МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ
ТЕФТЮЄВА Наталя Борисівна
УДК 616.36-002-085.322:582.71]:577.1
Вплив настоянки перстачу прямостоячого на функціональний стан печінки за
умов норми та експериментального гепатиту
14.01.32 – Медична біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Буковинському державному медичному університеті
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Мещишен Іван Федорович,
Буковинський державний медичний університет,
завідувач кафедри медичної хімії
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Хмелевський Юрій Володимирович
Національний медичний університет імені О.О. Богомольця
кафедра біоорганічної, біологічної та
фармацевтичної хімії
доктор медичних наук, професор
Луцюк Микола Борисович,
Вінницький національний медичний
університет ім. М.І. Пирогова,
професор кафедри загальної та біологічної хімії
Провідна установа: Українська медична стоматологічна академія
МОЗ України, м. Полтава
Захист відбудеться “ 15 ” “ грудня ” 2005 р. о 13 годині 30 хвилин
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.07 Національного
медичного університету імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ,
пр.Перемоги, 34, фізико-хімічний корпус НМУ)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного
університету імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, вул. Зоологічна,1)
Автореферат розісланий “ ” 2005
року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.І. Толстих
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АОЗ – антиоксидантний захист
АЛТ – аланінамінотрансфераза
АСТ – аспартатамінотрансфераза
ГГТ – ?-глутамілтрансфераза
Г-SH – відновлений глутатіон
ГSSГ – окиснений глутатіон
Г-S-Т – глутатіон-S-трансфераза
Г-6-ФДГ – глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа
Гл-6-Ф – глюкозо-6-фосфатаза
ГП – глутатіонпероксидаза
ГР – глутатіонредуктаза
ДК – дієнові кон’югати
ІПЗ – сполуки з ізольованими подвійними зв’язками
КД і СТ – кетодієни і спряжені триєни
Коефіцієнт Де Ритіса – (АСТ/АЛТ)
ЛДГ – лактатдегідрогеназа
?- ліпопротеїни – ліпопротеїни низької щільності
ЛФ – лужна фосфатаза
МДА – малоновий діальдегід
МСМ – молекули середньої маси
НАДФ – нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат (окиснена форма)
НАДФН – нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат (відновлена форма)
НПП – настоянка перстачу прямостоячого, 1:5 на 40% етиловому спирті
ОМБ – окисно-модифіковані білки
ПОЛ – пероксидне окиснення ліпідів
Hb –гемоглобін
ХС – холестерол загальний
ЦП – церулоплазмін
Підписано до друку 01.11.2005р. Формат 60х90 1/16. Папір офсетний.
Друк офсетний. Умов. друк.арк.0,9.
Тираж 100 прим. Замовлення № 464.
Віддруковано: ПП Місікевич
58000, Чернівці, вул. Котляревського, 15, тел. 51-05-51
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Вивчення біохімічних механізмів токсичних уражень
печінки з встановленням можливих підходів до їх корекції за допомогою
біологічно активних речовин рослинного походження є важливим напрямком
комплексних досліджень медичної біохімії.
Отруєння чотирихлористим вуглецем (CCl4) займає значну частку серед
гострих інтоксикацій населення ксенобіотиками (А.Гутникова и др., 2002;
Е.А. Лужников, 1999). Він має кумулятивні властивості, при надходженні в
організм ушкоджує печінку, викликаючи дозозалежні зміни її функцій та
морфологічної структури (Ю.І. Губський, 1999; Н.П. Скакун и др., 1989;
L.W. Weber et al., 2003).
Універсальним патогенетичним механізмом ушкодження клітин внаслідок дії
екстремальних факторів різної природи є активація процесів пероксидного
окиснення ліпідів (ПОЛ) біомембран, що сприяє прогресуванню патологічних
процесів та розвитку цитолізу, зокрема в печінці, яка відіграє важливу
роль у детоксикації різноманітних отрут (А.О. Буеверов, 2002; Г. Невойт,
2003). За умов погіршення екологічної ситуації, активність власних
систем антиоксидантного захисту організму виявляється недостатньою для
регуляції вільнорадикальних процесів та потребує введення в організм
екзогенних антиоксидантів (В.А. Барабой, Ю.В. Хомчук, 1998; І.Ф.
Бєленічев і ін., 2002). Як відомо, сучасні підходи до лікування
захворювань гепатобіліарної системи передбачають використання
фітопрепаратів, оскільки вони мають збалансований хімічний склад і
різноплановий фармакологічний вплив на організм людини, дозволяють
досягти терапевтичного ефекту при найменшій вираженості побічної дії
(О.Ю. Катикова и др., 2002; Т.С. Сахарова та ін., 2003).
Перспективним, на нашу думку, є пошук нових лікарських засобів на основі
перстачу прямостоячого (Potentilla erecta L.), в кореневищі якого
виявлений комплекс біологічно активних речовин, частина з яких є
природними антиоксидантами (J. Nkiliza, 1999; B.Vennat et al., 1994).
Кореневище перстачу прямостоячого виявляє антимікробну та протизапальну
активність; застосовується в акушерсько-гінекологічній практиці, входить
до складу в’яжучих засобів, мазі “Вундехіл”, препарату “Эликсир
Демидовский”, що має гастропротекторну дію (Дж.Г. Гоголадзе, Л.И.
Личели, 1990; В.Г. Макаров и др., 1998; М.Д. Машковский, 2000; І.С.
Чекман, 2003). Як протипроносні засоби фарміндустрією Німеччини
випускаються препарати “Гербатормент”, “Діаррель”, “Гастритол”; а для
лікування стоматитів та пародонтозів – “Рефа-ос” (Rote Liste, 1997).
Дані щодо використання препаратів з кореневища перстачу прямостоячого як
гепатопротекторів обмежені (А.И. Андрукович, 1970; Р.Н. Зозуля, Л.В.
Селенина, 1974).
Дослідження впливу настоянки перстачу прямостоячого на оксидантно-
антиоксидантний та функціональний стан печінки щурів за умов норми, та
можливість корекції настоянкою порушень функціонального стану печінки за
умов експериментального гепатиту дозволило б обґрунтувати її
використання в клінічній практиці як гепатопротектора.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
проводилась у рамках науково-дослідної роботи Буковинського державного
медичного університету: “Вивчення нових сторін механізму терапевтичної
дії лікарських рослин (девясилу високого, родіоли рожевої, перстачу
прямостоячого, ехінацеї пурпурової), пилку квіткового, ербісолу, етонію,
додецонію та обґрунтування нових технологій їх застосування при
лікуванні хворих на первинні, вторинні гастродуоденіти, холецистити,
остеоартроз, хронічну серцеву недостатність”, № держреєстрації
0101U005248. Дисертант, як співвиконавець зазначеної теми, дослідила
вплив настоянки перстачу прямостоячого на функціональний та
оксидантно-антиоксидантний стан печінки щурів за умов норми та
експериментального гепатиту.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановити характер впливу
настоянки з кореневища перстачу прямостоячого (1:5 на 40% етиловому
спирті) на біохімічні показники функціонального стану печінки щурів за
умов норми та експериментального токсичного гепатиту і обґрунтувати
можливості її використання в клінічній практиці.
Для досягнення мети були поставлені такі задачі:
1. Вивчити стан пероксидного окиснення ендогенних ліпідів печінки щурів
за умов in vitro на тлі дії різних концентрацій настоянки перстачу
прямостоячого.
2. Дослідити вплив настоянки перстачу прямостоячого на процеси
пероксидного окиснення ліпідів та стан глутатіонової антиоксидантної
системи печінки, показники метаболізму білків, ліпідів, вуглеводів у
плазмі крові білих щурів за умов норми.
3. Дослідити можливість фармакологічної корекції порушень
функціонального стану печінки та біохімічних змін функціонування
глутатіонової антиоксидантної системи печінки щурів настоянкою перстачу
прямостоячого на моделі експериментального гепатиту.
4. На підставі отриманих на щурах експериментальних даних розробити і
обгрунтувати оптимальну дозу та тривалість застосування настоянки
перстачу прямостоячого.
Об’єкт дослідження: експериментальний гепатит на фоні введення настоянки
перстачу прямостоячого.
Предмет дослідження: біохімічні показники функціонального стану печінки,
пероксидного окиснення ліпідів, окиснювальної модифікації білків,
антиоксидантної системи крові та печінки щурів.
Методи дослідження – біохімічні (уніфіковані клінічні лабораторні методи
визначення показників обміну білків, ліпідів, вуглеводів; визначення
показників пероксидного окиснення ліпідів та стану антиоксидантної
системи), хімічні (дослідження хімічного складу настоянки), статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі вперше вивчено
вплив настоянки перстачу прямостоячого на оксидантний стан і показники
антиоксидантного захисту печінки та крові щурів за умов in vivo та
обґрунтовані біохімічні механізми її антиоксидантної дії. Доведено, що
настоянка виявляє антиоксидантні властивості за рахунок пригнічення
процесів вільнорадикального окиснення біомолекул та активації систем
антиоксидантного захисту печінки та крові щурів.
