.

Вплив пероксидації ліпідів на стан мембран клітин слизової оболонки шлунка щурів за умов експериментальної виразки (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
108 2199
Скачать документ

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

КОВАЛЬОВА ВІКТОРІЯ АНАТОЛІЇВНА

УДК 616. 33-002.44:539.1.047

Вплив пероксидації ліпідів на стан мембран клітин слизової оболонки
шлунка щурів за умов експериментальної виразки

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в відділі біохімії НДІ фізіології імені академіка Петра
Богача біологічного факультету Київського національного університету

імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна,

Київський національний
університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

Палладіна Тетяна Олександрівна,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного
НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу клітинної біології та
анатомії рослин

доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної
патології, онкології та

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького
НАН України,

завідувач відділу радіобіології

Провідна установа: Чернівецький національний університет

ім. Ю.Федьковича МОН України, м.
Чернівці

Захист дисертації відбудеться “28” лютого 2005 року о 14 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд.434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, спецрада Д
26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м.Київ, вул.
Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “20”січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Т.Р.Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вплив на організми тварин і людини комплексу
несприятливих чинників оточуючого середовища призводить до виникнення в
них різних захворювань. Протягом останніх десятиріч у сфері інтенсивних
наукових досліджень знаходиться патологія органів травлення [Cheng et
all, 2000], серед яких домінує виразкова хвороба шлунка. Виразковий
процес є кінцевим етапом складного захворювання, в патогенез якого
включені центральна нервова система, ендокринна система, біогенні аміни
та поліпептиди травної системи. Ключову роль в механізмах утворення
виразки відіграють процеси пероксидації ліпідів та порушення механізмів
захисту епітелію слизової оболонки. Тому на сьогодні одним з
найважливіших питань є вивчення ролі вільних радикалів у розвитку
захворювань шлунка, зокрема виразок гастродуоденальної зони [Мягкова,
1996].

Велика зацікавленість до вивчення біохімічних процесів за участю
кисневих радикалів зумовлена тим, що ці активні інтермедіатори ініціюють
вільнорадикальні реакції, які призводять до пошкодження структури та
цілісності біологічних мембран, що супроводжується порушенням
функціонування іон-транспортних систем [Ивашкина и др., 2001].

В цілісному організмі, що піддається дії ульцерогенних факторів, досить
важко вичленити окремі ланки в загальному ефекті порушення його
функціонування. Тому актуальною проблемою є дослідження стану клітин та
їх мембран. Дослідження в цьому плані дозволяють з’ясувати механізми
розвитку патології за умов дії зазначених чинників. При цьому, одним із
ранніх порушень є пошкодження плазматичних мембран, з якими пов’язані
численні білки, зокрема ферменти [Шалободов, 2000], що, з одного боку
каталізують трансмембранні реакції, утворюючи ланцюги послідовних
перетворень через взаємодію з мембранозв’язаними субстратами, а, з
другого, беруть участь у модифікації транспортних систем, завдяки
регуляції їх функціональної активності [Ernmelot at all, 1998].

Інтенсифікація окиснювальних реакцій призводить до збільшення
навантаження на захисні антиоксидантні механізми, які гальмують цей
процес й перешкоджають окиснювальній деструкції біологічних структур.
Продукти перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) мають цитотоксичну та
антимітотичну дію. У дослідах на тваринах показано, що виникнення
виразок, ішемічні ураження шлунка пов’язані зі збільшенням концентрації
вільних радикалів, зокрема, супероксидних, та пригніченням активності
супероксиддисмутази [Циммерман, 1994].

Проте в літературі не виявлено відомостей про стан вільнорадикального
окиснення, особливостей функціонування системи антирадикального захисту
в цілому та в окремих ланках біохімічних перетворень при різних
експериментальних моделях виразки шлунка. На сьогодні існує досить
незначний обсяг інформації про зміни вмісту ліпідів у результаті
виникнення виразки. Відсутні дані про біорегуляторні механізми в
мембранах клітин слизової оболонки шлунка за умов розвитку даної
патології. Вивчення цих процесів є нагальною проблемою, оскільки дасть
змогу науково обгрунтувати нові шляхи терапії та фармакологічної
корекції виявлених порушень препаратами природного походження, які мають
властивості цитопротекторів та антиоксидантів.

