться “7” червня 2005 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “6” травня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01,

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Поверхневі ліпіди (ПЛ) – гетерогенна суміш естерів
(восків), алканів, спиртів, оксосполук, жирних кислот та мінорних
компонентів, що розташовані на поверхні листя рослин та мають загальну
властивість – гідрофобність – завдяки значній величині (С12-С36)
вуглеводневого радикалу [Bianchi, 1984, 1989, 1995; Prasad 1990;
Post-Beitenmiller, 1996; Kunst, 2003; Reynhardt, 1991, 1994; Barthlott,
1998].

У роботах співробітників кафедри біофізики та біохімії
Дніпропетровського національного університету [Штеменко, 1997, 1998,
1999, 2000, 2003; Берзеніна, 1997, 2000] проведено детальний огляд
свідчень про ПЛ листя рослин, розроблено методичні підходи до вивчення
ПЛ, з’ясовано особливості формування ПЛ рослин у процесі онтогенезу.
Однак у переважній кількості вищезгаданих робіт не використовувався
такий новітній метод досліджень як хромато-мас-спектрометрія. Саме цей
метод спроможній визначити структуру біомолекул, що знаходяться в
невеликій кількості (мінорні компоненти) навіть у складній суміші. Також
практично не застосовувався метод компонент-специфічного ізотопного
аналізу ПЛ, який дає можливість вивчати особливості ферментативних
реакцій, що є чутливими не тільки до конфігурації молекул, а й до
розміру (складу) ядра елемента. Останнім часом доведено, що ПЛ не є
інертним нерухомим шаром, якому притаманна тільки бар’єрна або захисна
(від ультрафіолетового випромінювання) функції. Показано, що в умовах
пристосування до факторів зовнішнього середовища відбуваються певні
перебудови ПЛ, які мають за основу біосинтез нових компонентів та зміну
гідрофобності шару [Bianchi, 1995; Jetter, 2001]. У цьому аспекті хвойні
(Coniferae) є одними з найважливіших об’єктів, оскільки ці види
характеризуються широким ареалом розповсюдження, високою стійкістю та
використовуються людиною у фіторемедіаційних заходах. Деякі водні
рослини є теж цікавим об’єктом досліджень, оскільки склад ПЛ їх
практично не вивчався взагалі і вони застосовуються для очистки води
[Stottmeister, 2003].

Отже, застосування сучасних методів дослідження для визначення структури
компонентів ПЛ рослин та їх змін під впливом факторів зовнішнього
середовища є актуальним напрямком досліджень, оскільки вносить суттєвий
внесок у розуміння взаємозв’язку структура біомолекул – функція, що є
однією з центральних проблем сучасної біохімії.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення складу жирних
кислот, мінорних компонентів та проведення компонент-специфічного
ізотопного аналізу ПЛ деяких видів хвойних та водних рослин.

Для досягнення мети були поставлені задачі :

Провести хромато-мас-спектрометричний аналіз сумарної фракції жирних
кислот хвойних та водних рослин.

Визначити зміни молекулярно-динамічних характеристик та складу ПЛ
хвойних рослин в умовах адаптації до шкідливих факторів середовища.

Визначити величину дискримінації важкого ізотопу 13С у компонентах ПЛ
хвойних та водних рослин.

На основі отриманих даних розглянути можливі шляхи біосинтезу окремих
компонентів.

Об’єкт досліджень. Особливості жирнокислотного складу та мінорних
компонентів поверхневих ліпідів хвойних та водних рослин.

Предмет досліджень. Компоненти поверхневих ліпідів хвойних та водних
рослин.