Вперше проведено комплексні дослідженння впливу настоянки перстачу
прямостоячого на метаболічні процеси у печінці білих щурів, на показники
білкового, ліпідного, вуглеводного та водно-електролітного обмінів за
умов норми; досліджено можливість корекції зрушень
оксидантно-антиоксидантної рівноваги та функціонального стану печінки
щурів настоянкою перстачу прямостоячого за умов експериментального
токсичного гепатиту. Встановлено, що настоянка перстачу прямостоячого,
при застосуванні впродовж 7 та 14 діб у дозі 0,5 мл та 1,0 мл на 1 кг
маси за умов норми, виявляє антиоксидантну дію, не викликає цитолізу
гепатоцитів та порушення функціонального стану печінки тварин.
Довготривале її застосування (впродовж 21 дня) викликає зрушення окремих
метаболічних процесів, проте не виявляє цитотоксичної дії. Науково
обґрунтована можливість використання настоянки як антиоксидантного
засобу при лікуванні експериментального гепатиту: застосування її
впродовж 7 днів у дозі 1,0 мл /кг викликало достовірне зменшення
інтенсивності процесів пероксидації, та нормалізувало активність
глутатіонової ланки антиоксидантного захисту печінки та крові щурів, а
впродовж 14 днів – нормалізувало інтенсивність вільнорадикальних
процесів та показники функціонального стану печінки щурів.
Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної
роботи мають практичне значення для медичної біохімії, фармакології та
токсикології. Отримані результати дозволяють констатувати ефективність
настоянки перстачу прямостоячого як антиоксидантного та
гепатопротекторного засобу за умов токсичних уражень печінки, що
обґрунтовує можливість її використання в медичній практиці. За
матеріалами досліджень розроблено рацпропозицію Буковинської державної
медичної академії № 73/04 (І.Ф. Мещишен, Н.Б. Тефтюєва “Визначення
активності лактатдегідрогенази у тканині печінки кінетичним
УФ-методом”), та отриманий патент на винахід “Застосування настойки
перстачу прямостоячого як антиоксидантного засобу” (Бюл. №1, 17.01.2005,
7 А61К35/78).
Особистий внесок здобувача. Разом із науковим керівником визначена мета
та завдання даного дослідження. Дисертантом самостійно здійснено
опрацювання наукової літератури з обраної теми, підготовка та проведення
експериментальних досліджень, статистична обробка та інтерпретація
одержаних результатів, сформульовані висновки та практичні рекомендації,
які відображені в опублікованих роботах.
Апробація результатів дослідження. Основні положення дисертаційної
роботи доповідалися та обговорювалися на науковій конференції з
міжнародною участю “Оздоровчі ресурси Карпат і прилеглих регіонів”
(Чернівці, 1999); І та ІІІ Львівсько-Люблінській конференціях з
експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2000; 2004); VI з’їзді
Всеукраїнського лікарського товариства (Чернівці, 2001); 78-ій науковій
конференції студентів і молодих вчених, присвяченій 60-річчю
Буковинської державної медичної академії (Чернівці, 2004); Х конгресі
СФУЛТ (Чернівці, 2004).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць, з них 9
статей – у наукових фахових виданнях (4 – одноосібні), 6 робіт – в
збірниках конференцій.
Структура і обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 179 сторінках
машинопису і включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів
досліджень, 3 розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення
одержаних результатів, висновки, практичні рекомендації. Бібліографія
включає 359 найменувань цитованої літератури (262 – кирилицею та 97 –
латиницею). Робота ілюстрована 3 рисунками і 16 таблицями, містить 2
додатки.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, завдання та
методи досліджень, розкрито наукову новизну і практичне значення роботи,
зазначено особистий внесок здобувача і апробацію результатів дисертації.
У першому розділі систематизовано й узагальнено літературні дані щодо
сучасних уявлень про біохімічні механізми розвитку вільнорадикальних
патологій, розкриваються питання функціонального стану мембранних
структур гепатоцитів, стану процесів ПОЛ, антиоксидантної та
мікросомальної систем захисту за умов інтоксикації CCl4, а також – шляхи
корекції патологічних порушень. Узагальнені основні відомості щодо
біологічно активних речовин кореневища перстачу прямостоячого, його
фармакологічних властивостей та застосування в медицині.
Матеріали та методи дослідження. Досліди виконані на 442 білих,
безпородних щурах-самцях масою 170 – 210г, яких утримували на
повноцінному раціоні віварію з вільним доступом до їжі та води при
температурі 19-21оС. Кожна дослідна група тварин порівнювалась зі своїм,
паралельно поставленим контролем. Утримування тварин та робота з ними
здійснювались у відповідності до міжнародно прийнятих правил проведення
робіт з експериментальними тваринами.
У роботі використана настоянка перстачу прямостоячого (НПП), яка була
виготовлена із висушеного кореневища Potentilla erecta (L.), Raeush, що
відповідає усім вимогам ДЕСТ 6716-71, у співвідношенні (1:5), способом
мацерації на 40% етиловому спирті, згідно до вимог 9-ої Фармакопеї СРСР
(сертифікат аналізу контрольно-аналітичної лабораторії м. Чернівці, №57
від 26.01.2001). Усі дослідження проведені на одній партії настоянки.
Дослідили хімічний склад настоянки за загальноприйнятими методиками.
Антиоксидантну активність препарату за умов in vitro оцінювали за
ступенем гальмування швидкості аскорбатзалежного пероксидного окиснення
ендогенних ліпідів печінки інтактних тварин за реакцією з
тіобарбітуровою кислотою (И. Ф. Мещишен, 1991).
Вивчалася зміна біохімічних показників під впливом настоянки за умов
норми, що дозволило оцінити її вплив на показники обміну білків,
ліпідів, вуглеводів, залежно від дози та тривалості введення. Тварин
розподілено на групи: 1 – контроль (здорові тварини); 2 – отримували НПП
у добовій дозі 0,5 мл /кг маси; 3 – отримували НПП у добовій дозі 1,0 мл
/кг маси. Настоянку розводили дистильованою водою і вводили
внутрішньошлунково впродовж 21 дня (щоденно, вранці). Щурам контрольної
групи аналогічно вводили дистильовану воду в такому ж об’ємі. Тварин
виводили з досліду через 7, 14 та 21 добу після початку введення
настоянки. Евтаназію тварин здійснювали вранці натщесерце під легким
ефірним наркозом. Підбір біохімічних тестів проводили з урахуванням
методичних рекомендацій з доклінічного дослідження лікарських засобів
(А.А. Лудченко и др., 2000; О.В. Стефанов, 2001).
Вплив настоянки на про- та антиоксидантний стан in vivo вивчали як за
умов норми, так і експериментального гепатиту. Моделлю токсичного
ураження печінки служила інтоксикація щурів чотирихлористим вуглецем
(CCl4), який вводили внутрішньошлунково дворазово (через день) із
розрахунку 0,25 мл/100 г маси щура у вигляді 50% оливкового розчину, що
складало 2/3 ЛД50 для CCl4 (Ю.И. Губский, 1989; И.Ф. Мещишен, 1991).
Тварин розподілено на групи: 1 – контроль (здорові щури); 2 –
інтоксиковані CCl4; 3 – тварини, яким починаючи з останнього дня
моделювання гепатиту вводили настоянку перстачу прямостоячого щоденно
внутрішньошлунково в дозі 1 мл/кг маси тіла. Тварин забивали
декапітацією під легким ефірним наркозом.
Показники крові і печінки досліджували у динаміці та порівнювали з
показниками контрольної групи. Для дослідження показників оксидантного
та антиоксидантного стану кров щурів відбирали в присутності
етилендіамінтетраацетату (ЕДТА) в концентрації 1 мг/мл крові
(И.А.Волчегорский и др., 1989). Для дослідження показників
функціонального стану печінки кров відбирали в присутності гепарину.
Показники оксидантно-антиоксидантного стану печінки щурів визначали у
постядерному супернатанті 5% гомогенату печінки, який готували на 50 мМ
трис-НСl-буфері (рН 7,4).
Визначали активність ферментів в плазмі крові: ?-глутамілтрансферази
(ГГТ) [КФ 2.3.2.2] – за вивільненням n-нітроаніліну;
аланінамінотрансферази (АЛТ) [КФ 2.6.1.2] та аспартатамінотрансферази
(АСТ) [КФ 2.6.1.1] – динітрофенілгідразиновим методом S. Reitman, S.
