ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені В.Н. КАРАЗІНА
ТИХОМИРОВ АРТЕМ ОЛЕКСАНДРОВИЧ
УДК 576.311.348.4:546.62:616-001.28
Характеристика білка гліальних проміжних філаментів головного мозку
щурів за умов впливу іонів алюмінію та іонізуючого опромінення
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Дніпропетровському національному університеті
Міністерства освіти і науки України (м. Дніпропетровськ).
Науковий керівник – кандидат біологічних наук, доцент
НЕДЗВЕЦЬКИЙ Віктор Станіславович,
Дніпропетровський національний університет,
доцент кафедри біофізики та біохімії
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
ШЕВЦОВА Алла Іванівна,
Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України,
професор кафедри біохімії та загальної хімії,
м. Дніпропетровськ;
кандидат біологічних наук, доцент
ШЕЙКО Віталій Ілліч,
Луганський національний педагогічний університет ім. Тараса Шевченка,
доцент кафедри анатомії та фізіології людини та тварин,
м. Луганськ
Провідна установа – Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
(відділ біохімії сенсорних та регуляторних систем), м. Київ
Захист відбудеться “ 21 ” вересня 2005 р. о 14:00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного
університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за
адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15.
З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна (Харків, пл.
Свободи, 4).
Автореферат розісланий “ 5 ” липня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук Падалко В.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Гліальний фібрилярний кислий білок (ГФКБ) –
гістоспецифічний компонент проміжних філаментів (ПФ) цитоскелету
астроцитів [Eng L., Ghirnikar R., 2000]. ГФКБ у складі ПФ відіграє
важливу роль у модуляції руху астроцитів та забезпеченні стабільної
морфології їх відростків при розвитку реактивного астроцитозу [Lepekhin
E., 2001]. Більшість робіт, присвячених вивченню білка, стосуються його
філаментної форми, тоді як характер змін співвідношення фібрилізованого
та розчинного пулів ГФКБ, їх поліпептидна гетерогенність залишаються не
з’ясованими. Пошкодження фізичної природи, хімічні та метаболічні
інсульти призводять до розвитку реактивного астроцитозу, основними
ознаками якого є підсилення синтезу ГФКБ та фібрилогенез у
гіпертрофованих астроцитах [Graham D.,1999]. Запропоновано використання
ГФКБ в якості молекулярного індексу нейротоксичності та маркеру
пошкодження нервової тканини [O’Callaghan J., 1995]. З точки зору
маркерної концепції вважається, що відповідь астроцитів на дію
стрес-факторів є неспецифічною, а інтенсивність біосинтезу ГФКБ залежить
від дози та тривалості впливу чинників, а не від їх природи. У зв’язку з
цим актуальним постає питання порівняльної характеристики впливу
несприятливих факторів різного походження, а також їх сумісної дії, на
метаболізм двох форм ГФКБ. У попередніх роботах співробітників кафедри
біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету
[Недзвецький В.С. и др., 1990, 1991] детально досліджено ефекти
іонізуючого опромінення на метаболізм нейроспецифічних білків та їх роль
у розвитку пострадіаційного ЦНС-синдрому. Проблема впливу малих доз
радіації залишається дуже гострою у зв’язку з підвищеним фоном у
багатьох регіонах країни. Токсикологічні ефекти алюмінію (Al), найбільш
поширеного металу біосфери, широко досліджуються з оглядом на його
залучення до етіології різних нейродегенеративних розладів, зокрема,
хвороби Альцгеймера [Grant W. et al., 2002]. Хронічні несприятливі
впливи, яких зазнає організм людини в умовах техногенного пресингу,
зумовлює необхідність пошуку адекватних показників ступеня пошкодження
нервової тканини та ефективності дії препаратів-нейропротекторів при їх
тестуванні. Комплексний підхід, який полягає в аналізі вмісту і
поліпептидного складу ГФКБ за допомогою імунохімічних методів, може
значно розширити межі прикладного застосування білка ПФ астроцитів.
Отже, дослідження поліпептидної гетерогенності двох форм ГФКБ і
специфіки їх кількісних змін за умов впливу іонів Al та іонізуючого
опромінення є актуальним та науково обгрунтованим.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалася в рамках договору про науково-технічне
співробітництво між кафедрою біофізики та біохімії Дніпропетровського
державного університету та кафедрою нормальної фізіології
Дніпропетровської державної медичної академії (№ 1145, 2000-2001 р.р.).
Дисертація відповідає основному плану теми “Дослідження механізмів
порушень метаболізму з метою діагностики і корекції” (№ 4-075-04)
науково-дослідних робіт кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського
національного університету.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи був аналіз поліпептидного складу
і вмісту філаментної та розчинної форм ГФКБ головного мозку щурів за
умов впливу іонів Al, іонізуючої радіації та засобів корекції
патологічного стану ЦНС. Для досягнення поставленої мети були поставлені
наступні задачі:
Провести імунохімічне визначення поліпептидного складу та вмісту ГФКБ у
різних відділах головного мозку щурів за умов ізольованого впливу Al3+ і
рентгенівського опромінення у низьких дозах.