Застосування існуючих засобів лікування не дає бажаних результатів:
хвороба набуває затяжного характеру, з’являються стійкі рецидиви, що
вимагає постійної корекції, тривалого лікування і операційного
втручання.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
відповідає плану науково-дослідної роботи відділу біохімії НДІ
фізіології ім. Петра Богача біологічного факультету Київського
національного університету імені Тараса Шевченка та виконана згідно з
тематичним планом держбюджетної теми № 01 БФ 033-03.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідити вплив
процесів пероксидного окиснення ліпідів як фактора агресії при розвитку
експериментальної виразки на стан мембран клітин слизової оболонки шунка
щурів. Вивчити вплив речовин природного походження на процеси ПОЛ в
гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів.

Для їх досягнення були поставлені такі завдання:

Оцінити накопичення продуктів перекисного окиснення ліпідів в гомогенаті
слизової оболонки шлунка щурів при експериментальній виразці шлунка.

Оцінити рівень активності супероксиддисмутази та каталази в гомогенаті
слизової оболонки шлунка щурів.

Вивчити ліпідний склад мембран клітин слизової оболонки шлунка щурів.

Дослідити рівень активності мембранних ферментів: 5’- нуклеотидази,
Са2+,Mg2+- АТФази та Na+, K+-АТФази плазматичних мембран клітин слизової
оболонки шлунка щурів в контролі та за умов виразки.

Дослідити активність протеїнкіназ в мембранах клітин слизової оболонки
шлунка щурів за фізіологічних умов та при експериментальній виразці.

Проаналізувати вплив препаратів природного походження меланіну та
сквалену на процеси ПОЛ в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів.

Об’єкт дослідження: біохімічні механізми порушень в клітинах
слизової оболонки шлунка в процесі формування виразки.

Предмет дослідження: плазматичні мембрани клітин слизової оболонки
шлунка щурів.

Методи дослідження. В роботі використовували біохімічні (визначення
активності ферментів), радіологічні, спектрофотометричні (визначення
вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів), флуоресцентний
(визначення вмісту шиффових основ), хроматографічний (визначення вмісту
ліпідів), електронно-мікроскопічний методи та методи математичної
статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження стану антиоксидантної системи та вмісту продуктів
перекисного окиснення ліпідів в гомогенаті слизової оболонки шлунка при
різних експериментальних моделях виразки. Встановлено підвищення вмісту
продуктів ПОЛ при всіх моделях виразки та зниження активності
антиоксидантних ферментів. Показані зміни ліпідного складу мембран
клітин слизової оболонки шлунка. Виявлено, що активність
мембранозв’язаних ферментів по-різному змінюється в досліджуваних
моделях виразок. Вивчена активність циклонуклеотид-, кальцій,
фосфоліпід-залежних та тирозинових протеїнкіназ в мембранах клітин
слизової оболонки шлунка за умов даної патології. Вперше встановлено, що
сквален і меланін – препарати природного походження мають виражені
антиоксидантні властивості та здатність до загоєння виразки. Отримані
дані важливі для розуміння механізмів утворення та розвитку виразкової
хвороби шлунка.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати щодо
досліджуваних біохімічних механізмів виразкоутворення можуть бути
використані для розробки нових методів діагностики та лікування
виразкової хвороби шлунка. Оскільки сквален має виражені антиоксидантні
та цитопротекторні властивості він може бути запропонований як основа
для створення фармакологічних препаратів, які можуть бути застосовані
для комплексної терапії виразки шлунка. Встановлений ефект зниження
вмісту продуктів ПОЛ при введенні меланіну перед виразкоутворенням, може
бути підставою для використання його для профілактики виразкової
хвороби.

Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, проведення експерименту
та аналіз результатів дослідження виконані дисертантом особисто.
Планування та розробка методичних підходів проведення експериментальних
досліджень проведені разом із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені
на Міжнародній конференції “Клітинні і субклітинні механізми
функціонування травної системи” (Львів – 2004), Х Конгресі Світової
Федерації Українських лікарських товариств (Чернівці-Київ-Чікаго, 2004),
Установчьому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів,
2004), Міжнародній конференції “Neuro-humoral and cellular regulatory
mechanisms of digestion processes” (Lviv, 2003), на міжнародній
Гастроентерологічній конференції “Влияние меланина и сквалена на
процессы перекисного окисления липидов при аспириновой язве желудка”
(Москва 2003), III Міждународному симпозіумі “Механизмы действия
сверхмалых доз” (Москва, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертаційних досліджень опубліковано 6
статей та 5 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу,
огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи
та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що включає
241 джерело. Дисертація викладена на 157 стор., містить 21 рисунок,
7 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В дослідах використовували білих щурів лінії Вістар обох статей масою
130-150 г. Щурів утримували на стандартному раціоні віварію. З метою
отримання нейродистрофічних уражень шлунка за моделлю імобілізаційного
стресу використовували метод в модифікації [Гройсман и др., 1979].
Етанолові виразки викликали за методом [Ивашкин, 1999]. Аспіринова
експериментальна виразка шлунка викликалась пероральним 5-разовим
введенням аспірину в дозі 150 мг/кг протягом 3 діб, як описано в роботі
[Стефанов, 2001].

Ізольовані клітини слизової оболонки шлунка отримували за методом
[Таиров и др., 1983].

Перебіг вільнорадикальних процесів в гомогенаті слизової оболонки шлунка
щурів досліджували за параметрами спонтанної та ініційованої
хемілюмінесценції. Дієнові кон’югати, шиффові основи визначали
відповідно до [Орехович, 1977]. Вміст малонового діальдегіду визначали
згідно [Гаврилов и др., 1987]. Вміст білка в досліджуваних препаратах
визначали за методом Лоурі та співавт. [Lowry et al., 1951]. Ліпіди
екстрагували за методом [Kates, 1986].

Активність як Са2+-, так і Mg2+-АТФази визначали згідно [Древаль и др.,
1989]. Визначення активності 5 /- нуклеотидази проводили відповідно
[White at all, 1974]. Na+, К+-АТФазна активність визначалась як різниця
величин в середовищі з уабаїном і без нього за методом [Древаль и др.,
1989]. Активність циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ оцінювали за
включенням 32Рн із (?-32Р/-АТФ) в гістон Н2В згідно [Gill at all, 1997].
Визначення активності Са2+,фосфоліпідзалежної протеїнкінази проводили за
методом [Остапченко и др., 1986]. Визначення активності тирозинових
протеїнкіназ проводили за [Boutin, 1996].

Препарат сквалену, розчинений 1:10 в рослинній олії, вводили тваринам
per os по 20 мкл 3 рази на добу після виразкоутворювання. Меланін,
одержаний з чорних дріжджів Nadsoniella nigra var. hesuelisa, вводили
per os за 30 хвилин до виразкоутворення (введення аспірину) в дозі 20
мг/кг одноразово.

Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами статистики
[Плохинський, 1981; Кучеренко та ін., 2001].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для проведення досліджень нами були обрані три експериментальні моделі
виразки: аспіринова, етанолова та стресова. Стрес визнано найбільш
частою причиною виразковою хвороби. Другою за частотою причиною розвитку
виразок є вживання не стероїдних протизапальних препаратів, наприклад,
ацетилсаліцилової кислоти. Поширеними є виразки, що викликаються
тривалим вживанням міцних спиртних напоїв. Алкоголь стимулює
кислотоутворюючу діяльність шлунка, в результаті чого посилюються
агресивні властивості шлункового соку, з одночасним порушенням бар’єрної
функції слизової оболонки [Губачев и дрю, 2000].