Frankel; ?-амілази [КФ 3.2.1.1] – за методом W.T. Caraway;
лактатдегідрогенази (ЛДГ) [КФ1.1.1.27] – кінетичним УФ – методом; лужної
фосфатази (ЛФ) [КФ 3.1.3.1] – за гідролізом фенілфосфату (М.А. Базарнова
и др., 1990). У плазмі крові колориметрично визначали вміст:
?-ліпопротеїнів, загальних ліпідів, триацилгліцеролів, загального
холестерину (ХС), загального білірубіну, глюкози, загального білка,
альбуміну, сечовини, сечової кислоти та креатиніну за уніфікованими
методиками (В.В.Меньшиков, 1988); неорганічного фосфору – за реакцією з
молібденовою кислотою, загального кальцію – реакцією з
о-крезолфталеїнкомплексоном у лужному середовищі, заліза – за реакцією
Fe2+ з натрієвою сіллю ферозину, хлорид-іонів – за реакцією із роданідом
ртуті (ІІ) (Н.У. Тиц, 1997) з використанням стандартних наборів
реагентів вітчизняного виробництва НПП „Филисит диагностика” (м.
Дніпропетровськ) та наборів фірми “Lachema”.
Вміст проміжних молекулярних продуктів ПОЛ (ІПЗ, ДК, КД і СТ) визначали
у гептан-ізопропанольних екстрактах крові тварин та гомогенатів печінки
(И.А. Волчегорский и др. 1989). Визначали вміст малонового діальдегіду
(МДА) в еритроцитах (Н.В. Васильєва, І.Ф. Мещишен, 1998) та гомогенатах
печінки (Ю.А. Владимиров, А.И.Арчаков, 1972); вміст глутатіону
відновленого (Г-SH) в печінці – модифікованим (за І.Ф. Мещишеним, 1991)
методом, а в крові – методом О.В. Травіної, 1955.
У плазмі крові визначали вміст церулоплазміну (ЦП) [КФ 1.16.3.1] – за
модифікованим методом Ревіна (В.С. Камышников, 2003), молекул середньої
маси (МСМ) (Н. Габриэлян, В.Липатова, 1984), окисно-модифікованих білків
(ОМБ) (І.Ф. Мещишен, 1998). У гемолізатах крові та гомогенатах печінки
щурів визначали активність: каталази [КФ 1.11.1.6] (М.А.Королюк и др.,
1988), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ) [КФ1.1.1.49] (Ю.Л.
Захарьин, 1967), глутатіонредуктази (ГР) [КФ 1.6.4.2] (E. Beutler,
1969), глутатіонпероксидази (ГП) [КФ 1.11.1.9] (І.В. Геруш, І.Ф.
Мещишен, 1995). У плазмі крові та гомогенатах печінки визначали
активність глутатіон-S-трансферази (Г-S-Т) [КФ2.5.1.18] (H.W. Habig,
1974). У печінці щурів визначали активності аргінази [КФ 3.5.3.1]
(И.Ф.Мещишен, 1991), 5?-нуклеотидази [КФ 3.1.3.5] (B. Israelsson, I.
Tengrup, 1980), глюкозо-6-фосфатази (Гл-6-Ф) [КФ3.1.3.9] (M.A. Swanson,
1955).
Отримані експериментальні дані обробляли статистично з використанням
параметричного t-критерію достовірності Ст’юдента за допомогою
ІВМ-сумісного комп’ютера за програмами “Statgraphics” та “Excel”. Зміни
показників вважали вірогідними при Р?0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.
Вплив настоянки перстачу прямостоячого на оксидантно-антиоксидантний
стан печінки щурів за умов норми. Досліджено хімічні властивості
настоянки перстачу прямостоячого (НПП). Згідно отриманих даних,
настоянка містить біологічно активні речовини, які є природними
антиоксидантами. Це – флавоноїди (0,13 ? 0,07 %), поліфенольні сполуки
(0,31?0,10 %), дубильні речовини (44,7 ? 2,0 мг/ мл), аскорбінова
кислота (12,3 ?1,4 мг %), каротиноїди (6,95 ? 0,14 мг %).
Для з’ясування діапазону концентрацій, в якому слід очікувати вплив НПП
на оксидантно-антиоксидантну рівновагу, проведено вивчення впливу
настоянки на аскорбатзалежне ПОЛ in vitro. Результати показали істотне
гальмування швидкості ПОЛ в печінці інтактних тварин при додаванні в
інкубаційне середовище настоянки перстачу прямостоячого в розведенні
10–4 -10–5. Дослідження антиоксидантної дії різних концентрацій
настоянки дозволяє визначити діапазон її лікувальної дії і розрахувати
орієнтовно профілактичну (10-20% гальмування ПОЛ печінки) та лікувальну
(30-35% гальмування) дози. У концентрації 0,44 мг дубильних речовин /100
г настоянки препарат на 46,5 % гальмував швидкість пероксидного
окиснення ендогенних ліпідів, що відповідало оптимальній дозі in vivo
1,0 мл настоянки на 1 кг маси тіла тварин.
Аналіз оксидантно-антиоксидантного стану показав (табл. 1), що іn vivo
за умов норми антиоксидантний ефект настоянки проявлявся в дозах 0,5мл,
1,0 мл та 2,0 мл на 1 кг маси щура. Рівень малонового діальдегіду (МДА)
– одного з кінцевих продуктів ПОЛ – достовірно знижувався в печінці
щурів на 20% після одноразового введення настоянки в дозі 1,0 мл/кг, а
її триразове введення зменшувало його рівень вдвічі. Антиоксидантна дія
НПП in vivo обумовлена, в першу чергу, активацією антиоксидантних
ферментів – каталази та Г-S-Т, активність яких достовірно зростала у
печінці тварин уже через 1 добу на 19 % та 15 % відповідно. Введення
щурам аналогічного об’єму 36% етилового спирту показало, що дія НПП не
зумовлена етиловим спиртом.
Таблиця 1
Вплив настоянки перстачу прямостоячого на оксидантно-антиоксидантний
стан печінки щурів за умов норми ( мл препарату /кг маси тіла) (М?m; n=
6 – 12)
Умови досліду
МДA, (мкмоль/ г тканини) Каталаза,
(мкмоль/ хв • мг білка) Г-SН,
(мкмоль/ г тканини) Г-S-Т,
(нмоль/ хв • мг білка)
Контроль 43,8 ± 1,21 162 ± 8,4 7,39±0,15 53 ± 1,7
1 доба 0,5 мл
41,8 ± 2,54
168 ± 7,4
7,06±0,22
53 ± 2,0
1,0 мл
35,1 ± 1,97*
193 ± 7,7*
5,73±0,16*
61 ± 2,5*
2,0 мл
34,6 ± 1,85*
194 ± 8,5*
6,02±0,16*
59 ± 2,1
2,0 мл спирт
39,9 ± 2,45
181 ± 5,3
6,91±0,16
54 ± 2,0
3 доби 0,5 мл
39,6 ± 1,88
172 ± 6,4
7,30±0,14
52 ± 1,4
1,0 мл
22,0 ± 1,51*
195 ± 6,8*
7,35±0,18
52 ± 1,7
2,0 мл
20,0 ± 1,29*
199 ± 8,4*
6,86±0,19
54 ± 2,8
2,0 мл спирт
39,1 ± 2,20
178 ± 5,2
7,35±0,22
54 ± 2,0
14 діб 0,5 мл
43,6 ± 2,28
167 ± 5,3
7,25±0,14
53 ± 1,4
1,0 мл
39,7 ± 2,43
172 ± 5,5
7,16±0,22
51 ± 2,7
2,0 мл
38,6 ± 2,43
176 ± 7,0
6,98±0,18
54 ± 2,0
2,0 мл спирт
40,3 ± 1,89
165 ± 10,8
7,20±0,16
53 ± 2,0
Примітка:* – вірогідні зміни, порівняно з контролем (Р?0,05)
Максимальне пригнічення процесів пероксидації та активацію систем
антиоксидантного захисту печінки та крові тварин відзначено через 3 дні
експерименту при введенні настоянки у дозі 1,0 мл /кг, а через 14 днів
її щоденного введення відбувалось повне відновлення вихідного стану
оксидантно-антиоксидантної рівноваги печінки щурів. Ця доза (1,0 мл /кг)
і була обрана нами для проведення подальших досліджень.
Вплив настоянки перстачу прямостоячого на показники білкового, ліпідного
та водно-електролітного обмінів в організмі білих щурів за умов норми.
Проведені дослідження показали, що щоденне пероральне введення НПП у
дозі 0,5 мл /кг маси впродовж усього терміну експерименту (21 день) не
викликало вірогідних змін вмісту гемоглобіну крові, загального кальцію,
хлорид-іонів, заліза, альбуміну, загального холестеролу, ?-ліпопротеїнів
та креатиніну в плазмі крові.
Настоянка неоднозначно впливає на вміст глюкози в плазмі крові (табл.
