.

Фармако-біофізична характеристика катіонних каналів плазматичної мембрани міоцитів тонкого кишечнику, активованих мускариновими холінорецепторами (авт

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
86 2873
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ДРЕСВЯННІКОВ АНДРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 577.352.5:577.353

Фармако-біофізична характеристика катіонних каналів плазматичної
мембрани міоцитів тонкого кишечнику, активованих мускариновими
холінорецепторами

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук, професор

Шуба Михайло Федорович

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Зав. відділом
нервово-м’язової фізіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Лозова Наталія Олексіївна

старший науковий співробітник відділу фізико-хімічної біології клітинних
мембран

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

член.кор. НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексієвич

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

зав. відділом біохімії м’язів

Провідна установа: Кафедра біофізики Київського Національного
університету імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться “ 5 ” квітня 2005 р. о “14” годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради

Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за
адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця,
4.

Автореферат розісланий “ 3 ” березня 2005 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Дослідження механізмів впливу ацетилхоліну – головного збуджувального
нейротрансмітера парасимпатичної нервової системи, що викликає
скорочення гладенько-м’язових клітин (ГМК) шлунковокишкового тракту, є
однією з найактуальніших проблем фізіології та фармакології гладеньких
м’язів. Ефекти скорочення гладенької мускулатури, що обумовлені
підвищенням внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію тісно
пов’язані з деполяризацією гладеньком’язових клітин. Деполяризація
плазматичної мембрани міоцитів при дії ацетилхоліну, яка є необхідною
передумовою активації кальцієвих каналів L-типу, є наслідком активації
неселективної катіонної провідності. Активація неселективної катіонної
провідності при дії ацетилхоліну відбувається з участю низки
внутрішньоклітинних посередників, головну роль серед яких відіграють
гетеротримірні G-білки. Активація катіонних каналів мускаринових
холінорецепторів відіграє ключову роль в процесі спряження збудження
плазматичної мембрани та скорочення міоцитів. Важливу роль цього типу
провідності визнано в формуванні повільних хвиль деполяризації,
наявність яких є обов’язковою передумовою перистальтичних рухів
шлунково-кишкового тракту. Важливим є з’ясування механізмів активації
поодиноких катіонних каналів, які і формують неселективну катіонну
провідність.

В ході роботи було з’ясовано, що популяція неселективних катіонних
каналів, активованих мускариновими холінорецепторами, є гетерогенною та
складається що найменш з трьох підтипів катіонних каналів, кожен з яких
має відмінні кінетичні та амплітудні характеристики.

Актуальним було дослідження властивостей кожного з підтипів
неселективних катіонних каналів, з’ясування відносної ролі кожного з них
у формуванні інтегрального трансмембранного струму, а отже і в
деполяризації цілої клітини. Особлива увага в даній роботі була
присвячена дослідженню кінетико-амплітудних та фармако-кінетичних
властивостей катіонних каналів середньої провідності, популяція яких
грає головну роль в формуванні карбахолвикликаної деполяризації ГМК.
Запропонована, виходячи з аналізу експериментальних даних, кінетична
модель роботи поодинокого катіонного каналу адекватно описує його
поведінку в межах фізіологічних змін мембранного потенціалу в
симетричних цезійвмісних розчинах та пояснює особливості інтегрального
трансмембранного струму цілої клітини. Проведена робота по встановленню
селективності, потенціалзалежності, фармакологічного впливу блокаторів
на рівні поодиноких катіонних каналів (КК) мускаринових холінорецепторів
значно поглиблює сучасні уявлення щодо молекулярних механізмів передачі
внутрішньоклітинних сигналів та процесів, що лежать в основі активації
рецепторкерованих катіонних каналів плазматичної мембрани збудливих
клітин.

Мета і завдання дослідження.

Метою роботи було з’ясувати загальні механізми холінергічного збудження
ГМК тонкого кишечнику, а також дослідити властивості поодиноких
катіонних неселективних каналів, що лежать в основі цього процесу. Для
досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

Дослідити на рівні поодиноких каналів механізми та особливості генерації
карбахолін опосередкованого збудження ГМК.

Визначити кількість підтипів катіонних каналів, що активуються
мускариновими рецепторами в міоцитах кишечнику, та їх відносний внесок у
генерацію інтегрального струму.

Побудувати адекватну кінетичну модель роботи поодинокого КК.

Дослідити фармакологічні властивості КК.

Дослідити амплітудно-кінетичні характеристики КК середньої провідності
за умов, максимально наближених до фізіологічних.