Нами виявлено різний вплив цих трьох факторів на слизову оболонку
шлунка. Встановлено, що внаслідок дії ацетилсаліцилової кислоти, слизова
оболонка шлунка щурів має набряк та значні ділянки крововиливів. У
тварин на ділянці малої кривизни шлунка виявляються поодинокі неглибокі
виразки та численні ерозії слизової оболонки, порівнюючи з контролем.

При етаноловій моделі на всій слизовій оболонці складчатої поверхні
шлунка виявлені крововиливи.

При виразках, що утворюються внаслідок стресу, розрізняють три види
уражень слизової оболонки: крововиливи в слизову оболонку від мілких
істехій до значних ділянок; ерозії з поверхневою деструкцією слизової
оболонки ( не глибше підслизового шару стінки шлунка); виразки, при яких
дефект досягає м’язевого, а іноді і серозного шару.

Результати дослідження процесів пероксидації ліпідів показали, що їх
активація на різних моделях виразки шлунка має свої особливості
(табл.1). Так, на етаноловій та стресовій моделях виявлено статистично
значуще підвищення рівня первинних продуктів ПОЛ – дієнових кон’югатів ,
в середньому на 80% та 65% відповідно, і кінцевих продуктів ПОЛ –
шиффових основ на 500%. Шиффові основи (ліпофлюорисцентні, ліпофусцинові
пігменти) характеризують більш довготривалі зміни окисного гомеостазу.
Суттєве збільшення цього показника найчастіше є наслідком тривалої
активації ПОЛ, що зустрічається при тяжких ураженнях клітин.

В той же час, при аспіриновій моделі виразки шлунка рівні первинних і
кінцевих продуктів ПОЛ не відрізнялися від контрольних величин.

Таблиця 1

Вміст продуктів ПОЛ в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів при
різних експериментальних моделях виразки (М ? м; n=10)

Групи тварин Дієнові кон’югати

(нмоль/мг білка) Шиффові основи

(ум.од.)

Контроль 221,0?18,0 0,5?0,03

Аспіринова модель 245,1?13,4 0,5?0,04

Етанолова модель 403,8?40,3* 2,7?0,2*

Стресова модель 365,7?24,2* 2,6?0,1*

Примітка: тут і далі *-р? 0,05 різниці достовірні по відношенню до
контролю

Проведені нами дослідження виявили також певні відмінності у накопиченні
вторинного продукту ПОЛ (малонового діальдегіду), який утворюється як за
ферментативним, так і не ферментативним шляхом (табл.2). Підвищення
вмісту малонового діальдегіду (МДА) встановлено на всіх моделях виразки
шлунка. Найбільш значимо зростає вміст МДА (на 60% та 80%) на при
розвитку аспіринової та стресової моделях виразки шлунка. Дослідження
ферментативного і не ферментативного шляху аутоокиснення ліпідів
показало, що при аспіриновій та стресовій моделях виразки шлунка домінує
не ферментативний шлях активації процесів ПОЛ ( рівень МДА підвищується
на 65% і 38% відповідно). За умов розвитку виразки, що була викликана із
застосуванням етилового спирту, в значній мірі активувався
ферментативний шлях, про що свідчить підвищення рівня МДА на 68%.

Таблиця 2

Вміст МДА в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів при різних
експериментальних моделях виразки (М ? м; n=10)

Групи тварин Вміст МДА (нмоль/мг білка) Спонтанне накопичення МДА

(нмоль/мг білка) Fe2++аскор.