Дослідити склад та кількісний вміст білка ПФ астроцитів під час сумісної
дії означених чинників.
Охарактеризувати поліпептидний склад та провести кількісне визначення
ГФКБ при превентивному введенні пірацетаму за умов опромінення.
Дослідити вплив вітаміну Е на поліпептидний склад та вміст білка ПФ
астроцитів головного мозку щурів, інтоксикованих Al3+.
Оцінити токсичні ефекти Al3+ на ЦНС щурів за наступними критеріями:
накопичення металу в тканині мозку, рівень пероксидації ліпідів у
нервовій тканині, поведінкові реакції щурів.
Об’єкт дослідження – участь білка ПФ цитоскелету астроцитів у гліальній
відповіді на пошкодження нервової тканини екзогенними чинниками.
Предмет дослідження – поліпептидний склад і вміст ГФКБ за умов впливу
іонів Al, іонізуючого випромінювання і застосування фармакологічних
засобів корекції патологічного стану ЦНС (пірацетам, вітамін Е).
Методи дослідження. У роботі використані такі методи: фотоколориметричні
методи визначення вмісту білка (метод Лоурі, метод Бредфорд) та вмісту
тіобарбітурат-активних сполук, електрофорез у градієнтному
поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності додецилсульфату натрію
(ДСН), іон-обмінна та адсорбційна хроматографії; імунологічні методи:
продукція моноспецифічної антисироватки, різні види імуноелектрофорезу,
імуноблотинг, імуногістохімія; метод визначення вмісту Al
(атомно-абсорбційна спектрофотометрія); метод оцінки
емоційно-поведінкового статусу щурів (тест “відкритого поля”).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено особливості
впливу іонів Al та іонізуючого випромінювання на склад та вміст
поліпептидів різних форм ГФКБ. Експериментально доведено, що філаментна
форма ГФКБ більш чутлива до впливу Al3+, а розчинна форма зазнає
істотних змін за умов опромінення у низьких дозах. Показані вперше
відмінності поліпептидного складу полімерізованого і розчинного ГФКБ за
умов впливу чинників різної природи свідчать про наявність
функціональної гетерогенності двох різних пулів білка. Вперше показано,
що астрогліальна відповідь на розвиток гіпералюмінійемії, крім
збільшення вмісту ГФКБ та фібрилогенезу, супроводжується активною
реконструкцією мережі ПФ цитоскелету астроцитів, стабільної за
нормальних фізіологічних умов. Новими є дані щодо запобігання деградації
білка ПФ, надмірного фібрилогенезу й активації астроцитозу пірацетамом
під час радіаційного опромінення та вітаміном Е – за умов алюмінієвої
інтоксикації. Встановлено існування прямого зв’язку між розвитком
астрогліальної відповіді, інтенсифікацією Fe- та NADPH-залежних типів
пероксидації ліпідів у тканині головного мозку та порушенням
емоційно-поведінкових реакцій тварин при інтоксикації іонами Al.
Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати
роботи дозволяють переглянути закріплені у літературі за ПФ цитоскелету
астроцитів функції пасивного механічного інтегратору
внутрішньоклітинного простору. Комплексний підхід з використанням
імунохімічних методів значно розширює межі прикладного застосування ГФКБ
як маркера патологічного стану ЦНС. Запропоновано аналіз не лише вмісту
білка, але й поліпептидного складу його різних форм, у кліниці для
скринінгу і тестування нових нейропротекторних препаратів. Зміни вмісту
та поліпептидного складу білка ПФ астроцитів можна використовувати в
якості чутливих і адекватних індикаторів ступеня нейротоксичності
екзогенних полютантів у зрілій ЦНС. На цей час результати досліджень
використовуються при викладанні спеціального курсу “Нейрохімія” на
кафедрі біофізики та біохімії Дніпропетровського національного
університету.
Особистий внесок здобувача. Розробка програми, основної робочої гіпотези
наукової проблеми та задач дослідження виконана автором сумісно з
науковим керівником – кандидатом біологічних наук, доцентом кафедри
біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету
Недзвецьким В.С. Дисертантом самостійно було виконано аналіз наукової
літератури, планування та проведення експериментальних досліджень,
статистичну обробку даних, узагальнення одержаних результатів. Дисертант
безпосередньо приймав участь у виконанні усіх завдань роботи.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були подані та
особисто представлені на наукових семінарах кафедри біофізики та
біохімії Дніпропетровського національного університету (Дніпропетровськ,
2000-2004), а також на II Національному з’їзді фармакологів України
(Дніпропетровськ, 2001), ІІ конференції Українського товариства
нейронаук (Донецьк, 2001), VI Пущинській школі-конференції молодих
вчених (Пущино, 2002), XVI з’їзді Українського фізіологічного товариства
(Вінниця, 2002), IV регіональній конференції молодих вчених та студентів
з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2002), Всеукраїнській
науково-практичній конференції “Біохімія” (Дніпропетровськ, 2003), V
регіональній конференції молодих вчених та студентів з актуальних питань
хімії (Дніпропетровськ, 2003), VIII Пущинській школі-конференції молодих
вчених (Пущино, 2004), VI міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми
старіння” (Харків, 2004), науково-практичній конференції, присвяченої
175-річчю з дня народження І.М. Сеченова (Одеса, 2004); IASN 2004,
Crimea – IBRO Advanced School Of Neuroscience (Ялта, 2004).
Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковано у 4
статтях в наукових фахових виданнях, які включені в перелік,
затверджений ВАК України, а також в 11 тезах доповідей у збірках
наукових симпозіумів та конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 164 сторінках
друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури (1
розділ), описів матеріалів та методів досліджень (1 розділ), результатів
досліджень та їх обговорення (3 розділи), узагальнення результатів
досліджень (1 розділ), висновків та списку використаних джерел. Робота
містить 32 рисунка і 11 таблиць. Перелік цитованої літератури включає
354 джерела.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з трьох підрозділів, у яких розглянуто
розвиток уявлень про структуру і функції білків ПФ цитоскелету клітин
нервової тканини. Викладено сучасний погляд на доцільність використання
ГФКБ в якості молекулярного маркеру патологій ЦНС. Висвітлено основні
аспекти нейротоксичності іонів Al.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження були проведені на дорослих (8–12 місяців) щурах лінії
Wistar. Для вивчення сумісного впливу радіації у малих дозах та іонів Al
тварин тотально піддавали дії рентгенівського випромінювання у сумарній
дозі 12,9 мКл/кг, яку щури набирали фракціоновано протягом 7, 14 і 21
дня; щури експериментальної групи, що опромінювалися протягом 21 дня,
отримували 0,2%-ий розчин AlCl3 в якості питної води. Для дослідження
ефекту пірацетаму на стан білка ПФ астроцитів тваринам, що
опромінювалися протягом різних термінів, вводили інтраперітонеально
пірацетам у дозі 0,2 г/кг за годину перед кожним сеансом. Для
дослідження впливу вітаміну Е на білок астрогліальних ПФ за умов
інтоксикації Al3+ щурам, що отримували 0,2%-ий розчин AlCl3 в якості
питної води протягом 90 днів, внутрішньочеревно вводили токоферолу
ацетат у дозі 10 мг/кг.
Розчинну форму ГФКБ одержували шляхом гомогенізації тканини головного
мозку щурів у 50 мМ трис-HCl буфері (рН 7,4), який містив 2 мМ ЕДТО, 1
мМ 2-меркаптоетанолу, 0,1 мМ фенілметилсульфонілфториду та 5 мМ соєвого
інгібітору трипсину, і центрифугування при 30000 об./хв. Для
екстрагування водонерозчинної фібрилізованої форми ГФКБ використовували
той самий буфер, що додатково містив 4 М сечовини. Вміст загального
білка у всіх пробах визначали за методом Лоурі з модифікаціями [Miller
G., 1959] та методом Бредфорд [Bradford M., 1976].
У залежності від задач експерименту використовували дві основні методики
очистки білка ПФ астроцитів: 1. Розчинну форму ГФКБ одержували шляхом
центрифугування гомогенату тканини мозку в гіпотонічному буфері з
наступним осадженням при рН 4,7 і ресуспендуванням у Na-фосфатному
буфері (рН 8,0). З одержаною фракцією проводили хроматографію на
гідроксилапатиті та НТР-біогелі. Ступінь очистки – 58,6. 2. Виділення і
очистку філаментного ГФКБ проводили методом флотації аксонів [Vorgias
C., 1983] і за допомогою хроматографії на СМ-сефарозі CL-6B та
DEAE-целюлозі. Ступінь очистки – 42,4.
Розчинні і фібрилізовані поліпептиди ГФКБ виділяли методом
препаративного гель-електрофорезу у пластині ПААГ з градієнтом 7,5–17% з
наступною електроелюцією, використовуючи далі в якості антигенів при
імунізації кролів для одержання моноспецифічних антисироваток проти ГФКБ
[Karlson J.-E., 1989; Недзвецкий В.С., 1990]. Усі одержані антисироватки
тестували на специфічність за допомогою перехресного електрофорезу та
імуноблотингу.