Визначити фізіологічну роль спонтанної активації КК середньої
провідності.

Новизна отриманих результатів.

Всі експериментальні дані, представлені в роботі, отримані вперше.
Вперше було ідентифіковано підтипи катіонних каналів плазматичної
мембрани гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику, що формують
карбахолінактивований струм. Вперше з’ясовано, який з підтипів катіонних
каналів приймає основну роль в формуванні інтегрального
карбахолактивованого струму цілої клітини. Виявлено потенціалзалежність
вірогідності відкритого стану катіонного каналу середньої провідності,
що обумовлює спотворення форми вольт-амперної залежності інтегрального
струму в діапазоні негативних значень мембранного потенціалу. Вперше на
рівні поодинокого катіонного каналу показано механізм десенситизації
карбахолактивованого струму. Вперше на рівні поодиноких каналів
досліджений механізм блокуючої дії двовалентних катіонів. Вперше
виявлений ефект спонтанної активації катіонних каналів. Вперше на рівні
поодиноких катіонних каналів досліджений фармако-кінетичний вплив
квініну, лантану та SKF96365. Вперше проведено кінетичний аналіз роботи
катіонних каналів, активованих мускариновими холінорецепторами.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів.

Робота має в основному експериментальний характер, а отримані дані
мають як теоретичне, так і практичне значення, оскільки сприяють більш
глибокому розумінню процесів активації, функціонування і фізіологічної
ролі катіонних каналів, активованих мускариновими холінорецепторами, а
також практичне значення, оскільки в роботі досліджено функціональні
зв’язки мускаринових холінорецепторів з підтипами катіонних каналів, що
може мати терапевтичне значення для нормалізації функції
шлунково-кишкового тракту. Очевидно, справді дієвим може виявитись
досліджений в роботі фармакологічний вплив блокаторів
карбахолінактивованих катіонних каналів. Виявлення ж явища спонтанної
активації каналів за умов відсутності агоністів мускаринових рецепторів
дозволяє більш глибоко зрозуміти причини, що лежать в основі тонічного
скорочення гладеньких м’язів.

Особистий внесок.

Всі експерименти описані в дисертаційній роботі, розробка методики та
виділення функціонально повноцінних міоцитів, обробка та узагальнення
експериментального матеріалу були виконані особисто автором. Аналіз
кінетики роботи карбахолін активованих катіонних каналів проводився
спільно з співавтором публікацій д.б.н Жолосом О.В.

В розробці концепції роботи та написанні висновків активну участь
приймали інші співавтори публікацій.

Апробація роботи.

Основні положення роботи доповідались та обговорювались на Міжнародних
конференціях:

British Pharmacological and Physiological Society Meeting (Manchester,
UK, 2003 )

48thAnnual Biophysical Society Meeting (Baltimore,Maryland, USA, 2004)

Pavlov Centenary Symposium Integrative Physiology &
Behavior(Сн.Петербург,Росія, 2004)

IBRO ADVANCED   SCHOOL OF NEUROSCIENCE “RECEPTORS, CHANNELS, MESSENGERS”
(Ялта, Україна, 2004)

Публікації. Матеріали роботи опубліковані в чотирьох наукових статтях та
двох тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації.

Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики
досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків, списку
використаних джерел із 148 найменувань та додатку. Робота викладена на
127 сторінках (без списку літератури та додатку), ілюстрована 45
рисунками та 1 таблицею.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єкт досліджень. В дослідах використовувались морські свинки
(guinea-pig) обох статей вагою 350-450 грамів. Поодинокі міоцити
повздовжнього шару середньої частини ileum отримували шляхом
ферментативно-механічної обробки невеличких шматочків тканини. Отримані
гладеньком’язові смужки поміщалися у модифікований розчин Кребса такого
складу (у ммоль/л): NaCl-120, KCl-6, CaCl2-2.5, MgCl2-1.2, D-глюкоза-12,
HEPES-10 рН-7.4, після чого вони розрізалися на фрагменти довжиною 2-3
мм і переносилися в номінально безкальцієвий розчин наступного складу (у
ммоль/л): NaCl-120, KCl-6, D-глюкоза-12, HEPES-10, рН-7,4. Ферментативна
обробка здійснювалася при 36оС в безкальцієвому розчині з концентрацією
ферментів колагенази col(1A)-1mg\ml , BSA -1mg\ml , інгібітор
трипсину-1mg\ml на протязі 22-26 хвилин. Після ферментативної обробки
ГМК виділялися шляхом піпетування фрагментів тканини в безкальцієвому
розчині. Ізольовані ГМК зберігалися при температурі +4о С протягом
усього експерименту.