залежне накопичення МДА

(нмоль/мг білка ) НАДН+ + АДФ-залежне накопичення МДА

(нмоль/мг білка)

Контроль 208,5?16,5 397,0?23,7 492,5?19,8 1005,1?29,0

Аспіринова

модель 371,3?14,0* 637,0?18,0* 811,0?18,6* 1295,9?20,1*

Етанолова

модель 299,0?29,9* 560,0?38,5* 623,1?24,3* 1683,5?36,7*

Стресова

модель 383,2?21,4* 642,0?31,0* 678,4?29,7* 1090,5?20,08

Порушення антиоксидантної рівноваги можливо зумовлене змінами в
механізмі антирадикального захисту. Важливим чинником, від якого
залежить концентрація вільних радикалів у клітинах організму є
кооперативна робота ферментів антиоксидантної системи (СОД і каталази),
які регулюють рівень активних метаболітів кисню [Sutton et al., 1996].
Незалежно від зміни активності СОД (рис.1) рівень каталазної активності
був знижений при різних моделях виразки суттєво в слизовій оболонці
шлунка щурів (на 72%) при аспіриновій (рис.2), (на 40%) при етаноловій
виразці та (на 45%) при стресовій, що свідчить про виснаження
антиоксидантної системи, яке супроводжується накопиченням продуктів ПОЛ,
як було показано раніше.

Рис. 1. Активність СОД в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів при
різних моделях виразки (1-контроль, 2-аспірин, 3-етанол, 4-стрес)

Рис. 2. Активність каталази в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів
при різних моделях виразки (1-контроль; 2-аспірин; 3-етанол; 4-стрес)

Мішенню атаки окисних радикалів є подвійні зв’язки в молекулах
ненасичених жирних кислот, що входять до складу фосфоліпідів біомембран.

Нами був визначений вміст фосфоліпідів: фосфатидилхоліну (ФХ),
фосфатидилінозитолу (ФІ), фосфатидилсерину (ФС), фосфатидилетаноламіну
(ФЕА) та лізофосфотидилхоліну (ЛФХ) (таблиця 3) в мембранах клітин
слизової оболонки шлунка щурів при різних експериментальних моделях
виразки. Дослідження фосфоліпідного складу мембран клітин слизової
оболонки шлунка показали зниження вмісту всіх груп фосфоліпідів при всіх
експериментальних моделях виразки. Найбільш статистично значуще зниження
фосфоліпідів всіх груп спостерігається при стресовій виразці – в 2
рази.

Порушення структури ліпідного бішару сприяє збільшенню проникності і
плинності мембран, що змінює координацію і специфічність мембранних
процесів: активний регульований транспорт іонів (К+, Na+, Са2+), кисню,
метаболітів; формування заряду мембран та їх поляризації; зниження
регуляторного впливу гормонів, медіаторів і т.п [Мажуль и др., 1990].

Таблиця 3

Вміст полярних ліпідів в плазматичних мембранах клітин слизової оболонки
шлунка щурів при різних експериментальних моделях виразки (М?м; n = 10)

Групи тварин ФХ

мкг/мг білка ФІ

мкг/мг білка ФС

мкг/мг білка ФЕА

мкг/мг білка ЛФХ

мкг/мг білка

Контроль 110,8±10,0 17,5±1,6 17,8±1,5 58,2±5,5 16,4±1,4

Аспірин.

модель 59,3±5,8* 11,0±1,0* 13,2±1,2* 51,6±4,9* 11,1±1,0*

Етанолова

модель 62,6±5,8* 14,5±1,3 13,0±1,0* 26,9±2,0* 11,6±0,9*

Стресова

модель 62,8±5,8* 13,3±1,0 10,5±1,0* 34,9±3,0* 7,6±6,0*

Зменшення кількості фосфатидилсерину і фосфатидилінозитолу свідчить про
зміни фосфоліпідної складової у структурі мембран, що зумовлює зміни
активності мембранозв’язаних ферментів, та порушення функціонування
регуляторних каскадів [Nishisaki et al., 1991].

Для з’ясування вищезгаданих процесів було досліджено активність
5’-нуклеотидази, Са2+,Mg2+-АТФази та Na+,K+-АТФази.

Рис. 3. Активність 5’-нуклеотидази в плазматичних мембранах клітин
слизової оболонки шлунка при різних експериментальних моделях виразки у
щурів.