Фракціонування білкових екстрактів головного мозку щурів проводили
методом електрофорезу у градієнті ПААГ 7–18% у присутності ДСН [Laemmli
U., 1970], поліпептидний склад обох пулів ГФКБ визначали за допомогою
імуноблотингу з використанням моноспецифічних антисироваток [Towbin H.,
1988]. З метою ідентифікації ГФКБ-імунореактивних ділянок in situ на
зрізах різних структур головного мозку в роботі використовували
імуногістохімічний метод [Gentilini M., 1975]. Кількісно ГФКБ визначали
ракетним імуноелектрофорезом та імуноблотингом з використанням програми
“LabWork_4.0” (UVP, Велика Британія, 2001) [Struzynska L. et al., 2001;
Baydas G. et al., 2003]. Вміст ГФКБ виражали в умовних одиницях, які
розраховували шляхом віднесення величини відносної густини відповідної
поліпептидної зони після проведення імуноблотингу (%) до вмісту білка у
пробі (мкг). Відносну кількість ГФКБ, що визначався ракетним
імуноелектрофорезом, виражали в умовних одиницях, які дорівнюють площам
(мм2) відповідних імунопреципітатів, у розрахунку на 1 мкг білка
розчинної або філаментної фракцій.
Рівень пероксидації ліпідів у тканині мозку експериментальних та
контрольних щурів визначали за вмістом кінцевих продуктів ПОЛ
(ТБК-активних сполук) [Ohkawa H. et al., 1979; Чевари С. и др., 1991].
Визначення вмісту Al у головному мозку щурів виконували з використанням
атомно-абсорбційної спектрофотометрії [Хавезов И., Цалев Д., 1983].
Тестування емоційно-поведінкових реакцій тварин проводили за методикою
“відкритого поля” [Буреш Я. и др., 1991].
Результати досліджень обробляли з використанням параметричних і
непараметричних статистичних критеріїв для малих виборок: t-критерію
Ст’юдента і U-критерію Уілкоксона-Манна-Уітні [Кокунин В.А., 1975; Лакин
Г.Ф., 1990]. Розрахунки проводились за допомогою IBM-сумісного
комп’ютера з використанням програм “Statistica 6.0” та “Excel 2000”
[Лапач С.Н. и др., 2000]. Зміни показників вважали достовірними при
P0,2). Таким чином, хронічна дія
Al3+ впливає на локомоторну діяльність і емоційний стан тварин. Стан
збудження, викликаний токсикантом, істотно обертався вітаміном Е та
досягав контрольного рівня у щурів, які одержували вітамін Е при
надходженні токсиканту.
Рис. 2. Показники емоційно-поведінкових реакції щурів у тесті “відкрите
поле”: 1 – щури контрольної групи; 2 – щури, яким вводили вітамін Е; 3 –
щури, які отримували розчин AlCl3; 4 – щури, які отримували AlCl3 і
вітамін Е ( * – різниця по відношенню до контролю при Р 0,05;
гіпокамп 0,84±0,14, PZ|I
?
a
$
O
h
?
?
/aAeaaaaaa«?l &
O
EHuy
EHuy
O
EHuy
EHuy
O
$
O
G µ
O
¬??
???¬??
??????????рактерні як для розчинної, так і для філаментної форм ГФКБ.
Отже, розчинність і ступінь деградації, яка визначається за величиною
Мm, не знаходяться у прямій залежності. На користь того, що розчинна
форма білка астрогліальних ПФ не з’являється як продукт деградації
філаментної форми свідчить той факт, що розчинний ГФКБ головного мозку
щурів представлений у нормі також інтактним поліпептидом з Mm 49 кДа.
Перебудова астрогліальних ПФ за рахунок зсуву рівноваги між вмістом
розчинних та філаментних поліпептидів ГФКБ може бути асоційованою також
зі змінами фізико-хімічних властивостей ГФКБ. Іони Al здатні індукувати
формування ?-складчастої структури у фосфорильованих фрагментах
поліпептидів нейрофіламентів (НФ) [Hollosi M. еt al., 1994]. Наявність
низькомолекулярних поліпептидів ГФКБ може свідчити про аберації зборки
власне філаменту за рахунок зв’язування іонів Аl3+ з ділянками
поліпептидного ланцюга ГФКБ так само, як це показано для інших білків
цитоскелету: білків НФ і тау-білків. Одержані експериментальні
результати і дані, представлені у роботах Hollosi M. еt al., 1994 та
Zatta P., 2000, дозволяють запропонувати механізм індукції іоніми Al3+
фібрилярної дегенерації клітин ЦНС (рис. 5):
Рис. 5. Гіпотетичний механізм індукції іонами Al порушення метаболізму
білків цитоскелету клітин ЦНС та розвитку фібрилярної дегенерації.
З літературних джерел відомо, що підвищення вмісту ГФКБ може відбуватися
завдяки: а) підсиленню генної експресії, б) інгібуванню його
катаболізму, в) збільшенню кількості астроцитів внаслідок їх прискореної
проліферації, г) комбінації цих причин [Кимелберг Г., Норенберг М.,
1989]. Про розвиток астроцитозу у відповідь на підвищене надходження Al
до організму щурів свідчать дані імуногістохімічного аналізу (рис. 6).