Методи досліджень. У роботі використані методи екстракції поверхневих
ліпідів, методи хромато-мас-спектрометрії, компонент-специфічного
ізотопного аналізу, диференційного температурного аналізу, інфрачервоної
спектроскопії, статистичного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано наявність у
фракції жирних кислот поверхневих ліпідів розгалужених (ізо – та антеізо
пента – та гептадеканові кислоти), аліциклічних (дициклопропанова
кислота), та дикарбонових (дикарбоксинонаноат, дикарбокситридеканоат,
12-метил-тетрадеканоат) кислоти. Серед мінорних компонентів поверхневих
ліпідів рослин знайдено терпеноїди класів абієтану та пімарану, фенольні
кислоти, функція яких вірогідно полягає у підтриманні впорядкованості
структури поверхневих ліпідів та підвищенні температури фазових
переходів “кристалічна-аморфна” фази. Показано значну дискримінацію
стабільного важкого ізотопу 13С у вищих жирних кислотах та вуглеводнях
поверхневих ліпідів рослин, яка найбільш суттєва для довголанцюгових
компонентів. Вперше показано значну ненасиченість поверхневих ліпідів
водних рослин, яка обумовлена наявністю пальмітоолеїнової, олеїнової та
лінолевої кислот. Вперше виявлено, що в умовах пристосування до факторів
зовнішнього середовища відбувається перебудова шару поверхневих ліпідів
за участю мінорних компонентів та незвичайних жирних кислот, що
підкреслює важливість їх функцій у формуванні поверхневого шару з
певними молекулярно-динамічними характеристиками. На основі отриманих
даних обговорені нові аспекти біосинтезу окремих компонентів поверхневих
ліпідів рослин.

Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених
досліджень дозволяють більш глибоко проаналізувати причинно-наслідкові
зв’язки між складом та хімічною будовою поверхневих ліпідів рослин
різного віку і формуванням гідрофобного біохімічного бар’єру, здатного
захистити фотосинтетичний апарат від зовнішніх впливів. Зроблені
спостереження і висновки значно розширюють уявлення про механізми
функціонування різноманітних біосинтетичних процесів в епідермальних
тканинах рослин.

Зв’язок роботи з науковими темами. Робота виконувалась в рамках
бюджетних тем лабораторії НДІ біології і кафедри біофізики та біохімії
ДНУ “Розробка біотехнології отримання речовин із рослинної сировини для
практичного використання” (0196U00259), “Дослідження процесів формування
ліпідного і білкового комплексів рослин” (0199U00129), які входять в
координаційний план № 15 Міністерства освіти і науки. Частина роботи
виконувалась згідно гранту Німецької служби академічних обмінів (DААD) №
А/03/12911.

Особистий внесок здобувача. Розробка програми й основної гіпотези
наукової проблеми виконана разом з науковим керівником – доктором
біологічних наук, професором Н.І. Штеменко. Представлена дисертаційна
робота – завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми
експериментальних досліджень, спланованих, проведених та узагальнених
протягом 2001-2004 рр. Автором дисертаційної роботи особисто були
проводені експериментальні дослідження, здійснені підбір та обробка
літературних даних, статистична обробка результатів. Друковані праці
підготовлені за особистою участю здобувача.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи, були
представлені на міжнародних конференціях: Sixth International Symposium
& Exhibition of Environmental Contamination in Central & Eastern Europe
and the Commonwealth of Independent States 1-4 September 2003, Prague,
Czech Republic; 1st European Symposium on Plant Lipids: From Fundamental
Biology to Industrial and Field Applications, Aachen, 10-13 September; V
Регіональній конференції молодих учених з актуальних питань хімії
(Дніпропетровськ, 2002); ІІ Всеукраїнській конференції молодих вчених з
актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2004).

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури (1 розділ, 7 підрозділів), експериментальної частини (3
розділи, 16 підрозділів), висновків, списку використаних джерел який
налічує (157 найменувань). Робота виконана на 133 сторінках і включає 40
рисунків, 22 таблиці.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт, з яких 3 статті,
надруковані в спеціалізованих фахових виданнях та за кордоном.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури розглянуті відомі на сьогодні дані
про склад жирних кислот та мінорних компонентів поверхневих ліпідів
рослин. Розглянуто основні шляхи біосинтезу окремих компонентів
поверхневих ліпідів.