Рис. 4. Активність Са2+,Mg2+-АТФази в плазматичних мембранах клітин
слизової оболонки шлунка

щурів за умов експериментальних моделей виразки.Були виявлені
характерні зміни у функціонуванні зазначених ферментів в мембранах
клітин слизової оболонки шлунка за умов експериментальної виразки у
щурів. При етаноловій та стресовій виразках (рис.3) активність
5’-нуклеотидази знижується в 1,8 раза та 1,5 відповідно по відношенню до
контролю.

Різке зниження активності даного ферменту при етаноловій та стресовій
виразках шлунка, можливо, пов’язане зі зміною структури мембран і,
зокрема, з порушенням взаємодії їх білкових компонентів та фосфоліпідів,
профіль яких порушується при даному захворюванні. При аспіриновій
виразці активність цього ферменту статистично значимо не змінювалась.

Дослідження активності Са2+,Mg2+-АТФази показало характерні зміни у
функціонуванні ферменту в мембранній фракції клітин слизової оболонки
шлунка щурів при різних експериментальних моделях виразки (рис.4): при
етаноловій виразці активність Са2+,Mg2+-АТФази знижувалась в 1,4 раза, а
при стресовій – активність різко зменшувалась. Встановлений факт може
бути пов’язаним із порушенням Са2+ гомеостазу та, можливо, з початком
апоптичних або некротичних змін в клітинах слизової оболонки шлунка
щурів. При аспіриновій виразці активність цього ферменту статистично
значимо не змінювалась.

Виявлено зниження активності Nа+,К+-АТФази при всіх експериментальних
моделях виразки (рис.5) : при аспіриновій та етаноловій моделі в 2 рази,
а при стресовій різке зниження.

Таким чином , нами було встановлено, що при різних моделях виразки
шлунка змінюється активність мембранозв’язаних ферментів, що зумовлено
структурною реоргані-зацією мембран клітин слизової оболонки.

Рис. 5. Активність Nа+,К+-АТФази в мембранах клітин слизової оболонки
шлунка щурів при різних моделях виразки:

Встановлені зміни можуть призводити до дисбалансу в роботі транспортних
систем, що в подальшому може викликати порушення внутрішньоклітинної
регуляції.

Важливим регуляторним механізмом, що суттєво впливає на перебіг
внутрішньоклітинних подій пов’язаних з модифікацією білкових
компонентів, є системи фосфорилювання, які представлені різноманітними
протеїнкіназами.

B

$P?B

@

@

@

)

@

????l?елей.

Можливою причиною порушень активності досліджуваних ферментів, за умов
експериментальних виразок шлунка є зміни вмісту циклічних нуклеотидів
[Остапченко, 2004].

Зниження активності ПК-А свідчить про залучення цАМФ до молекулярних
подій за умов розвитку аспіринової моделі виразки, а високий рівень
активності ПК-Г свідчить про залучення цГМФ до біохімічних механізмів,
які порушуються за умов розвитку етанолової та стресової виразок.

Рис. 6. Активність протеїнкіназ в плазматичних мембранах клітин
слизової оболонки шлунка щурів при різних експериментальних моделях
виразки (1-контроль; 2-аспірин; 3-етанол; 4-стрес).

Згідно отриманим результатам, активність Са2+,фосфоліпідзалежної
протеїнкінази також статистично значуще знижувалась в плазматичних
мембранах клітин слизової оболонки шлунка щурів при аспіриновій моделі
(рис.7) . Можна припустити, що порушеня у функціонуванні вищезгаданого
ферменту можуть бути пов’язані зі змінами у фосфоліпідному складі
мембран, зокрема у вмісті фосфатидилсерину.

Рис.7.Активність Са2+, фосфоліпід залежної протеїнкінази в плазматичних
мембранах клітин слизової оболонки шлунка щурів.

При стресовій виразці активність даного ферменту підвищувалась. Це може
бути пов’язано із підвищенням вмісту основних регуляторів даного
ферменту – діацилгліцеролу (ДАГ), Са2+ та фосфатидилсерину (ФС) [Gill
et al., 1991]. Такий механізм встановлено нами за умов розвитку стресу.