Електрофізіологічні реєстрації. Для дослідження активності поодиноких
катіонних каналів був використаний метод фіксації потенціалу в
конфігурації outside-out та cell-attached. Експерименти по дослідженню
інтегрального струму проводились в конфігурації whole-cell. Іонні струми
реєструвалися за допомогою підсилювача фіксації потенціалу List EPC-5
(List Electronics, Germany), або Axopatch 200A (Axon Instruments, США).
Для генерації імпульсів напруги, а також для реєстрації іонних струмів
поодиноких катіонних каналів використовувалися АЦП-ЦАП DigiData1200 та
програма pClamp 6 (Axon Instruments, Inc., США). Отримані дані
фільтрувались за допомогою фільтра низьких частот з частотою зріза 1 кГц
та відцифровувались з частотою 5 кГц. Амплітуда струмів через катіонні
канали розраховувалася з точкових гістограм як відстань між піками
гаусіан. Аналіз кінетичних властивостей поодиноких катіонних каналів
проводився за допомогою програм pClamp і MicroCal Origin 5.0 (MicroCal
Software, США).

Розчини. Досліди проводилися переважно у симетричних цезієвих розчинах
такого складу. Зовнішній розчин містив (А) CsCl – 124, D-глюкоза-12,
HEPES-10, рН-7.4 (доводився за допомогою CsOH). Піпеточний розчин містив
(Б) CsCl –124, MgATФ-1, D-глюкоза-12, креатин-5, HEPES-10, BAPTA-10,
CaCl2-4.6, ±ГТФ-1, pH-7.4 (доводився з використанням CsOH).
Концентрація вільних іонів Са2+ складала 100 нМ. Активація катіонного
струму здійснювалася додаванням у зовнішній розчин карбахоліну
1-50(мкМ), або шляхом додавання до піпеточного розчину ГТФ?S у
концентрації 200?М.

В деяких експериментах, при вивченні ефектів різних моновалентних
катіонів та квазіфіологічних умов на поодинокі КК, проводилась
еквімолярна заміна зовнішнього катіону, та /або додавались двовалентні
катіони Ca2+ та Mg2+.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Підтипи карбахолінактивованих катіонних каналів (КК). При дослідженні
ізольованих фрагментів плазматичної мембрани ГМК тонкого кишечнику в
конфігурації outside-out нами було виявлено три типи катіонних каналів з
малою (10?2пСм; n=20), середньою (56?8пСм; n=27) та великою (135?14пСм;
n=3) провідностями (рис.1,а) .На рис.1в представлений фрагмент
реєстрації, на якому одночасно присутні всі три підтипи катіонних
каналів. Відсутність кратності рівнів провідності та суттєві розбіжності
в динаміко-кінетичних характеристиках струмів кожного з типів каналів
(рис.1а) виключають можливість наявності одного типу каналів з різними
підрівнями провідності. Вірогідність наявності активних катіонних
каналів в дослідженому фрагменті мембрани при активації mIcat
карбахоліном та утворення конфігурації outside-out була 51%. Канал з
провідністю 135 пСм спостерігався лише в 6% випадків і був вкрай
нестабільним. Кінетика його роботи характеризується коротким
відкриванням та закриванням з високою частотою із наступним раптовим
зниканням активності в перші ж хвилини після утворення конфігурації
outside-out. Така нестабільна поведінка активності каналу може бути
наслідком участі в процесах його активації/деактивації
внутрішньоклітинних компонент, які швидко вимиваються після утворення
конфігурації outside-out.

Рис. 1. Три типи катіонних каналів плазматичної мембрани міоцита,
активованих карбахоліном.

а- зверху вниз розташовані фрагменти реєстрації та амплітудні гістограми
каналів великої провідності (амплітуда 5.8рА при –40мВ) 135 ?14
пСм(n=3), середньої провідності (амплатуда2.15рА при –40мВ) 56?8
пСм(n=27) та малої провідності(амплатуда1рА при –100мВ) 10?2 пСм(n=20)
літерою с- позначений закритий стан катіонного каналу, літерою о-
позначений відкритий стан катіонного каналу.

б- співвідношення провідностей каналів різного типу з провідністю
130,53,10пСм .