2), який зменшується на 15 % через 7 днів застосування НПП і вірогідно
не відрізняється від показників контролю при її подальшому введенні. Під
впливом настоянки у дозі 0,5 мл /кг (табл. 2) спостерігалося достовірне
зменшення вмісту сечової кислоти через 14 та 21 день, достовірне
збільшення вмісту церулоплазміну через 14 днів, підвищення вмісту
загального білку в плазмі крові через 14 та 21 день, збільшення вмісту
неорганічного фосфору, сечовини, загальних ліпідів та зменшення вмісту
триацилгліцеролів через 21 день.
Таблиця 2
Вплив настоянки перстачу прямостоячого у дозі 0,5мл /кг маси на
біохімічні показники плазми крові щурів за умов норми (М ± m; n= 7 – 12)
Умови досліду Контроль 7 днів 14 днів 21 день
Загальний білок, г/л 66,5 ± 2,5 66,7 ± 2,2 74,6 ± 1,1* 75,7 ± 2,4*
Сечовина, ммоль/л 6,55 ± 0,57 7,96 ± 0,63 6,88 ± 0,50 8,80±0,55*
Глюкоза, ммоль/л 7,33 ± 0,39 6,21± 0,26* 7,60 ± 0,46 7,47 ± 0,32
Триацилгліцероли, ммоль/л 0,76 ± 0,05 0,93 ± 0,07 0,68 ± 0,06 0,61
±0,03*
Ліпіди загальні, г/л 2,74 ± 0,25 2,53 ± 0,30 2,31 ± 0,21 3,49 ±0,19*
Церулоплазмін, мг/л 160± 8,4 175± 6,5 189 ±6,8* 157± 8,2
Сечова кислота, мкмоль/л 128 ± 5,6 136 ± 3,6 108 ± 4,1* 76 ± 3,8*
Неорганічний фосфор, ммоль/л 0,95 ± 0,05 0,84 ± 0,08 0,97 ± 0,06
1,11±0,04*
Примітка: * – вірогідність різниці порівняно з контролем ( P ? 0,05)
Застосування настоянки у дозі 1,0 мл /кг впродовж 7 днів (табл.3) не
викликало вірогідних змін вмісту загальних ліпідів, холестеролу,
?-ліпопротеїнів, глюкози та сечової кислоти в плазмі крові. Вміст
церулоплазміну (ЦП) та сечовини в плазмі крові при цьому збільшився на
19 % і 38 % відповідно порівняно з контролем. Оскільки підвищення вмісту
сечовини не супроводжується підвищенням вмісту креатиніну в плазмі
крові, то ці зміни, ймовірно, не є проявом порушення функції нирок.
Таблиця 3
Вплив настоянки перстачу прямостоячого у дозі 1,0 мл /кг маси тіла на
біохімічні показники плазми крові щурів за умов норми (М ± m; n= 7 – 12)
Умови досліду Контроль 7 днів 14 днів 21 день
Сечовина, ммоль/л 6,55 ±0,57 9,05 ±0,74* 7,27 ± 0,62 6,41 ± 0,55
Глюкоза, ммоль/л 7,33±0,39 6,75 ± 0,45 7,52 ± 0,37 5,99± 0,22*
Триацилгліцероли, ммоль/л 0,76±0,05 0,87±0,04 0,50±0,05* 0,55±0,05*
ХС, ммоль/л 2,25±0,15 2,38±0,18 2,13±0,15 1,73±0,13*
Ліпіди загальні, г/л 2,74±0,25 2,45±0,26 1,96 ±0,22* 3,36±0,11*
?-ліпопротеїни, г/л 1,20±0,13 1,35±0,17 0,70±0,10* 0,67±0,13*
Церулоплазмін, мг/л 160± 8,4 191± 5,9* 197± 7,4* 163 ± 7,0
Сечова кислота, мкмоль/л 128 ± 5,6 124 ± 4,2 85 ± 4,1 * 64 ± 3,1*
Неорганічний фосфор, ммоль/л 0,95±0,05 0,98±0,09 0,93±0,05 0,76±0,05*
Загальний кальцій, ммоль/л 2,35±0,08 2,29±0,08 2,14±0,12 1,92±0,05*
Хлориди, ммоль/л 96± 4,7 98 ± 3,8 93 ± 3,3 112 ± 4,9*
Гемоглобін, г/л 126 ± 3,4 132 ± 3,9 139 ± 3,2* 129 ± 2,6
Примітка: * – вірогідність різниці порівняно з контролем ( P ? 0,05)
Двотижневе введення настоянки призвело до зниження у плазмі крові
вмісту: загальних ліпідів – на 28%, триацилгліцеролів – на 34%, сечової
кислоти – на 34 %, ?-ліпопротеїнів – на 42 %, і підвищення вмісту:
загального білка – на 9,5 %, ЦП – на 23 % у плазмі крові та гемоглобіну
крові (на 10 %). При цьому вміст альбуміну, креатиніну та заліза в
плазмі крові істотно не змінювався впродовж всього експерименту. Відомо,
що знешкоджуючи супероксидні аніон-радикали, перетворюючи прооксидантне
двовалентне залізо на тривалентне, ЦП є ефективним антиоксидантом (В.Б.
Васильев, 1999; Т.А.Крайнова и др., 2003). Імовірно, антиоксидантний
ефект НПП за умов норми реалізується шляхом активації каталази та Г-S-Т
при нетривалому введенні (1-3 дні) та збільшуючи вміст ЦП та гемоглобіну
при її введенні впродовж 7 та 14 днів.
Впродовж усього терміну спостереження не відзначено вірогідних змін у
плазмі крові щодо активності ферментів, які є маркерами цитолізу
гепатоцитів (АЛТ, АСТ, ЛДГ), індикаторів холестазу (лужної фосфатази
(ЛФ) та ?-глутамілтрансферази), ?-амілази, а також (рис. 1) активностей
АЛТ, АСТ та ЛДГ у печінці щурів, що отримували НПП, порівняно з
аналогічними показниками тварин контрольної групи. Як відомо, вміст
триацилгліцеролів, холестеролу та ?-ліпопротеїнів плазми крові є
індикаторами холестазу (А.В. Шкурба, 1998). Зниження їх вмісту в плазмі
крові при введенні НПП впродовж 14 днів (табл.3) на фоні відсутності
змін активності ЛФ вказує на можливу холеретичну дію настоянки. Проте,
збільшення на 16 % активності ЛФ після 21-денного введення настоянки
свідчить про порушення окремих метаболічних процесів при її тривалому
введенні.
Рис. 1. Вплив настоянки перстачу прямостоячого на біохімічні показники
печінки щурів за умов норми, 1,0 мл /кг маси (М ± m; n= 7 – 12)
Групи тварин: І – контрольна (здорові тварини); ІІ – 7 днів введення
настоянки; ІІІ – 14 днів введення настоянки; ІV – 21 день введення
настоянки.
У печінці тварин (рис.1) через 7 днів введення настоянки спостерігалося
підвищення вмісту загального холестеролу (на 30 %) та глюкози (на 16 %).
При цьому холестерол плазми крові не змінювався (табл.3). Підвищення
вмісту холестеролу в печінці на 10 % через 14 днів без змін в плазмі
крові, можливо, пов’язане зі зниженням вмісту ?-ліпопротеїнів крові.
Комплексна оцінка показників білкового обміну дозволяє зробити висновок
про відсутність деструктивного впливу настоянки на гепатоцити.
При введенні НПП впродовж трьох тижнів у дозі 1,0 мл /кг маси (рис.1,
табл.3) відзначено зниження вмісту глюкози в печінці (на 12 %) та плазмі
крові (на 18 %); підвищення вмісту загальних ліпідів (на 23%); зниження
вмісту триацилгліцеролів (на 28%), ?-ліпопротеїнів (на 44%), сечової
кислоти (на 50 %) у плазмі крові порівняно з контролем. При цьому
холестерол знижується як у плазмі крові (на 23 %), так і у печінці (на
16 %). Зниження вмісту загального холестеролу та ?-ліпопротеїнів у
плазмі крові, може бути пов’язане з пригніченням їх синтезу в печінці
щурів (В.А. Куликов, А.А. Чиркин, 2004). Щодо показників мінерального
обміну (табл.3), то зміни останніх спостерігалися лише на 21-й день
введення настоянки: вміст хлорид-іонів підвищився на 17 %, а загального
кальцію та неорганічного фосфору – знизився відповідно на 18 % та 20 %
порівняно з контролем.
Таким чином, настоянка перстачу прямостоячого, при її застосуванні за
умов норми впродовж 7 та 14 днів у дозі 1,0 мл /кг маси, виявляла
антиоксидантну дію, не викликала цитолізу гепатоцитів та порушення
показників функціонального стану печінки тварин. Довготривале
застосування настоянки у цій же дозі (21 день) викликало зрушення
окремих метаболічних процесів в організмі тварин, проте цитотоксичної
дії не спостерігалося. Отже, досліджувана настоянка має низьку
гепатотоксичність.
?
e
e
Xnp?o2
6
^
l
|
?
3/4
a
i
–
8
:
?:
f
e
i
o4
6
?
ae
O
ssssssssssssssss?????????????&
O
O
O
$
O
O
O
O
O
???