Особливий інтерес викликає тирозинова протеїнкіназа, яка представляє
собою цитоплазматичний домен рецептора, що найчастіше сам є мішенню
фосфорилювання (аутофосфорилювання). Показано, що рецепторні тирозинові
протеїнкінази виконують функцію ключової ланки сигнальної трансдукції
епідермального ростового фактора (ЕФР) – одного з найбільш відомих
цитокінів з онкогенними властивостями. ЕФР – регулює регенерацію
епітеліоцитів шлунка. Зниження секреції ЕФР веде до підвищення секреції
соляної кислоти (НCl) [Шептулин, 1996].

Визначення активності цієї кінази показало, що за умов різних
експериментальних моделей виразок шлунка, її активність порушується
(рис.8). При аспіриновій та етаноловій моделях виразок шлунка
спостерігалось зниження активності тирозинової кінази, а за умов
розвитку стресової виразки активність Тир-ПК зростала.

Можливою причиною зміни активності тирозинової кінази може бути
викликане утворенням виразки шлунка посилення рівня інтерлейкінів, які
відіграють суттєву роль у регуляції активності саме цього ферменту
[Burke et al., 1997 ].

Рис. 8. Активність тирозинової протеїнкінази в плазматичних мембранах
клітин слизової оболонки шлунка щурів при різних експериментальних
моделях виразки (1-контроль; 2-аспірин; 3-етанол; 4-стрес).

Незважаючи на створення широкого арсеналу лікарських засобів, лікування
виразкової хвороби залишається актуальною проблемою. Тому, пошук і
дослідження біологічно-активних сполук, які мають властивості
цитопротекторів і антиоксидантів є проблемою сучасності.

Нами було проведено дослідження цитопротекторних та антиоксидантних
властивостей препаратів природнього походження сквалену та меланіну при
різних моделях виразки шлунка у щурів.

В результаті проведених нами досліджень, встановлено, що введення
сквалену знімає набряк та крововиливи, зменшує тяжкість виразкових
уражень та ерозій шлунка в усіх досліджуваних моделях, крім етанолової.
При етаноловій виразці залишається незначна кількість ерозій.

Таблиця 4

Вміст МДА в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів при різних моделях
виразок та після введення сквалену

( М?м; n = 10)

Група тварин Вміст МДА

Нмоль/мг Спонтанне накопичення МДА

Нмоль/мг Fe2++аск.-залежне накопичення

МДА

Нмоль/мг НАДН+-залежне накопичення МДА

Нмоль/мг

Аспірин 371,2?36,7 637,0?62,2 811,0?78,9 1291,9?120,0

Аспірин +

сквален

(1 доба)

210,0?20,0*

371,0?36,7*

542,5?54,2*

963,7?95,5*

Аспірин+

сквален

(3 доби)

216,1?21,5*

295,2?28,8*

458,5?44,5*

885,2?88,8*

Стрес 383,2?21,4 642,0?31,0 678,4?29,4 1090,5?20,0

Стрес+

сквален

(1 доба) 294,6?29,4 493,8?48,3 565,0?55,5 1038?103,0

Стрес+

сквален

(3 доби)

212,1?21,0*

405,3?40,3*

495,0?48,0*

1024?100,0*

Етанол 299,9?29,9 560,0?38,5 623,1?24,3 1683,5?36,7

Етанол+

сквален

(1 доба)

284,7?28,4

533,3?52,3

593,3?58,3

1602,8?150,0

Етанол + сквален

(3 доби)

270,4?27,0

507,9?50,0

564,7?56,4

1526,5?150,0

Згідно з отриманними результатами, при різних моделях виразок зростає
вміст МДА, як нами було показано раніше (таблиця 2). При аспіриновій
моделі виразки вже на 1 добу після введеня сквалену вміст МДА був в
межах контрольних значень (таблиця 4). При стресовій виразці на 3 добу
після введення сквалену всі показники вмісту МДА знаходяться на рівні
контрольних значень. Лише при етаноловій моделі виразки сквален не
нормалізує вміст МДА ні на 1 добу, ні на 3 добу після його введення.