Зокрема, у мозочку спостерігається наявність ділянок з підвищеною
ГФКБ-імунореактивністю, які відповідають зонам активної астрогліальної
відповіді.
Рис. 6. Імуногістохімічне виявлення ГФКБ на зрізах мозочку щурів (х
200, стрілками позначені астроцитарні ділянки).
Використання ГФКБ для тестування препаратів-нейропротекторів. Одним зі
шляхів скринінгу маркерних сполук вважається дослідження змін їх
метаболізму при застосуванні засобів корекції патологічного стану ЦНС,
ефекти яких широко охарактеризовано. Використання ноотропного препарату
пірацетам та антиоксиданту вітаміну Е в якості тестерів є достатньо
обґрунтованим. Дані засоби використовуються для підвищення
резистентності організму до дії несприятливих екстремальних чинників.
Протекторні ефекти ноотропів і антиоксидантів детально досліджено як на
молекулярному рівні, так і з використанням різних фізіологічних тестів
[Овсянникова Л.М., Носач Е.В., 2003]. Недостатність нейрохімічних даних,
що характеризують структурно-функціональні закономірності дії
протекторів, обмежує область їх фармакотерапевтичного застосування. Якщо
позитивні ефекти антиоксидантної терапії із застосуванням вітаміну Е у
ЦНС при опроміненні показано достатньо давно [Иванов И.И., 1975], то
можливість використання пірацетаму для корекції радіаційного
ЦНС-синдрому є сучасним перспективним напрямом у нейрофармакології
[Мурзенок П.П., Чура Н.А., 1998]. Використання вітаміну Е для терапії
алюмінієвої інтоксикації може бути доцільним, оскільки іони цього металу
індукують розвиток оксидативного стресу в тканині головного мозку [Bondy
S.C. et al., 1998]. Відомий антиоксидантний агент, вітамін Е, таким
чином, також може бути використаний як надійний інструмент для
тестування маркерних властивостей показників ПОЛ і астроцитозу.
1) Вплив пірацетаму на білок ПФ астроцитів головного мозку щурів при дії
рентгенівського випромінювання. Дані кількісного визначення філаментного
ГФКБ у мозку щурів при дії малих доз іонізуючого випромінювання і
превентивному введенні пірацетаму представлені на рис. 7. Підвищення
вмісту білка гліальних ПФ, викликане опроміненням у сумарній дозі 12,9
мКл/кг за різний термін часу, великою мірою запобігалося введенням
пірацетаму протягом 14 та 21 дня. Показано, що вміст фібрилізованого
ГФКБ істотно зменшувався у відділах мозку щурів, яким вводили ноотропний
препарат перед сеансом опромінення, у порівнянні зі щурами,
опроміненими той же термін.
Рис. 7. Вміст філаментної форми ГФКБ (умовні одиниці) у різних відділах
головного мозку щурів за умов ізольованої дії радіації (світлі стовпці)
та опромінення після превентивного введення пірацетаму (чорні стовпці):
1 – контроль; 2 – опромінення 7 днів; 3 – опромінення 14 днів; 4 –
опромінення 21 день (* – P0,05).
Результати імуноблотингу, які свідчать про зміни поліпептидного складу
ГФКБ за умов впливу AlCl3 та введення вітаміну Е, подані на рис. 9.
Найбільш істотних порушень поліпептидного складу, викликаних
інтоксикацією, зазнала філаментна форма ГФКБ мозочку і гіпокампу, про що
свідчить збільшення деградації інтактного поліпептиду 49 кДа.
Антиоксидантна терапія сприяла стабілізації
мережі астрогліальних ПФ, на що вказує зниження імунореактивності зони
субодиниці 49 кДа та кількості низькомолекулярних поліпептидів.
Рис. 9. Імуноблотинг філаментних (А) і розчинних (Б) фракцій
мозочку і гіпокампу щурів контрольної групи (1), щурів, яким вводили
вітамін Е (2), щурів, які отримували розчин AlCl3 (3) і щурів, які
отримували AlCl3 і вітамін Е (4).
Згідно з перекисно-кальцієвою теорією токсичної загибелі клітини,
пошкодження мембранних структур як результат атаки вільних радикалів
призводить до різкого підвищення у цитозолі та ядерному матриксі
концентрації вільного Са2+ та наступного розвитку клітинної патології
[Губский Ю.И., 2001]. Пряма дія вільних радикалів на процеси зборки
гліальних ПФ може суттєво доповнюватися порушенням гомеостазу
внутрішньоклітинного пулу Са2+. Можливо, що обмежений протеоліз ГФКБ
кальпаїнами за умов хронічної інтоксикації Al3+ індукується високими
рівнями цитоплазматичного Са2+. Вітамін Е, запобігаючи пероксидації
ліпідів мембран, перешкоджає вивільненню Са2+ з внутрішньоклітинних
сховищ і, відповідно, активації системи протеолізу ГФКБ. Той факт, що
вітамін Е обертав ефекти Al3+ як на біохімічному, так і на
фізіологічному рівнях, вказують на можливість впливу металу на
синаптичну пластичність і (або) залучення гліальних ПФ до процесів
інтеграції клітин ЦНС.