???
O
O
{
{
O
{
{
O
{
{
O
{
{
O
O
O
O
O
O
O
???????рушується оксидантно-антиоксидантна рівновага (І.М. Кліщ та ін.,
2002; О.І. Кузів, 2003). Це пояснює необхідність пошуку
гепатопротекторів з антиоксидантною дією. Таким вимогам відповідає
перстач прямостоячий (Potentilla erecta L.), який багатий на біологічно
активні речовини з антиоксидантними властивостями (И.В. Большакова и
др., 1998; B. Vennat et al., 1994). Його цінні властивості
підтверджуються використанням в медичній практиці. Зокрема Ю.Н. Богатов
(Росія) та О.В. Глубоченко (м. Чернівці) рекомендують застосовувати
перстач прямостоячий у комплексному лікуванні виразкової хвороби та
гастродуоденіту, проте, даних щодо реалізації в організмі
антиоксидантного ефекту ліків на його основі немає.
У подальшому дослідили вплив настоянки перстачу прямостоячого (НПП) на
процеси ПОЛ та стан антиоксидантної системи на моделі експериментального
гепатиту.
Класичною модельною системою експериментального токсичного гепатиту є
ураження гепатоцитів, викликане чотирихлористим вуглецем (CCl4) (Ю.И.
Губский, 1989). Отруєння CCl4 викликає розвиток окиснювального стресу і
пригнічення Ca2+ , Mg2+-АТФазної активності (L.F.Barros et al., 2001).
Прооксидантний ефект вільнорадикальних похідних CCl4, які ініціюють
ланцюг ліпопероксидації в мембранних структурах гепатоцитів, є одним із
основних факторів їх руйнації (С.Н. Силуянова и др., 2002; M. Boll,
2001). Результати проведеного експерименту показали (рис.2), що через 7
днів після отруєння CCl4 у крові спостерігається значне зростання вмісту
продуктів ПОЛ порівняно з контролем (здорові тварини): вмісту МДА – на
73%, сполук з ізольованими подвійними зв’язками (ІПЗ) – на 22 %,
дієнових кон’югатів (ДК) – на 31 %, кетодієнів та спряжених триєнів (КД
та СТ) – на 17 %, що корелює зі збільшенням у плазмі крові вмісту ОМБ –
на 33%, та МСМ – на 71 %, які, як відомо (І.М. Кліщ та ін., 2002), є
маркерами ендогенної інтоксикації організму.
Рис.2. Вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів,
окисно-модифікованих білків та молекул середньої маси у крові щурів за
умов експериментального гепатиту та дії настоянки перстачу прямостоячого
у дозі 1,0 мл /кг маси (М ± m; n = 10 – 16)
Групи тварин: І – контрольна (здорові щури); ІІ – через 7 днів після
отруєння CCl4; ІІІ – 7 днів введення настоянки на фоні отруєння CCl4; ІV
– через 14 днів після отруєння CCl4;
V – 14 днів введення настоянки на фоні отруєння CCl4.
У гомогенатах печінки інтоксикованих CCl4 щурів через 7 днів, аналогічно
з показниками крові, має місце посилення процесів ліпопероксидації:
підвищення вмісту МДА – на 80 %; ІПЗ – на 32 %, та ДК – на 37 %
порівняно з контролем.
Ці зміни супроводжувалися (табл. 4) активацією антиоксидантного захисту
у печінці інтоксикованих щурів порівняно з показниками контролю. Так,
через 7 днів вміст Г-SН підвищився на 28 %, що, ймовірно, пов’язано із
активацією на 17 % ГР, поряд із підвищенням на 14 % активності Г-6-ФДГ,
яка постачає НАДФН для роботи ГР. Зростання активності ГП на 36 % на
фоні зниження активності каталази на 26 %, вказує на посилене
використання Г-SН для відновлення Н2О2 та ліпопероксидів в печінці.
Проведене дослідження в крові інтоксикованих тварин продемонструвало
односпря-мовану картину змін (табл.5): через 7 днів знизилась на 17 %
активність каталази; були підвищеними вміст Г-SH (на 21%) і активності
ферментів його обміну: ГР, Г-6-ФДГ на 12% та 13% відповідно, у
порівнянні з показниками контролю. Компенсаторне підвищення вмісту Г-SH
у крові супроводжувалося зниженням на 28% активності Г-S-Т у печінці.
Через 14 днів після інтоксикації ССl4 у печінці спонтанно одужуючих
тварин відзначено зменшення інтенсивності процесів вільнорадикального
окиснення ліпідів, проте, вміст продуктів ПОЛ залишався підвищеним: МДА
– на 23 %, ІПЗ – на 21 %, ДК – на 20 % ніж у контрольних тварин.
Активність Г-S-Т та каталази у печінці підвищилась (табл.4), але
залишилась на 22 % та 12 % відповідно нижчою, ніж у контролі.
Таблиця 4
Вплив настоянки перстачу прямостоячого (1,0 мл /кг маси) на
антиоксидантний стан
печінки щурів за умов експериментального гепатиту (М ± m; n = 8 – 12)
Група
Показник
Контроль 7 днів
14 днів
ССl4
ССl4+НПП
ССl4
ССl4+НПП
Каталаза (мкмоль/
хв • мг білка) 172?12,4 127?6,8* 150?5,9 151?5,8 159?7,9
Г-6-ФДГ (нмоль НАДФН/
хв • мг білка) 7,7?0,3 8,8?0,4* 7,4 ? 0,3 7,9 ? 0,3 7,8 ? 0,3
ГР (нмольНАДФН/
хв • мг білка) 3,4?0,2 4,0?0,1* 3,7?0,2 3,9?0,3 3,6?0,2
Г-SH (мкмоль/ г тканини) 7,2 ?0,1 9,2?0,3* 8,4?0,2* 8,3?0,2* 7,3?0,2
ГП (нмоль ГSSГ/
хв • мг білка) 186?18 254?20* 195?13 279?15* 191?14
Г-S-Т (нмоль/
хв•мг білка) 53,7?1,5 38,8?3,3* 52,2?2,1 42,1?0,9* 54,8?1,5
Примітка: * вірогідні зміни , порівняно з контролем (P ? 0,05)
Вміст Г-SН та активність ГП і ГР у печінці були вищими відповідно на 15
%, 50% та 14,7 % від показників контрольної групи. У крові спонтанно
одужуючих тварин через 14 днів спостерігались аналогічні зміни (рис.2):
вміст МДА залишався вищим на 42 %, ІПЗ – на 15 %; ДК – на 15 % ніж у
тварин контрольної групи. У плазмі крові зберігався підвищеним вміст ОМБ
та МСМ – на 20 % і 37 %. Зміни, які спостерігались в печінці та крові
тварин із експериментальним гепатитом, можна розцінювати як
недостатність компенсаторних механізмів антиоксидантного захисту.
Під впливом НПП в дозі 1,0 мл /кг маси на фоні отруєння СС14 впродовж 7
днів намічається чітка тенденція до нормалізації показників ПОЛ у
печінці щурів: вміст МДА був на 8 %, ІПЗ – на 15 %, ДК – на 16 % нижчим,
ніж у спонтанно одужуючих тварин, проте залишались вірогідно вищими від
показників контролю. При цьому, вміст Г-SН у гомогенатах печінки був на
9 % нижчим, активність каталази була на 18 % вищою, ніж у спонтанно
одужуючих тварин (табл.4); активності Г-S-Т, Г-6-ФДГ, ГР та ГП
достовірно не відрізнялись від контролю. Зниження вмісту Г-SН у печінці,
імовірно, пов’язано з посиленим використанням його печінковою Г-S-Т,
активність якої зростала на 34 % під впливом настоянки. Дослідження
показників крові тварин з експериментальним гепатитом на фоні
семиденного введення НПП виявили подібні зміни, які в цілому відповідали
таким при дослідженні гомогенату печінки: вміст продуктів ПОЛ, а також
МСМ і ОМБ (рис.2) були нижчими, ніж у спонтанно одужуючих тварин, проте
вищими від контролю. Показники антиоксидантної системи крові достовірно
не відрізнялися від контролю.
Поряд із нормалізацією вмісту відновленого глутатіону та активності
ферментів глутатіонової ланки антиоксидантного захисту, 14-денне
введення НПП тваринам з експериментальним гепатитом сприяло повній
нормалізації швидкості вільнорадикальних процесів в печінці та крові
щурів, що оцінювали за вмістом продуктів ПОЛ.