Матеріали і методи досліджень. Матеріалами досліджень були окремі дерева
таких видів: Picea abies L. Karst, Picea pungens Engelm, Pinus
pallasiana D.Don, Pinus sylvestris, які росли на території Ботанічного
саду Дніпропетровського національного університету (контрольна група) та
на ділянці з інтенсивним автотранспортним рухом міста Дніпропетровськ
(досліджувана група), де спостерігалося часткове пошкодження крони.
Відбір проводився на стадії активної вегетації. Вивчалося листя різного
віку (першого, другого та третього років), яке було зібране із
середнього ярусу південно-східної сторони крони. Також для досліджень
були взяті водні рослини Juncus effusus L. та Typha latifolia L., які
вирощувались як гідропонічні культури на середовищі: 50 % розчин
Хогланда на водопровідній воді у фітолабораторії Цетру вивчення
навколишнього середовища (Лейпциг, Німеччина) за Stottmeister [2003].
Експерименти проводились в 3 – 4 біологічних повторностях.

Екстракцію поверхневих ліпідів проводили за схемою Гусакової [1986].

ДТА зразків проводили на дериватографі системи Паулік-Паулік-Ердей марки
Q-1500 D (MOM) в динамічному режимі в умовах звичайного теплообміну в
інтервалі температур 10-500 0С зі швидкістю нагрівання 10 0С / хв,
еталон – Al2O3. при масі зразків 0,1 г і реєстрації кривих
диференційного температурного аналізу з максимальною чутливістю.

Аналіз інфрачервоних спектрів поглинання ПЛ проводився на спектрометрі
Speсord UR-20 у вигляді суспензії речовини у вазеліновому маслі на
оптичному склі з броміду калію.

Гідроліз сумарних ПЛ, реекстракція та отримання двох ліпідних фракцій –
неомилюючих речовин та жирних кислот проводили за Кейтсом [1975].

Отримання метилових естерів жирних кислот, дитерпенових кислот та
фенольних кислот проводили за Сriestie [1998].

Попередньо метильовані компоненти ПЛ розподіляли методом колоночної
хроматографії на силікагелі G 60 [Otto, 2003] з такими розчинниками:
гексан– отримували фракцію вуглеводнів; дихлорметан– відкидали;
етилацетат– отримували фракцію вільних жирних кислот, фенольних кислот,
терпеноїдів у вигляді метилових естерів.

Газову хроматографію жирних кислот проводили за Richnow [2003] на
хроматографі НР 6890. Розподіл жирних кислот проводили у вигляді
метилових естерів. Газова хроматографія проводилась безперервним
способом з терміном очистки 0,16 хв. Ін’єкція проводилась при
температурі 180 єС. Проба вносилась в кількості 4 ?l.

Газову хроматографію вуглеводнів проводили на тому ж хроматографі й при
тих самих умовах розподілення, що для полярних компонентів, але з іншим
температурним режимом.

Процес та ідентифікація компонентів при газовій хроматографії
здійснювався за допомогою мас-спектрометричної приставки НР 5973
(Hewlett Packard, USA) та програми Enhansed Chem. Stations G 1701 AA Var
03.00.

Визначення співвідношення стабільних ізотопів Карбону в компонентах ПЛ
проводили за Schleffus [2003] на хроматографі GC-С-irmMS-gas
chromatography / combustion / isotope-ratio-monitoring mass spectrometry
– газова хроматографія з наступними розкладанням та мас –
спектрометричним визначенням співвідношення ізотопів. (FINNIGAN MAT–252,
Bremen, Germany). Співвідношення ізотопів Карбону у індивідуальних
компонентах розраховували шляхом порівняння із стандартними СО2 з певним
вмістом ізотопів 12С, 13С та 14С з відповідними масами 44, 45 і 46 та
наступним визначенням величини іонного потоку.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Розробка сучасних методичних підходів до вивчення біохімічних
особливостей поверхневих ліпідів рослин. У цьому розділі автором
обговорюється застосування методів хроматографічного розподілення і
аналізу мінорних компонентів та жирних кислот ПЛ , а також застосування
таких методів хромато-мас-спектрометрія, компонент-специфічний ізотопний
аналіз, ДТА, ІЧ-спектроскопія для вирішення поставлених задач.