в-фрагмент оригінального запису в якому одночасно присутні всі три типа
катіонних каналів

Активні канали малої провідності (10 пСм) були присутні в 40%
досліджених фрагментах плазматичної мембрани, які мали канальну
активність. Але беручи до уваги їх низьку провідність та малі значення
Ро =0.01-0.12 цих каналів інтегральний трансмембранний

струм, що переноситься через цей тип каналу складає лише 5% загального
трансмембранного струму. Виходячи з частоти детектування, щільності та
потенціалзалежних властивостей нами було запропоновано, що основну роль
у процесі формування мIcat при використанні симетричних цезієвих
розчинів та фіксованої на рівні 100 нМ концентрації внутрішньоклітинного
Са2+ відіграє канал із провідністю 50 пСм. Саме зміна кінетичних та
амплітудних характеристик даного типу каналу лежить в основі зміни
амплітуди інтегрального трансмембранного струму активованого
мускариновими агоністами .

Властивості КК середньої провідності. Нами було досліджено основні
параметри роботи поодинокого КК, а саме амплітудні характеристики та час
і потенціалзалежність вірогідності знаходження у відкритому стані (Ро).
Характерною рисою КК є значне потенціалзалежне збільшення часу
відкритого стану каналу (Ро) при гіперполяризації. Залежність Ро КК від
мембранного потенціалу описується рівнянням Больцмана з
V1/2=-71.17±3.2мВ та фактором крутизни k=8.1±2.3 мВ.

Потенціалзалежність струму поодинокого КК (рис.2б) також не є
лінійною, однак ця нелінійність не здатна пояснити U-подібну форму
вольт-амперної залежності інтегрального струму, хоча потенціал реверсії
як для інтегрального струму, так і для поодинокого КК, є однаковим
(близько 0 мВ).

Рис. 2. Потенціалзалежні властивості KK середньої провідності.

а- потенціалзалежність Ро KK середньої провідності з Pomax=0.6±0.03
Pomin =0.05±0.03, V1/2=-71.17±3.2мВ та k=8.1±2.3 мВ.

б- Вольт-амперна залежність амплітуди стуму через поодинокий KK з
потенціалом реверсії близько 0мВ.

в- Інтегральний стум через поодинокий KK ( г- вольт-амперна залежність
КХ-активованого струму цілої клітини )обидві мають характеру U-подібну
форму в області від’ємних потенціалів.

Розрахований нами інтегральний струм через поодинокий КК, який є
добутком вірогідності відкритого стану (Ро) на амплітуду струму
(рис.2в) пояснює природу U-подібної форми вольт-амперної залежності для
трансмембранного струму цілої клітини з її характерною інактивацією в
області від’ємних потенціалів та обумовлює зменшення провідності для
струму в ділянці, близькій до 0мВ (рис.2 г,в).

Дослідження динаміки ефекту часозалежної деактивації карбахолін
активованного струму в фрагментах плазматичної мембрани з 2-6
однотипними катіонними каналами середньої провідності дозволило
встановити, що з часом спостерігалась тенденція до зменшення
вірогідності відкритого стану n активних каналів (nРо), що є наслідком
зменшення числа активних каналів та відносної стабільності Ро для
поодинокого каналу (рис.3). Цей процес вочевидь обумовлює десенситизацію
карбахолінактивованого струму цілої клітини.

Наступним етапом наших досліджень був аналіз кінетики роботи поодиноких
КК середньої провідності. На рис.4 представлено оригінальний фрагмент
запису активності КК та гістограми розподілу відкритих та закритих
станів, що описувались сумою чотирьох моноекспоненційних функцій.
Побудова гістограм розподілу відкритих та закритих інтервалів з
подальшим їх описанням сумою експоненціальних функцій дає можливість
отримати відомості про воротні механізми роботи катіонного каналу
(рис.5). Кількість експоненціальних функцій, що здатні задовільно
описати амплітудну гістограму розподілу закритих (відкритих) інтервалів,
відповідає кількості відкритих та закритих станів катіонного каналу.
Постійні часу експоненціальних функцій (?) відповідають середньому часу
перебування каналу в кожному з станів. Побудова кінетичних моделей
роботи катіонного каналу дає уяву про кількість структурних конформацій
каналформуючого протеіна, і про відносну стабільність кожної з
конформацій в часі та в залежності від потенціалу на мембрані.

Рис. 3. Часозалежне зменшення кількості активних KK середньої
провідності в умовах їх активації 200мкМ ГТФ?S.

Чотири 2-секундні інтервали реєстрації активності KK на 1,7,14 та 21
хвилині після утворення конфігурації outside-out . З часом
спостерігається зменшення кількості активних KK при відносній
стабільності Ро на 1-3хвилині реєстрації=0.64, на 21хвилині= 0.56 .
Рис. 4. Аналіз кінетики роботи KK середньої провідності

а- фрагмент запису активності поодинокого KK середньої провідності,
тривалістю 354секунди. Літерами позначені с- закритий та о- відкритий
стани KK. підтриманий потенціал плазматичної мембрани –40мВ.