Таблиця 5
Стан антиоксидантної системи крові щурів за умов експериментального
гепатиту та дії настоянки перстачу прямостоячого, 1,0 мл /кг маси (НПП)
(М ± m; n = 8 – 10)
Група
Показник Каталаза,
мкмоль/
хв •гНb Г-6-ФДГ, мкмоль НАДФН/
хв • гНb ГР, мкмоль НАДФН/
хв • гНb Г-SH, мкмоль/мл крові ГП, мкмоль ГSSГ/хв • мл крові
Контроль 146,0 ± 6,7 6,08 ± 0,11 2,92 ± 0,08 1,08 ± 0,02 20,7 ± 0,4
3 доби CCl4
115,0 ± 4,3*
7,02 ± 0,17*
3,31 ± 0,11*
1,35 ± 0,08*
18,5 ± 0,2*
CCl4 +НПП
124,0 ± 6,0*
6,53 ± 0,20
3,22 ± 0,12
1,24 ± 0,07*
18,8 ± 0,2*
7 діб CCl4
121,0 ± 8,3*
6,88 ± 0,16*
3,27 ± 0,06*
1,31 ± 0,04*
19,2 ± 0,5
CCl4 +НПП
135,0 ± 7,8
6,36 ± 0,15
3,08 ± 0,09
1,14 ± 0,02
20,5 ± 1,1
14 діб CCl4
139,0 ± 6,3
6,32 ± 0,12
3,22 ± 0,11
1,06 ± 0,03
20,6 ± 0,5
CCl4 +НПП
150,0 ± 6,4
6,16 ± 0,12
2,98 ± 0,05
1,12 ± 0,03
21,4 ± 0,6
Примітка: * – зміни достовірні порівняно з контролем (P ? 0,05)
Отже, інтоксикація тварин СCl4 призводила до порушення структури і
функцій клітинних мембран гепатоцитів, нагромадження у тканинах
молекулярних продуктів ПОЛ та викликала глибокі зміни у функціонуванні
антиоксидантної системи печінки. На фоні курсового введення настоянки
перстачу прямостоячого (1,0 мл /кг) спостерігалося відновлення
оксидантно-антиоксидантної рівноваги в печінці та крові щурів.
Вплив настоянки перстачу прямостоячого на функціональний стан печінки
щурів за умов токсичного гепатиту. Модель експериментального гепатиту
супроводжувалась суттєвими порушеннями біохімічних показників
функціонального стану печінки. Підвищення на 61 % активності ГГТ
(рис.3), поряд з підвищенням на 50 % вмісту загального білірубіну у
плазмі крові та зниженням на 13 % активності 5?-нуклеотидази у печінці
(рис.4), є ознакою дезорганізації плазматичних мембран гепатоцитів.
Зниження на 32 % в гомогенаті печінки активності глюкозо-6-фосфатази
(Гл-6-Ф), яка каталізує звільнення вільної глюкози, та зростання
активності Г-6-ФДГ – ферменту пентозофосфатного шляху окиснення
вуглеводів, призвело до зниження вмісту глюкози у плазмі крові на 26%
(рис.3). При цьому у гомогенатах печінки активність аргінази –
термінального ферменту орнітинового циклу, знижувалася на 19 % (рис.4),
внаслідок чого вміст сечовини у плазмі крові щурів знизився на 30 %
порівняно з контролем.
Враховуючи, що у дорослих щурів у плазмі крові виявляється ЛФ переважно
печінкового походження, то зростання активності ЛФ через 7 днів післядії
CCl4, поряд із підвищенням активності амінотрансфераз (АЛТ та АСТ),
Г-S-Т та ЛДГ у плазмі крові (рис.3, табл.6), дозволяє з достатнім
ступенем вірогідності скласти уявлення про важкість ураження печінки.
Коефіцієнт Де Ритіса – (відношення АСТ/АЛТ), який в нормі складав 1,13 ±
0,05, за умов інтоксикації CCl4 значно знижувався (до 0,70 ± 0,03), що
свідчило про глибоку деструкцію мембран субклітинних органел
гепатоцитів.
Рис.3. Вплив настоянки перстачу прямостоячого (1,0 мл /кг маси) на вміст
гемоглобіну в крові, вміст глюкози, церулоплазміну та активність
глутатіон-S-трансферази, лактатдегідрогенази та ?-глутамілтрансферази у
плазмі крові щурів за умов експериментального гепатиту (М ± m; n = 8
–10)
Рис.4. Вплив настоянки перстачу прямостоячого (1,0 мл /кг маси) на
біохімічні показники печінки щурів за умов експериментального гепатиту
(М ± m; n = 8 –10)
Групи тварин: І – контрольна (здорові щури); ІІ – через 7 днів після
отруєння CCl4; ІІІ – 7 днів введення настоянки на фоні отруєння CCl4; ІV
– через 14 днів після отруєння CCl4; V – 14 днів введення настоянки на
фоні отруєння CCl4.
На 7-ий день післядії CCl4 (табл.6) вміст загального білку плазми крові
знизився на 21%, альбуміну – на 10 %, ХС – на 19 %, вміст загальних
ліпідів плазми крові виріс на 34,5%, ?-ліпопротеїнів – на 23 % порівняно
з показниками контролю. Відомо (Л.Л. Громашевская, 1996), що
гіпоальбумінемія, гіпохолестеринемія, зниження утворення сечовини та
креатиніну при підгострому враженні печінки відображають зниження
синтетичних процесів в гепатоцитах. Збільшення вмісту ?-ліпопротеїнів у
плазмі крові, можливо, виникає внаслідок порушення рецепторної взаємодії
ліпопротеїнів з гепатоцитами (В.Н. Титов, 2000). Через 7 днів післядії
CCl4 (рис. 4) вміст загального білка в гомогенаті тканини печінки
знизився на 23 % та підвищився вміст загальних ліпідів на 73 % і
холестеролу – на 11 % порівняно з показниками контрольної групи. Отже,
отруєння CCl4 веде до порушення ліпідного статусу печінки.
Таблиця 6
Вплив настоянки перстачу прямостоячого (1,0 мл НПП /кг маси) на
біохімічні показники плазми крові щурів за умов експериментального
гепатиту (М ± m; n = 8 – 10)
Група
Показник
Контроль 7 днів
14 днів
ССl4
ССl4+НПП
ССl4
ССl4+ НПП
Загальний білок, г/л 69,9 ±2,2 55,3 ± 1,8* 61,3 ± 3,5 64,6 ± 1,6 72,7±
2,8
Альбумін, г/л 40,9 ± 1,1 36,7 ± 1,4* 41,5 ± 2,0 38,3 ± 0,9 42,2 ± 1,4
Сечовина, ммоль/л 6,3 ± 0,3 4,4 ± 0,2* 4,9± 0,6* 5,7 ± 0,6 6,8 ± 0,4
Загальний білірубін, мкмоль/л 10,6±0,6 21,2±1,9* 15,3±1,8* 14,0±0,6*
12,6±0,9
ХС, ммоль/л 2,12 ± 0,09 1,72±0,12* 1,80±0,10* 1,96 ± 0,21 2,06 ± 0,18
Ліпіди загальні, г/л 2,9 ± 0,22 3,9 ± 0,24* 3,7 ± 0,20* 3,2 ± 0,25 3,0 ±
0,17
? – ліпопротеїни, г/л 1,1 ± 0,11 1,35 ± 0,15 1,19± 0,09 1,68±0,21* 1,30
± 0,18
ЛФ, нмоль/(с·л) 404± 24 768 ± 70* 553 ±47* 364 ± 21 411 ± 64
АСТ, нмоль /c · л 364±17 612±31* 392±30 324±18 386±17
АЛТ, нмоль /c · л 321±22 872±85* 470±53* 284±19 353±39
Коефіцієнт Де Ритіса
(АСТ/АЛТ) 1,13 ± 0,05 0,70±0,03* 0,83 ± 0,07 1,14± 0,04 1,09 ± 0,06
Примітка: * – вірогідність різниці порівняно з контролем ( P ? 0,05)
При отруєнні тварин СС14 спостерігалися суттєві порушення функціонування
систем АОЗ, зокрема виявили значне підвищення вмісту ЦП в плазмі крові
продовж усього експерименту (на 43 % через 7 діб та 19 % – через 14 діб)
незважаючи на те, що він повністю синтезується мембранозв’язаними
рибосомами ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів. Можна припустити,
що підвищення активності ЦП є наслідком посиленої адаптивної активації
його синтезу в печінці, спрямованого на збільшення загального фонду
антиоксидантів, або зміною його катаболізму.
Введення НПП впродовж 7 днів на фоні післядії CCl4 попереджувало цитоліз
гепатоцитів (рис.3, табл.6) : активності АЛТ, АСТ, Г-S-Т та ЛДГ плазми
крові були відповідно на 46 %, 36%, 18 % та 25 % нижчими, ніж у
спонтанно одужуючих тварин. Спостерігалася позитивна динаміка синдрому
холестазу, про що свідчило (рис.3, табл.6) зниження активності ГГТ на
18%, ЛФ – на 28 % порівняно з показниками спонтанно одужуючих тварин.
Вміст загальних ліпідів у печінці був на 15 % нижчим порівняно з
нелікованими тваринами.