Жирні кислоти поверхневих ліпідів хвойних. Застосування сучасних
методичних підходів дало можливість ідентифікувати у фракції жирних
кислот ряд нових сполук, які практично не згадуються в оглядових
роботах, присвячених біохімії ПЛ. Окрім звичайних кислот у фракції
жирних кислот нами знайдені сполуки, наявність яких у ПЛ не
обговорювалася раніше.

Розгалужені кислоти мали таку загальну формулу (рис. 1):

n = 12, 10

Знайдено дикарбонові кислоти загальної формули:

n = 12

та аліциклічна кислота

Рис .1 Незвичайні жирні кислоти поверхневих ліпідів.

Синтез розгалужених кислот відбувається внаслідок залучення до
біосинтезу включення розгалужених амінокислот [Mukherji, 2003].
Циклопропановий фрагмент може синтезуватися внаслідок приєднання групи
-СН3 до подвійного зв’язку (донор SAM) [Bao, 2003]. Дикарбонові кислоти
синтезуються при окисненні кінцевої групи -СН3 відповідної
монокарбонової кислоти [Kulattukudy, 1981]. Оскільки вищезгадані сполуки
знайдено вперше ПЛ тканинах рослин, це підтверджує існування цих
біосинтетичних систем у епідермальних тканинах рослин.

Незвичайні жирні кислот за виключенням аліциклічної кислоти знаходяться
у невеликій кількості в ПЛ досліджених рослин (0,12-2,75 % до суми
жирних кислот), що дозволяє віднести їх до мінорних компонентів.
Аліциклічна кислота не може бути віднесена до таких компонентів,
оскільки її вміст відповідає вмісту основних, мажорних кислот (до 28,31
% у ПЛ Picea abies другого року). кількісне визначення незвичайних
кислот дало можливість говорити про видоспецифічність та онтогенетичну
залежність їх біосинтезу. Наприклад, розгалужені кислоти гептанового
ряду повністю відсутні в ПЛ Picea pungens та знайдені в невеликих
кількостях тільки в ПЛ листя першого року інших рослин. Вміст
аліциклічної кислоти підвищується з віком листя, або залишається на
високому рівні у ПЛ листя другого та третього року.

Мінорні компоненти поверхневих ліпідів хвойних. Застосуваня методичних
підходів, описаних вище, дозволило виділити та охарактеризувати ряд
сполук терпеноїдної природи у ПЛ хвойних, які знаходились у невеликих
кількостях і які раніше майже не обговорювались при вивченні ПЛ рослин.

Серед них – похідні абієтанової (1 – 5) та пімаранової (6 – 8) кислот
(рис. 2)

Рис. 2 Дитерпенові похідні поверхневих ліпідів

Дитерпени були знайдені лише у ПЛ Picea abies і Pinus pallasiana.
Здебільшого у сучасних хвойних знайдено похідні абієтанів, які містять
ненасичене шестичленне кільце. За своєю ненасиченістю 4 ,5 сполуки
подібні до розповсюджених, але містять замісники (окиснені метилові
групи, метокси групи), що не спостерігалося раніше. Також практично
відсутні згадки про терпеноїди типу 1,2,3 у яких третє кільце частково
відновлене. Отже, усі похідні абієтанової кислоти знайдені нами вперше.
Похідні пімарової кислоти є гомологами абієтанів, які відрізняються на
одне етиленове угрупування. Такі сполуки також не знайдено в тканинах
хвойних [Otto, 2003], отже, вони характерні лише для ПЛ листя. Вміст
абієтанової кислоти досягав 23,45 % у ПЛ Picea abies першого року.
Показано переважання дитерпенів на першому році онтогенезу. Для
дитерпенів, на відміну від тритерпенів, характерний немевалонатний шлях
біосинтезу, всі реакції якого проходять в стромі пластид [Martin, 2002].

Існування терпеноїдів з різноманітними функціональними групами в
захисному ліпідному шарі може бути пов’язане з необхідністю формування
групи речовин, що забезпечують гетерогенну суміш, здатну підтримувати
певний “молекулярно-динамічний стан” поверхневих тканин. Такий стан
потребує наявності, з одного боку, високомолекулярних гідрофобних
речовин, які роблять вагомий внесок в “аморфну” частину ПЛ, з іншого
боку – полярних речовин, або частин молекул, що забезпечують здатність
до асоціації та формування кристалічної фази.