б ,в – гістограми розподілу закритих та відкритих інтервалів, що
описувався сумою щонайменш чотирьох моноекспоненційних функцій.

Рис.5. Кінетична модель роботи поодинокого KK середньої провідності з
приведеними усередненими значеннями постійних часу кінетичних станів, та
відносним внеском Ро в формування інтегрального струму.

Так для КК середньої провідності, активованого мускариновим
холінорецептором усереднені постійні часу для закритих станів складають
?О1,О2,О3,О4 = 0.66мс, 4.7мс, 58.7мс, 471мс та постійними часу відкритих
станів ?С1,С2,С3,С4 = 0.54мс, 5.4мс, 46.6мс, 190мс з відносним
відсотковим вкладом 1%, 3%, 24%, 73% -відповідно.

Вихід із довготривалого відкривання (середній час життя в якому
становить >150мсек) відбувається через короткотривалу подію закривання
(тривалістю Cs>K>Li>Na.(рис.9А). Умовно моновалентні катіони можна розділити на
дві групи перша Rb+,Cs+,K+, для яких характерний високий рівень
інтегральної провідності та друга група Li+,Na+ з низькими значеннями
інтегральної провідності. Модуляція інтегрального струму цілої клітини
при заміні зовнішнього моновалентного катіона відбувається за рахунок
змін Ро КК при стабільності струму поодинокого КК.

Рис. 10. Порівняльна характеристика блокуючого впливу SKF96365 на
властивості інтегрального мІкат та на поодинокі KK середньої
провідності.

а- позаклітинна аплікація 30мкм SKF96365 викликає повільний блокуючий
ефект на попередньо активований 200мкМ GTP?S мІкат .

б- фрагменти реєстрації активності поодиноких KK за відсутності (ліва
панель) та у присутності (права панель) 30мкм SKF96365. Зверху зображені
точкові амплітудні гістограмами активності KK.

в- гістограма зміни значень Ро при аплікації 30мкм SKF96365.

:`1/4

a

ph

0

2

?2

4

`

b

I

8:`Eo¶

?

?

ph

EHuy

@

@

OJPJQJ

@

AETAEVAErAEtAEcAE¤AE?AE?AEBCDCLCuoeiaioeuoeOeoeuoeOeoeuoeuoeuoeNoeC»C»C»
C«C«C«C«C»C»C»C?C«C«C«C«C™N’N

EH ph

@

$If–l ”U

@

@

B*ph

B*ph05 до 0.8-0.95 при зміні мембранного потенціалу в діапазоні від -40
до 120мВ. Така потенціалзалежна активація в зовнішніх рубідійвмісних
розчинах може спостерігатись навіть за умов відсутності агоністів
мускаринових рецепторів.

Фармакологічні властивості мІкат на рівні поодиноких катіонних каналів.

Рис.11. Порівняльна характеристика блокуючого впливу La3+(зліва) та
кініну (справа) на властивості інтегрального мІкат та на поодинокі KK
середньої провідності.

А-La3+ в концентрації 2мМ додаваємий до зовнішнього розчину спричиняє
блокування як інтегрального мІкат (1) викликаного 50мкМ КХ так і
блокування активності поодиноких KK (2).

Б- квінін в концентрації 20мкМ додаваємий до зовнішнього розчину
спричиняє блокування як інтегрального мІкат (1) викликаного 50мкМ КХ
так і блокування активності поодиноких KK (2).

Фармакологічні дослідження таких речовин як квінін та SKF96365, які
нині є одними з найефективніших блокаторів мІкат, досі проводилися в
конфігурації “ціла клітина”, що не дає змоги встановити механізм їх
блокуючої дії на поодинокий KK. Нами була проведена серія дослідів з
метою виявлення впливу раніше відомих блокаторів мІкат квініну та
SKF96365 на рівні поодиноких KK. Також нами було виявлено що раніше не
відомий в якості блокатора KK La3+, проявляє чітко виражений блокуючий
ефект у мілімолярній концентрації.

SKF96365 не спричиняє суттєвих змін в провідності поодинокого KK, 61пСм
без та 59пСм у присутності 30мкМ SKF96365, але зменшує Ро з 0.65 до
0.21. Блокуючий ефект квініну в концентрації 20мкМ та La3+ 2мМ на рівні
поодиноких KK викликаний значним зменшенням Ро каналів середньої
провідності .