На 14-ий день спостереження у токсично пошкодженій печінці
спостерігаються процеси адаптивної саморепарації тканин. Проте, вони є
недостатніми, про що свідчить підвищений вміст загального білірубіну та
?-ліпопротеїнів відповідно на 32 % та 53 %; підвищена на 26 % активність
ЛДГ плазми крові; знижений на 22 % вміст гемоглобіну крові порівняно з
контролем. У плазмі крові тварин, які на фоні отруєння CCl4 отримували
НПП у дозі 1,0 мл /кг впродовж 14 днів, досліджувані показники не
відрізнялися від таких у тварин контрольної групи. Очевидно, що її
застосування за умов гепатиту значно пришвидшує відновні процеси.
Отже, за умов експериментального токсичного гепатиту настоянка перстачу
прямостоячого у підібраній нами дозі виявляла виражену антиоксидантну та
гепатозахисну дію і відновлювала порушений функціональний стан печінки
за рахунок наступних механізмів:
гальмування процесів вільнорадикального окиснення біомолекул шляхом
зменшення в тканинах утворення активних форм кисню, що обумовлене
антирадикальними властивостями фенольних сполук та дубильних речовин у
складі настоянки;
активації каталази та відновлювального циклу глутатіону в крові та
печінці щурів.
Введення настоянки перстачу прямостоячого на фоні інтоксикації
чотирихлористим вуглецем призводить до швидкої нормалізації метаболічних
процесів у печінці щурів – настоянка має виражені антиоксидантні та
гепатопротекторні властивості.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення
наукового завдання, яке полягало у дослідженні біохімічних механізмів
дії настоянки з кореневища перстачу прямостоячого, та можливості
корекції цією настоянкою порушень функціонального стану печінки щурів за
умов експериментального моделювання хімічного ураження клітин
чотирихлористим вуглецем.
1. Проведений in vitro скринінг антиоксидантної активності настоянки
перстачу прямостоячого (1:5 на 40% етиловому спирті) встановив, що
настоянка гальмує індуковане пероксидне окиснення ендогенних ліпідів
печінки інтактних тварин при додаванні її в інкубаційне середовище в
розведенні 10 –4 – 10 –5.
2. In vivo за умов норми антиоксидантний ефект настоянки проявляється у
дозах 0,5мл, 1мл, 2 мл на 1 кг маси щура, що обумовлене, в першу чергу,
активацією антиоксидантних ферментів – каталази та
глутатіон-S-трансферази. Максимальне пригнічення процесів пероксидації
та активація систем антиоксидантного захисту печінки та крові щурів
відзначено через 3 дні експерименту при введенні настоянки у дозі 1,0 мл
/кг маси. В умовах in vitro та in vivo за умов норми встановлено
діапазон лікувальної дії спиртової настоянки перстачу прямостоячого і
розраховано орієнтовно профілактичну та лікувальну дози. При цьому, доза
1,0 мл /кг маси тварин була обрана для подальших досліджень.
3. Настоянка перстачу прямостоячого при її застосуванні in vivo за умов
норми впродовж 7 та 14 днів у дозі 1,0 мл /кг маси, виявляла
антиоксидантну дію, не викликала цитолізу гепатоцитів та порушення
функціонального стану печінки щурів. Зокрема, двотижневе введення
настоянки призвело до зниження у плазмі крові вмісту загальних ліпідів,
триацилгліцеролів, ?-ліпопротеїнів, сечової кислоти, та підвищення
вмісту загального білка і церулоплазміну. За цих умов у печінці тварин
через 7 днів введення настоянки спостерігалось підвищення вмісту
холестеролу та глюкози. Довготривале введення настоянки за умов норми
(впродовж 21 дня) викликало порушення окремих метаболічних процесів в
організмі тварин, проте не виявляло цитотоксичної дії. Зокрема, знизився
вміст глюкози в печінці та плазмі крові; вміст загальних ліпідів у
печінці щурів знизився, а у плазмі крові підвищився; знижувався вміст
?-ліпопротеїнів, триацилгліцеролів, загального холестеролу у плазмі
крові щурів.
4. Модель експериментального токсичного гепатиту супроводжується
суттєвим зростанням процесів вільнорадикального окиснення біомолекул і
порушенням функціонального стану печінки. Це проявляється накопиченням у
тканинах продуктів пероксидного окиснення ліпідів та біополімерів. У
печінці зростала активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази та знижувалась
активність глюкозо-6-фосфатази і 5?-нуклеотидази. При цьому у плазмі
крові щурів підвищується активність амінотрансфераз,
лактатдегідрогенази, глутатіон-S-трансферази, лужної фосфатази,
?-глутамілтрансферази, підвищується вміст загального білірубіну та
загальних ліпідів, а вміст загального білка і глюкози знижується.
Відбуваються суттєві зміни функціонування антиоксидантної системи крові
та печінки щурів.
5. Введення настоянки перстачу прямостоячого за умов експериментального
токсичного гепатиту у дозі 1,0 мл /кг маси тіла впродовж 7 днів
нормалізувало активність глутатіонової ланки антиоксидантного захисту
печінки та крові щурів, а впродовж 14діб – сприяло нормалізації
інтенсивності вільнорадикальних процесів та показників функціонального
стану печінки щурів.
6. Основними напрямками механізму гепатопротекторної дії настоянки
перстачу прямостоячого є: гальмування процесів вільнорадикального
окиснення ліпідів та біополімерів за рахунок зменшення в тканинах
продукування активних форм кисню; активація ферментів антиоксидантного
захисту печінки та крові щурів.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Тефтюєва Н.Б. Перекисне окиснення ліпідів печінки щурів за умов
токсичного гепатиту та дії настоянки перстачу прямостоячого// Одеський
мед.журнал.-2001.-№6(68). – С.23 – 25.
2. Тефтюєва Н.Б. Вплив настойки перстачу прямостоячого на показники
білкового та ліпідного обміну крові щурів // Вісник проблем біол. і мед.
– 2004. – Вип.2. – С. 65-70.
3. Тефтюєва Н.Б. Вплив настойки перстачу прямостоячого на біохімічні
показники функціонального стану печінки щурів // Одеський мед.журнал. –
2004. – №6(86). – С. 16-18.
4. Тефтюєва Н.Б. Дія настоянки перстачу прямостоячого на деякі
біохімічні показники крові щурів // Експериментальна і клінічна
медицина. – 2005. – №1. – С. 28-31.
5. Тефтюєва Н.Б., Григор’єва Н.П. Антиоксидантні властивості настоянки
перстача прямостоячого // Експерим. та клінічна фізіол. і
біохімія.-2001.-Т.13, №1. – С.27 – 28.
6. Тефтюєва Н.Б., Григор’єва Н. П. Вплив настоянки перстачу
прямостоячого на деякі показники оксидантного та антиоксидантного стану
печінки щурів // Буковинський мед. вісник. – 2001. – Т.5, №2. – С.193 –
196.
7. Тефтюєва Н.Б., Мещишен І.Ф. Перекисне окиснення ліпідів та стан
антиоксидантної системи крові щурів за умов токсичного гепатиту та дії
настоянки перстачу прямостоячого // Мед. хімія. – 2003. – Т.5, №4. – С.
75 – 79.
8. Тефтюєва Н.Б., Мещишен І.Ф. Вплив настойки перстачу прямостоячого на
біохімічні показники метаболізму печінки щурів за умов
тетрахлорметанового гепатиту // Фармацевтичний журнал. – 2004. – №6. –
С. 90 – 94.
9. Тефтюєва Н.Б., Яремій І.М., Григор’єва Н.П. Вплив настоянки перстачу
прямостоячого на глутатіонову систему печінки щурів за умов токсичного
гепатиту // Мед. хімія. – 2001.-Т.3, №4.- С.52 – 55.
10. Тефтюєва Н.Б., Григор’єва Н.П., Волошин О.І. Перстач прямостоячий як
лікарська рослина // Фітотерапія в Україні. – 2000. – №2(10). – С. 30 –
33.
11. Тефтюєва Н.Б., Мещишен І.Ф. Фізико-хімічні властивості та біологічна
дія перстача прямостоячого // Оздоровчі ресурси Карпат і прилеглих
регіонів: Матер. конференції з міжнародною участю (Чернівці, 5 – 6
жовтня 1999 року). – Чернівці, 1999. – С.187 – 188.
12. Тефтюєва Н.Б. Вплив настоянки перстачу прямостоячого на показники
вуглеводного та ліпідного обміну крові та печінки щурів // Актуальні
питання клінічної та експериментальної медицини: Матеріали 85-ї
підсумкової наукової конференції, присвяченої 60-річчю БДМА. – Чернівці,
БДМА, 2004. – С. 338 – 340.
13. Тефтюєва Н.Б. Детоксикаційна дія перстачу прямостоячого // Х конґрес
СФУЛТ. Тези доповідей. – Чернівці – Київ – Чікаго. – 2004. – С.92.