Дані про порушення динамічної рівноваги між неполімерізованою формою
ГФКБ і філаментними поліпептидами, отримані у роботі, свідчать про
особливості функціонування різних пулів білка ПФ за умов астрогліальної
відповіді. Реорганізація ПФ астроглії, найбільш стабільних компонентів
цитоскелету в нормі, за умов функціональної відповіді може бути тільки
одним з багатьох етапів адаптації до несприятливих впливів. Пластичність
цитоскелету астроцитів є одним з адаптивно-компенсаторних механізмів
функціонування клітинного мікрооточення нейронів при пошкодженні ЦНС.
Результати дослідження дають всі підстави розглядати апарат
астрогліальних ПФ не лише в якості пасивного механічного інтегратору
внутрішньоклітинного простору, але й активного модулятора клітинних
процесів і функцій, здатного адекватно відповідати на несприятливі
впливи. Комплексний підхід, який полягає в імунохімічному аналізі як
вмісту, так і поліпептидного складу ГФКБ, значно розширює можливості
прикладного застосування білка ПФ астроцитів у якості адекватного
маркеру для тестування препаратів-нейропротекторів.
ВИСНОВКИ
У дисертації наведено нові дані про особливості змін вмісту і стану
білка проміжних філаментів головного мозку щурів за умов ізольованої і
сумісної дії іонів Al та іонізуючої радіації. Встановлено, що філаментна
форма ГФКБ більш чутлива до впливу Al3+, а розчинні поліпептиди зазнають
істотних змін при опроміненні у низьких дозах.
Показано, що інтоксикація Al3+ викликає збільшення вмісту філаментної
форми ГФКБ (на 37% у мозочку, 30% – гіпокампі, 29% – середньому мозку,
28% – корі великих півкуль у порівнянні з контролем). Надмірний
фібрилогенез корелює з накопиченням Al у корі великих півкуль, мозочку
та гіпокампі.
Іони Al сприяють появі низькомолекулярних деградованих поліпептидів у
діапазоні Mm 46-37 кДа. Вплив Al3+ призводить не лише до акумуляції
цитоскелетного ГФКБ, але й до інтенсивної перебудови проміжних
філаментів астроцитів за рахунок обмеженого протеолізу їх білка.
Сумісний вплив рентгенівського випромінювання і AlCl3 протягом 21 дня
має синергічний характер, що проявляється у збільшенні концентрації
філаментної форми ГФКБ у мозку щурів у порівняні з ізольованим впливом
цих чинників.
Превентивне введення пірацетаму щурам суттєво попереджало збільшення
концентрації ГФКБ у сечовинних фракціях кори і мозочку на 14%,
середнього мозку – 12%, гіпокампу – 5% за умов фракціонованого
опромінення протягом 21 дня; на 17% у середньому мозку і на 23% у
гіпокампі – протягом 14 днів; на 5% у гіпокамі – протягом 7 днів. Рівень
деградації інтактного поліпептиду ГФКБ 49 кДа значно знижувався при
введенні пірацетаму за усіх термінів опромінення.
6. Експериментально доведено існування прямого зв’язку між ступенем
накопичення фібрилізованого ГФКБ, інтенсифікацією Fe- та NADPH-залежних
типів пероксидації ліпідів у тканині головного мозку та порушенням
емоційно-поведінкових реакцій тварин при інтоксикації іонами Al.
7. Вітамін Е запобігав деградації ГФКБ і підвищенню вмісту філаментної
форми ГФКБ при хронічному пероральному споживанні AlCl3 на 45% у корі
великих півкуль і на 29% у мозочку і гіпокампі, сприяв зниженню рівня
індукованого ПОЛ у нервовій тканині та нормалізації поведінкових реакцій
інтоксикованих тварин.
8. На підставі проведених експериментальних досліджень встановлено, що
кількісне визначення ГФКБ і аналіз поліпептидного складу білка проміжних
філаментів астроцитів можуть використовуватися в якості адекватних
маркерів несприятливих впливів на ЦНС і показників ефективності дії
нових нейропротекторних препаратів при їх тестуванні.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
В.С. Недзвецький, П.О. Неруш, А.О. Тихомиров, Ж.О. Корякіна, Л.А.
Романенко. Вплив іонізуючого випромінювання і хлориду алюмінія на
проміжні філаменти нейронів мозку щурів // Мед. хімія. – 2000. – Т.2,
№1. – с. 49-53. (Дисертантом отримано фракції цитоскелетних білків
мозку, проведено їх електрофоретичне розділення та імуноблотинг,
статистичну обробку отриманих даних).