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Підтипи карбахолінактивованих КК у ГМК ileum морської свинки. Детальні
дослідження властивостей поодиноких катіонних каналів плазматичної
мембрани тонкого кишечнику, що лежать в основі карбахолінактивованої
деполяризації міоцитів та їх порівняння з властивостями інтегральних
струмів цілої клітини, активованих як КХ, так і ГТФ?S дозволили
встановити гетерогенність популяції KK. В конфігурації outside-out в
ізольованому мембранному фрагменті, під впливом КХ можна було виявити
три типи катіонних каналів з малою 10?2пСм, середньою 56?8пСм та великою
135?14пСм провідностями.

Всі три вище зазначенні типи KK суттєво відрізнялись як за амплітудою
струму, так і за своїми кінетичними властивостями. Так канали великої
провідності мали тенденцію до швидкої деактивації в перші 90 секунд
після утворення конфігурації outside-out. Ефект швидкої деактивації не
усувався в випадку активації цього типу KK за допомогою ГТФ?S, який при
додаванні у внутрішньопіпетковий розчин здатен незворотньо активувати
G-білки, що приймають важливу роль в передачі сигналу від М2 підтипу
мускаринового рецептора до KK. Таким чином, можна припустити, що в
активації цього типу KK важливу роль відіграє певний водорозчинний
вторинний месенджер, який активно вимивається при утворенні конфігурації
outside-out. Беручи до уваги малу ймовірність детектування KK великої
провідності, нашу подальшу увагу ми сконцентрували на дослідженні двох
інших підтипів KK в конфігурації outside-out .

Канали малої та середньої провідності стабільно реєструвались в
конфігурації outside-out протягом більш ніж 20 хвилин. Це суттєво
відрізняє їх від каналів великої провідності та дозволяє більш детально
дослідити їх кінетико-амплітудні властивості. Іншим цікавим фактом є те,
що після утворення конфігурації outside-out в дослідженому фрагменті
мембрани реєструвалось наявність декількох (2-6) каналів середньої
провідності, та(або) (1-3) каналів малої провідності, або повна
відсутність будь якої канальної активності (55%) досліджених фрагментів
мембрани . Невисока щільність у поєднанні з явищем переважної реєстрації
декількох (або жодного) KK в досліджених фрагментах мембрани свідчить
про можливу кластерність розташування KK середньої провідності, або як
альтернатива нерівномірність розташування KK в плазматичній мембрані.

Визначення внеску KK різних типів у формування інтегрального mIcat.
Встановлена нами гетерогенність популяції неселективних катіонних
каналів ставить питання про участь кожного з підтипів KK у формуванні КХ
активованого струму цілої клітини. Нажаль, досі не виявлено селективних
блокаторів різних типів KK, тому для визначення внеску кожного з
підтипів KK, нами були розраховані інтегральні струми через поодинокі KK
з малою, середньою та великою провідністю. Можлива роль каналів великої
провідності 130 пСм, які до того ж мають і високі значення Ро навіть при
сильній гіперполяризації, не підтвердилась аналізом інтегрального струму
KK великої провідності та його порівнянням з інтегральним струмом цілої
клітини, форма інтегрального струму через поодинокий KK великої
провідності майже лінійна, що погано корелює з U-подібною формою
інтегрального струму цілої клітини. Однак дослідження мІсак при високому
рівні цитозольного кальцію виявило значне випрямлення форми
інтегрального трансмембранного струму при від’ємних потенціалах. Можливо
це пов’язано з підвищенням рівня активності цього типу каналів при
зростанні [Ca2+]i.

Попередньо проведена оцінка участі каналів малої провідності свідчить
про незначний внесок останніх у формування інтегрального мІкат, що є
наслідком як малої амплітуди поодиноких KK, малої провідності 10пСм, так
і відносно малими значеннями Ро. Розрахунок інтегрального струму
поодинокого KK малої провідності свідчить про те, що відносна участь
його в формуванні макроструму, активованого при активації мускаринових
рецепторів, не перевищує 5% інтегрального ефекту.

Проведений аналіз інтегрального струму поодиноких KK середньої
провідності, що виявив майже повне співпадіння потенціалзалежності
інтегрального струму поодинокого KK з формою вольт-амперної залежності
мІкат цілої клітини, свідчить про домінуючу роль саме цих каналів у
формуванні КХ відповіді ГМК тонкого кишечнику.