14. Тефтюєва Н.Б. Дія настойки перстачу прямостоячого на вміст води в
органах та мінералів у крові щурів // Гігієна населених місць. Збірник /
Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України.
–Київ, 2004.- Вип.44.- С. 617 –621.
15. Мещишен І.Ф., Тефтюєва Н.Б., Яремій І.М. Застосування настойки
перстачу прямостоячого як антиоксидантного засобу. Деклараційний патент
на корисну модель / Бюл. №1, 17.01.2005, (11) 4655, (51) 7 А61К35/78.
16. Teftyuyeva N. Effect of Potentilla Tormentilla spirituous tincture
on lipoperoxidation of rats’ blood // Annales Universitatis Mariae
Curie-Sk?odowska, Lublin-Polonia, sectio DDD, Pharmacia. – 2004. – Vol.
XVII, N 2. – P.189-191.
АНОТАЦІЯ
Тефтюєва Н.Б. Вплив настоянки перстачу прямостоячого на функціональний
стан печінки за умов норми та експериментального гепатиту. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за
спеціальністю 14.01.32 – медична біохімія – Національний медичний
університет ім. О.О. Богомольця, Київ, 2005р.
Дисертація присвячена визначенню біохімічних механізмів дії настоянки
перстачу прямостоя-чого, що може реалізувати антиоксидантний захист за
умов експериментальної патології печінки.
В експериментах in vitro встановлено, що настоянка перстачу
прямостоячого викликає пригнічення швидкості процесів вільнорадикального
окиснення ліпідів печінки щурів. Встановлено антиоксидантний ефект
настоянки in vivo за умов норми, який найбільш повно проявляється за
умов її внутрішлункового введення в дозі 1,0 мл /кг маси тіла впрдовж 3
діб.
В експериментах на білих щурах-самцях за умов норми дослідили вплив
настоянки перстачу прямостоячого на метаболічні процеси в печінці,
показники обміну білків, ліпідів та вуглеводів у плазмі крові, залежно
від дози та тривалості її застосування. Введення настоянки впродовж 7 та
14 днів в дозі 1,0 мл /кг виявляє антиоксидантну дію, не викликає
порушень функціонального стану печінки. Тривале її застосування (21
день) викликало зрушення окремих обмінних процесів, але не виявляло
цитотоксичної дії.
Вперше експериментально доведено можливість корекції настоянкою перстачу
прямостоячого порушень оксидантно-антиоксидантної рівноваги та
функціонального стану печінки на моделі токсичного гепатиту, викликаного
чотирихлористим вуглецем. Застосування настоянки у дозі 1,0 мл /кг
впродовж 7 днів викликає пригнічення процесів вільнорадикального
окиснення ліпідів та окиснювальної модифікації білків, нормалізує
активність глутатіонової ланки антиоксидантного захисту печінки та крові
щурів, а впродовж 14 діб – сприяє нормалізації інтенсивності
вільнорадикальних процесів та показників функціонального стану печінки
щурів, що передбачає розгляд цієї настоянки як потенційного
гепатопротектора.
Ключові слова: настоянка перстачу прямостоячого, функціональний стан
печінки, пероксидне окиснення ліпідів, антиоксидантна система, токсичний
гепатит.
АННОТАЦИЯ
Тефтюева Н.Б. Влияние настойки лапчатки прямостоящей на функциональное
состояние печени в условиях нормы и экспериментального гепатита. –
Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по
специальности 14.01.32 – медицинская биохимия – Национальный медицинский
университет им. А.А. Богомольця, Киев, 2005г.
Диссертация посвящена выяснению биохимических механизмов действия
настойки кореневища лапчатки прямостоящей, которая может осуществить
антиоксидантную защиту в условиях экспериментальной патологи печени.
Проведенный in vitro скрининг антиоксидантной активности настойки
установил, что последняя ингибирует индуцированное перекисное окисление
эндогенных липидов при ее добавлении в инкубационную среду в разведении
10–4 – 10–5. Полученные результаты использовались при подборе диапазона
исследуемых доз настойки in vivo в условиях нормы.
В опытах на белых крысах – самцах в условиях нормы исследовано влияние
настойки лапчатки прямостоящей в зависимости от дозы и длительности
введения на метаболические процессы в печени (на показатели обмена
белков, липидов и углеводов, содержание электролитов в плазме крови).
Установлено, что настойка проявляет антиоксидантное действие, наиболее
выраженное при ее введении на протяжении 3 дней в дозе 1,0 мл /кг массы
тела. Использование настойки на протяжении 7 и 14 дней в дозе 0,5 мл и
1,0 мл /кг проявляет антиоксидантное действие, не вызывает цитолиза
гепатоцитов и нарушений функционального состояния печени. Так введение
настойки на протяжении 14 дней в дозе 1,0 мл /кг вызвало достоверное
уменьшение в плазме крови содержания общих липидов (на 28 %),
триглицеридов (на 34 %), ?-липопротеинов (на 42 %), мочевой кислоты (на
34 %), и увеличение содержания белка (на 10 %), гемоглобина (на 10 %), и
церулоплазмина (на 23 %). В ткани печени крыс после 7 дней введения
настойки в этой же дозе наблюдалось повышение содержания холестерина (на
30 %) и глюкозы (на 16 %). Длительное использование настойки лапчатки
прямостоящей (на протяжении 21 дня) вызывает изменения отдельных
метаболических процессов, но не проявляет цитотоксического действия.
Впервые экспериментально доказано корригирующее влияние настойки
лапчатки прямостоящей на метаболические процессы в печени крыс при
экспериментальном гепатите, моделирование которого сопровождается
дисбалансом оксидантно-антиоксидантного равновесия и нарушением
функционального состояния печени, что проявлялось накоплением в крови и
печени крыс продуктов перекисного окисления липидов, окислительно
модифицированных белков, дисбалансом активности ферментов
антиоксидантной защиты. Использование настойки лапчатки прямостоящей в
дозе 1,0 мл /кг при экспериментальном гепатите на протяжении 7 дней
способствует снижению интенсивности процессов липопероксидации,
окислительной модификации белков, нормализует активность антиоксидантной
защиты печени и крови крыс (содержание церулоплазмина, активность
глутатион-зависимых ферментов, каталазы) и значительно уменьшает
проявления синдрома цитолиза гепатоцитов, а на протяжении 14 дней –
нормализует показатели функционального состояния печени крыс и полностью
восстанавливает оксидантно-антиоксидантное равновесие в крови и печени
крыс. Это предусматривает использование настойки лапчатки прямостоящей
как потенциального антиоксидантного препарата с гепатопротекторным
действием.
Ключевые слова: настойка лапчатки прямостоящей, функциональное состояние
печени, перекисное окисление липидов, антиоксидантная система,
токсический гепатит.
ANNOTATION
Teftyuyeva N.B. The influence of Potentilla tormentilla L. tincture on
the liver’s functional state in case’s of norm and experimental
hepatitis. – Manuscript.
The thesis is for a scientific degree of the Сandidate of Medical
Sciences in the speciality 14.01.32 – Medical Biochemistry. – O.O.
Bogomolets National Medical University, Kiev, 2005.
The thesis is devoted to study of the biochemical parameters of the
liver’s functional state under condition of the Potentilla tormentilla
tincture; the state of both the lipids peroxidation and antioxidant
protection of the blood and the liver of the rats in case’s of
experimental toxic hepatitis and it’s correction by the Potentilla
tormentilla L. tincture.
In the in vitro experiments it was established that Potentilla
tormentilla tincture shows suppressed lipoperoxidation rates. The
antioxidative action of the tincture was proved in vivo under conditions
of physiological norms, which in full measure develop with intragastral
administration of the Potentilla tormentilla tincture in dose 1,0 ml /kg
of the body weight over a period of 3 days.
The effect of Potentilla tormentilla tincture on the intensity of the
metabolic processes of the liver and parameters of the protein and lipid
metabolism, concentration’s of electrolytes in the blood, depending on
the doseage and prolongation of the tincture using under normal
condition’s, was studied in a group of male rats. The introduction of
tincture during 7 days in a doseage 1,0 ml /kg did not exert an effect
on the parameters under study. Prolonged application of the tincture (21
days) caused derangements of some metabolic parameters, and did not
alter the activity of the enzyme-markers of cytolysis.
It was demonstrated that experimental toxic hepatitis leads to essential
disfunction of the metabolic state of the rats’ liver, and of the
oxidant- and antioxidant homeostasis (increase the processes of the
lipids peroxidation and changes of the functions of the antioxidant
system).
Experimental usage of the Potentilla tormentilla tincture normalizes the
molecular indexes of the free radical oxidating products and leads to
the antioxidant processes activation. This provides the possibility of
considering this tincture as potential antioxidant drug with
hepato-protective activity.
Key words: Potentilla tormentilla tincture, liver functional state,
lipid peroxidation, antioxidant system, experimental toxic hepatitis.
PAGE \* Arabic 25
16
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