Показано наявність в ПЛ сквалену та п-кумарової кислоти. Попередник три
терпенів сквален був характерний для ПЛ Picea pungens, найбільше його
(0,71 %) спостерігалося на першому році онтогенезу. п-Кумарова кислота
була характерна для ПЛ лише представника роду Pinus (0,4 %).

Біохімічні характеристики поверхневих ліпідів хвойних з частковим
пошкодженням крони. Вивчалися загальні характеристики ПЛ, такі як
ІЧ-спектри та ДТА сумарних фракцій ПЛ досліджуваних рослин. Розглянемо
їх зміни на прикладі ПЛ Pinus pallasiana (табл. 1).

Таблиця.1

Відносна інтенсивність двох смуг карбонільного поглинання сумарних
поверхневих ліпідів контрольних рослин (к) та рослин з частковим
пошкодженням крони (д)

Досліджувана рослина Співвідношення інтенсивностей смуг

груп, змінювалися під впливом токсикантів. При цьому, як онтогенетичні,
так і екзогенні фактори мали однакове спрямування: збільшувалася
інтенсивність поглинання більш короткохвильової смуги (1725 – 1740 см-1)
у порівнянні з більш довгохвильовою смугою (1640 – 1650 см-1). Обидві
смуги відносяться до валентного коливання карбонільної групи. Оскільки в
ПЛ хвойних оксо-сполуки (альдегіди та кетони) відсутні, аналогічні зміни
спектральних характеристик свідчили про зміну жирнокислотного складу ПЛ
у процесі онтогенезу [Берзеніна, 2000], ми припустили, що в умовах
токсичної дії екзогенних речовин відбуваються перебудови ПЛ (синтез de
novo одних компонентів, розклад інших, або разом), які включають
біосинтез жирних кислот. Необхідно відмітити, що ІЧ-спектральні
характеристики застосовані нами вперше для оцінки екзогенного впливу на
склад ПЛ.

Таблиця 2

Параметри ендотермічних переходів поверхневих ліпідів листя хвойних
різного віку контрольних рослин (к) та рослин з частковим пошкодженням
крони (д)

Вид рослини, вік Ендоефект 1 без втрати маси

Ендоефект 2 без втрати маси

температурний інтервал,0С

мінімум 0С

температурний інтервал,0С

мінімум 0С

Pinus pallasiana 1рік/к 20-40 – 45-55 52

Pinus pallasiana 1рік/д – – 38-79 74

Pinus pallasiana 2рік/к 22-43 – 45-70 56

Pinus pallasiana 2рік/д – – 46-90 76

Перший ендотермічний ефект було знайдено тільки для рослин, які
вирощувалися у контрольних умовах. Цей низькотемпературний ефект без
мінімуму відносять до переходу аморфної фази ПЛ в кристалічну
[Reynhardt, 1994]. Отже, відсутність такого переходу у рослин з
частковим пошкодженням крони може бути пояснена зниженням інтенсивності
біосинтезу тих компонентів ПЛ, які утворюють аморфну фазу (естери,
вуглеводні і т. і.) внаслідок впливу токсикантів.

Другий ендотермічний ефект характеризує перехід кристалічної фази в
рідку, тобто плавлення ПЛ. Він має чіткий мінімум, що характерний для
плавлення кристалічних сполук і відноситься до більш полярних
компонентів ПЛ. У ПЛ під впливом токсикантів має місце зміна параметрів
цього переходу: він має набагато більший розмір, розтягнутий інтервал,
що свідчить про значно більшу гетерогенність полярних сполук. При дії
токсикантів також зростає величина температурного інтервалу. Це також
характерно для збільшення вмісту більш полярних, здатних до асоціації,
сполук (табл.. 3).

Таблиця 3

Вміст низькомолекулярнихх та високомолекулярних жирнихх кислот
поверхневих ліпідів Pinus pallasianaх контрольних рослин (к)) та рослин
з частковим пошкодженням крони (д) (у % від суми) n = 4, P

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020