А.О. Тихомиров. Вплив хлориду алюмінія на гліальні проміжні філаменти
мозку щурів // Вісник Дніпропетровського національного університету. –
2001. – Т.2, № 9. – с. 87-92.
В.С. Недзвецький, П.О. Неруш, А.О. Тихомиров, Ж.О. Корякіна, Л.А.
Романенко. Протекторна дія пірацетаму на проміжні філаменти гліальних
клітин і нейронів за умов впливу малих доз іонізуючої радіації // Експ.
фізіол. та біохімія. – 2001. – Т.15, № 3. – с. 28-34. (Дисертантом
отримано фракції білків цитоскелета тканини головного мозку щурів,
проведено їх електрофоретичне розділення та імуногістохімічне виявлення
ГФКБ).
В.С. Недзвецький, П.О. Неруш, А.О. Тихомиров, Л.А. Романенко. Вплив
іонізуючого випромінювання і хлориду алюмінія на білок проміжних
філаментів головного мозку щурів // Нейрофизиология. – 2001. – Т.33, №1.
– с. 33-38. (Дисертант приймав участь в одержанні фракцій білків
цитоскелету тканини головного мозку щурів, проводив імунохімічний та
гістохімічний аналіз ГФКБ, визначення вмісту алюмінію в тканині мозку,
статистичну обробку результатів та інтерпретацію отриманих даних).
В.С. Недзвецький, А.О. Тихомиров, Ж.О. Корякіна, Л.А. Романенко. Вплив
пірацетаму на зміни проміжних філаментів, індукованих іонизуючим
випромінюванням // II Національний з’їзд фармакологів України
(Дніпропетровськ). – 2001. – с. 174. (Дисертантом отримано фракції
білків цитоскелета тканини головного мозку щурів, проведено їх
електрофоретичне розділення та імуногістохімічне виявлення ГФКБ).
А.А.Тихомиров. Реконструкция глиальных промежуточных филаментов
головного мозга крыс в условиях совместного действия ионов алюминия и
ионизирующего излучения // ІІ конф. Укр. Товариства нейронаук
(Донецьк).- Архив клин. и эксп. мед. – 2001. – Т.10, № 2. – с.222.
7. А.А.Тихомиров. Протекторное действие пирацетама на структуру и
полипептидный состав нейрофиламентов в условиях действия малых доз
ионизирующего излучения // VI Пущинская школа-конференция молодых ученых
(Пущино). – 2002. – Т.1. – с. 333.
Ж.А. Корякина, А.А. Тихомиров. Влияние хлорида алюминия на полипептидный
состав нейрофиламентов головного мозга крыс // XVI з’їзд Укр. Фізіол.
товариства (Вінниця).- Фізіологічний журнал. – Т. 48, № 2. – с. 7-8.
(Дисертантом проведено електрофоретичне розділення білкових фракцій,
імунохімічне дослідження вмісту і поліпептидного складу білка гліальних
ПФ, статистичну обробку даних).
А.О. Тихомиров, О.М. Яковенко. Можливі механізми формування комплексів
Al3+з поліпептидами нейрофіламентів // IV регіональна конференція
молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ).
– 2002. – с. 67. (Дисертантом виконано збiр і аналіз літературних даних
щодо висвітленої наукової проблеми).
А.О. Тихомиров, І.А. Чураченко, О.М. Яковенко. Алюміній: залучення до
розвитку нейродегенеративних розладів // Всеукраїнська науково-практична
конференція “Біохімія” (Дніпропетровськ). – 2003. – с. 15-18. (Дисертант
здійснив інформаційний пошук, виконав аналіз літературних джерел,
присвячених даній проблемі, та їх узагальнення).
А.О. Тихомиров, І.А. Чураченко. Протекторний ефект вітаміну Е на стан
гліальних проміжних філаментів головного мозку щурів за умов хронічного
впливу хлориду алюмінію // V регіональна конференція молодих вчених та
студентів з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ). – 2003. – с. 52.
(Дисертантом здійснено підготовку експерименту, аналіз вмісту і
фізико-хімічних властивостей білка ПФ астроцитів мозку щурів,
статистичну обробку одержаних результатів та їх обговорення).
А.А. Тихомиров. Влияние витамина Е на астроглиоз в головном мозге крыс
при интоксикации хлоридом алюминия // VІІІ Пущинская школа-конференция
молодых ученых (Пущино). – 2004. – с. 70.
А.А. Тихомиров, В.С. Недзвецкий. Вовлечение алюминия в процесс старения
мозга // VI международный симпозиум “Биологические механизмы старения”
(Харьков). – 2004. – с. 73. (Дисертант здійснив аналіз і узагальнення
даних стосовно висвітленої наукової проблеми).
В.С. Недзвецький, А.О. Тихомиров. Підвищення вмісту маркерів
оксидативного стресу і астрогліозу у головному мозку щурів за умов
інтоксикації AlCl3 //Науково-практична конференція, присвячена 175-річчю
з дня народження І.М. Сеченова (Одесса). – 2004. – с. 106-109.