Побудова адекватної кінетичної моделі роботи поодинокого KK. Проведений
аналіз фрагментів активності КК виявив наявність що найменше чотирьох
пар відкритих та закритих станів О1,О2, О3, О4, та С1, С2, С3, С4.
Розрахунок кількості кінетичних станів поодинокого KK проводився шляхом
виявлення кількості моноекспоненційних функцій, що задовільно описували
розподіл тривалості відкритих та закритих інтервалів поодинокого
катіонного каналу. Нами була виявлена висока кореляція між
довготривалими відкритими і короткотривалими закритими станами, та
навпаки, що дало змогу побудувати адекватну кінетичну модель
взаємозв’язку між ними. Також нами було з’ясовано, що при активації
субмаксимальних концентрацій КХ або у випадку активації струму ГТФ?S
більше 70% інтегрального струму через KK протікає за рахунок частої
реалізації довготривалих О4 станів. Час деяких поодиноких безперервних
відкривань KK може сягати тривалості > 1 секунди, що відповідає
формуванню вкрай стабільного активного комплексу (відкритий катіонний
канал). Подібне явище спостерігається і коли проникним катіоном є Rb+,
але ймовірно шляхи досягнення такої конформаційної перебудови
канал-формуючого протеїну є різними відколи у випадку активації рубідієм
стан з аномально високими значеннями Ро спостерігається нетривалий час
лише при певних значеннях мембранного потенціалу. Таким чином,
виникнення інтегрального мІкат внаслідок активації мускаринових
рецепторів є наслідком, по-перше, зсуву рівноваги від пар станів С1-О1
до С4-О4, що призводить до суттєвого подовження тривалості відкривань
та, по-друге, загального збільшення частоти реалізації відкритих станів.
Потенціалзалежність мІкат яка відповідає за формування специфічної
U-подібної форми інтегрального струму цілої клітини при негативних
потенціалах, є наслідком зменшення Ро KK середньої провідності з
гіперполяризацією мембрани. Залежність Ро від мембранного потенціалу
добре описувалась сігмоідальною функцією, V1/2 суттєво варіювало в
діапазоні від –63 до –105 мВ, середнє значення складало –83.1?1.4мВ
(n=48). Провідність поодинокого KK зазнає лише незначне 20-25%
збільшення при деперполяризації плазматичної мембрани з –40мВ до +40мВ.

Запропонована нами кінетична модель роботи KK є подібною до кінетичної
моделі, запропонованоі раніше Кохом для описання властивостей поодиноких
ВКСа каналів. Виходячи з аналізу кінетики роботи KK середньої
провідності, та порівнюючи отримані раніше дані, з добре вивченою
кінетичною моделлю ВКСа каналів, нами було запропоновано, що
“горизонтальний” зсув рівноваги від короткотривалого відкритого стану О1
до довготривалих станів О3 та О4 відбувається внаслідок взаємодії з
активуючим KK лігандом (в нашому випадку це ГТФ?-субодиничний комплекс
гетеротримерного G-білка), в той час як “вертикальні” переходи між
парами закритих–відкритих станів С1-О1, С2-О2, С3-О3, С4-О4, є
потенціалзалежним стохастичним процесом. Така інтерпретація
потенціалзалежних та лігандзалежних властивостей активації поодиноких KK
добре корелює з даними отриманими при активації інтегрального
трансмембранного струму мІкат (особливо у випадку поступової активації
КК за допомогою ГТФ?S), коли часозалежне збільшення провідності
(збільшення кількості активованих KK) відбувається одночасно з
часозалежним зсувом значень V1/2 у напрямку негативних потенціалів. Цей
процесс є наслідком накопичення активних ГТФ?-комплексів та підвищєння
ймовірність реалізації довготривалих О4 станів КК. Зворотній ефект
спостерігається в разі повільної десенситизації струму, що підтверджує
раніше запропоновану гіпотезу про ГТФ залежний механізм десенситизації
мІкат.

Встановлено, що кількість кінетичних компонент KK при різних рівнях
мембранного потенціалу в діапазоні від –120мВ до 0мВ є однаковою, а
також виявлена стабільність розподілу між кінетичними станами
(співвідношення площ моноекспоненційних функцій, що описують розподіл).
Основні потенціалзалежні зміни відбуваються за рахунок зменшення
тривалостей ? С1 і С2 станів при деполяризації та з відповідним
збільшенням частоти та тривалості О3 і О4 станів. Виходячи з аналізу
потенціалзалежності середнього часу “життя” катіонного каналу у
відкритому та закритому станах стає зрозумілим, що в основному ефект
зростання провідності інтегрального струму при деполяризації є наслідком
40-кратного зменшення середнього часу закритого стану KK.