(Дисертантом виконано планування експерименту, визначення вмісту
показників астрогліальної відповіді та кінцевих продуктів ПОЛ у
головному мозку щурів, статистичну обробку результатів та їх
обговорення).
15. G. Baydas, M.V. Lipka, A.A. Tykhomyrov, V.S. Nedzvetskii, P.A.
Nerush. Increase of glial molecular markers in the brain of diabetic
rats reversed with vitamin E // Crimea – IBRO Advanced School Of
Neuroscience (Yalta). – 2004. – p.3. (Дисертант приймав участь у
постановці модельного експерименту стрептозотоцин-індукованого діабету
та обговоренні результатів дослідження).
АНОТАЦIЯ
Тихомиров А.О. Характеристика білка проміжних філаментів головного мозку
щурів за умов впливу іонів алюмінію та іонізуючого опромінення. –
Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Харківський національний
університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2004.
Дисертація присвячена вивченню поліпептидного складу та вмісту
гліального фібрилярного кислого білка (ГФКБ) головного мозку щурів за
умов впливу іонів Al та іонізуючої радіації. Встановлено, що іони Al
індукують збільшення кількості фібрилізованої субодиниці білка проміжних
філаментів з Mm 49 кДа і низькомолекулярних деградованих поліпептидів у
діапазоні Mm 46–37 кДа. Сумісний вплив Al3+ і випромінювання має
синергічний характер. Розчинна форма ГФКБ зазнає істотних змін при
опроміненні, філаментна форма ГФКБ проявляє більшу чутливість до дії
Al3+, що може свідчити про функціональну гетерогенність різних пулів
ГФКБ у мозку при дії стрес-факторів. Вітамін Е і пірацетам значно
запобігали деградації поліпептидів ГФКБ та інтенсифікації фібрилогенезу,
викликаних несприятливими впливами. На основі одержаних даних обговорена
можливість більш широкого застосування імунохімічного аналізу стану та
вмісту білка проміжних філаментів астроглії в якості адекватних
показників при тестуванні засобів корекції патологічного стану ЦНС.
Ключові слова: гліальний фібрилярний кислий білок (ГФКБ), астроцитоз,
іони алюмінію, низькі дози іонізуючої радіації, пірацетам, вітамін Е,
перекисне окиснення ліпідів, поведінкові реакції.
АННОТАЦИЯ
Тихомиров А.А. Характеристика белка глиальных промежуточных филаментов
головного мозга крыс в условиях влияния ионов алюминия и ионизирующего
облучения. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. – Харьковский национальный
университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2004.
Диссертация посвящена исследованию полипептидного состава и содержания
глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) головного мозга крыс в
условиях влияния ионов Al и ионизирующей радиации. Методами
иммуноблоттинга и иммуноэлектрофореза c использованием моноспецифической
антисыворотки показано, что ионы Al индуцируют увеличение содержания
интактного филаментного полипептида ГФКБ с Mm 49 кДа, а также
низкомолекулярных деградированных полипептидов в диапазоне Mm 46–37 кДа
на 37% в мозжечке, 30% – гиппокампе, 29% – среднем мозге и 28% – коре
больших полушарий. Впервые продемонстрировано, что астроглиальный ответ
на воздействие Al3+ сопровождается не только аккумуляцией цитоскелетного
ГФКБ, но и активной перестройкой стабильных в норме промежуточных
филаментов за счет ограниченного протеолиза ГФКБ. Совместное влияние
фракционированного рентгеновского излучения и Al3+ на белок
промежуточных филаментов астроцитов носит синергичный характер, на что
указывает увеличение концентрации его фибриллизованной формы в мозге
крыс по сравнению с изолированным действием тест-факторов.
В работе показано, что полипептиды ГФКБ 46–37 кДа характерны как для
растворимой, так и для филаментной форм белка. Было сделано
предположение, что растворимость и степень деградации не находятся в
прямой зависимости. Продемонстрировано, что ионы Al оказывают более
выраженное действие на фибриллизованную форму белка промежуточных
филаментов астроцитов, тогда как лабильная растворимая форма более
чувствительна к влиянию низких доз рентгеновского излучения. Учитывая
полученные данные, очевидно, что особенности метаболизма и
физико-химических свойств разных форм ГФКБ обуславливают функциональную
гетерогенность двух пулов белка в ЦНС в условиях патологии.
Проведены исследования содержания Al в ткани мозга интоксицированных
животных. Показано достоверное увеличение концентрации металла в
мозжечке на 62% и гиппокампе – 73% по сравнению с контролем. Установлено
наличие положительной корреляционной связи между повышением содержания
Al в ткани мозга и увеличением содержания цитоскелетного ГФКБ
(коэффициент корреляции в коре больших полушарий 0,55±0,22, мозжечке –
0,80±0,16, гиппокампе – 0,84±0,14; Р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