Запропонована нами кінетична модель адекватно описує властивості
поодинокого KK середньої провідності в області від’ємних потенціалів, та
дозволяє добре передбачити властивості інтегрального мІкат цілої клітини
при активації мускаринових рецепторів.

Базальна активність KK середньої провідності.

Дослідження властивостей KK середньої провідності в симетричних
цезійвмісних розчинах виявили можливість спонтанної активації катіонних
каналів при повній відсутності як агоністів мускаринових рецепторів, так
і активаторів гетеротримерних G-білків. Властивості спонтанно
активованих КК : амплітуда струму при –40 мВ становить 52пСм потенціал
реверсії струму через поодинокий KK знаходиться близько до 0мВ, Ро має
виражену потенціалзалежність. Залежність Ро від мембранного потенціалу
має форму сигмоїдальної функції, загальне значення при -40 мВ становить
NPO=0.003, а при +40мВ NPO=0.067. Значення V1/2, що характеризує
функцію Больцмана у випадку спонтанно активованих KK дорівнює 1.8? 7.2мВ
(n=3), що на 80мВ більше від значень V1/2 у випадку КХ або ГТФ?S
активованих KK.

Середня тривалість відкривань катіонного каналу також збільшується з
деполяризаціею мембрани при –40мВ 0.97?0.01 мс (n=202) та 1.98?0.17 мс
(n=1382) при +40 мВ. Частота роботи KK при цьому зростає більше ніж в 6
разів. Наявність такої спонтанної активності KK є передбаченою і
відповідає наявності потенціал- або кальційзалежних короткотривалих
відкритих станів О1. Зростання Ро та середнього часу відкритого стану
спонтанноактивованих KK з деполяризацією мембрани може бути наслідком
потенціаліндукованого зростання афільності канал-формуючого протеїну по
відношенню до ГТФ?-комплексів, які, вочевидь, здатні формувати певний
базальний рівень навіть за відсутності активаторів мускаринових
рецепторів. На рівні поодинокого KK це відповідає збільшенню ймовірності
реалізації більш довготривалих О2 станів, що є наслідком часткової
активації KK ГТФ?-комплексом. Підтвердженням такої гіпотези є досліди
КХ-активованих інтегральних струмів, під час яких було виявлено, що ІС50
для карбахоліна при позитивних значеннях мембранного потенціалу у 20
разів менша, ніж при негативних потенціалах.

Іншим цікавим явищем, пов’язаним зі спонтанною активацією KK, є
формування потенціаліндукованного вхідного струму, без участі
активаторів мускаринових рецепторів або G-білків, за умов зовнішнього
рубідійвмісного розчину. Нами було встановлено, що такий вхідний
рубідієвий струм через КК блокувався 2мМ La3+. Дослідження властивостей
поодиноких KK у випадку, коли проникаючим катіоном був рубідій, виявило
типову провідність (60пСм). Залежність Ро від мембранного потенціалу,
яка на ділянці від -120 до -60мВ може бути описана сігмоідальною
функцією, також відповідає властивостям цього типу KK. Виникнення
аномально високої провідності на ділянці –60 до –100 мВ та її подальше
різке зменшення при більш від’ємних потенціалах пов’язано із властивістю
KK різко підвищувати Ро у вказаному вище проміжку значень мембранного
потенціалу. Таке різке збільшення Ро з 0.01 при –120мВ до 0.9-0.99 при
–80мВ є досить дивним та можливо пов’язане з нетиповими перебудовами
конформації канал-формуючого протеїну, що імовірно є наслідком
особливого впливу іонів Rb+.

Вплив двовалентних катіонів Са2+ та Mg2+ на катіонний струм у
конфігурації “whole-cell” досліджувався раніше, було встановлено, що
мIкат активований як карбахоліном, так і ГТФ?S, у значній мірі
блокувався при додаванні двовалентних катіонів до зовнішнього розчину.
Інгібуюча дія двовалентних катіонів може бути пов’язана як з можливим
блокуванням каналу у відкритому стані, так і з екрануванням поверхневих
зарядів поблизу функціональноважливих ділянок катіонного каналу. В
останньому випадку можна очікувати, що ефекти Ca2+ та Mg2+ мають бути
подібні один до одного. Вплив двовалентних катіонів викликав подібне
зменшення провідності поодиноких KK. У наших дослідах було встановлено,
що додавання 2 мМ магнію у зовнішній розчин призводило до ймовірного
зменшення середньої амплітуди струмів з 2.80?0.28 до 1.57?0.16 пА при
–40мВ (Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020