В результаті проведених нами досліджень вмісту первинних та кінцевих
продуктів ПОЛ було встановлено, що активація процесів ПОЛ на різних
моделях виразки шлунка має свої особливості (таблиця 1).

Таблиця 5

Вміст продуктів ПОЛ в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів при
різних моделях експериментальних виразок та після введення сквалену,
(М?м; n=10).

Група тварин Дієнові кон’югати

Нмоль/мг білка Шиффові основи

Ум.од.

Аспірин 245,1?24,1 0,5?0,05

Аспірин + сквален

(1 доба)

239,6?23,3

0,5?0,05

Аспірин + сквален

(3 доби)

224,0?22,4

0,5?0,05

Стрес 365,7?24,2 2,6?0,1

Стрес + сквален

(1 доба)

279,2?23,3*

1,0?0,1*

Стрес + сквален

(3 доби)

273,2?23,3*

0,5?0,05*

Етанол 403,8?40,3 2,7?0,2

Етанол + сквален

(1 доба)

365,6?3,5

2,5?0,2

Етанол + сквален

(3 доби)

293,3?2,8*

1,5?0,1*

На аспіриновій моделі виразки шлунка ці показники не відрізняються від
контрольних величин. При стресовій моделі виразки сквален вже на 1 добу
знижує вміст дієнових кон’югатів (таблиця 5). При етаноловій моделі на 1
добу вміст дієнових кон’югатів не змінюється після введення сквалену,
але вже на 3 добу вміст дієнових кон’югатів знижується. Вміст кінцевих
продуктів ПОЛ (шиффових основ) зростає при стресовій та етаноловій
моделях виразок в 5-6 разів. Сквален знижує ці показники при стресовій
моделі вже на 1 добу в 2,5 рази, а на 3 добу до контрольних значень. При
етаноловій моделі на 1 добу після введення сквалена вміст шиффових основ
не змінюється , а на 3 добу знижується.

Нами були проведені дослідження впливу сквалену на активність
антиоксидантних ферментів: СОД і каталази (таблиця 6). Після введення
сквалену активність каталази підвищувалась при аспіриновій виразці вже
на 1 добу в 1,4 раза, а на 3 добу в 1,6 раза, відносно до групи тварин з
ерозивно-виразковими ушкодженнями слизової, викликаними аспірином. При
стресовій моделі виразки активність каталази підвищувалась на 3 добу
після введення сквалену. При етаноловій виразці активність каталази
зросла в 1,2 раза на 1 добу після введення сквалену, а на 3 добу не
змінювалась.

Таблиця 6

Активність каталази та супероксиддисмутази (СОД) в гомогенаті слизової
оболонки шлунка щурів за умов експериментальної виразки та після
введення сквалену, (М±м; n=10)

Групи тварин Каталаза

Нмоль/мг хв СОД

% відносно контролю

аспірин 5,1±0,5 70%

Аспірин+сквален

(1 доба) 7,4±0,4* 90%*

Аспірин+сквален

(3 доби) 8,3±0,5* 95%*

Етанол 10,0±0,9 65%

Етанол+сквален

(1доба) 12,0±1,0* 75%

Етанол+сквален

(3 доби) 12,0±1,0* 85%*

Стрес 8,7±0,5 100%

Стрес+сквален

(1доба) 9,7±0,5* 100%

Стрес+сквален

(3 доби) 13,0±0,9* 100%

Після введення сквалену при аспіриновій та етаноловій виразках
активність СОД зросла на 1 добу в 1,2 раза, а на 3 добу в 1,3 раза по
відношенню до групи тварин з ерозивно-виразковими ушкодженнями слизової,
викликаними аспірином та етанолом.

Отже, отримані результати свідчать, що сквален має потужний
антиоксидантний потенціал і може бути використаний як основа для
створення фармакологічних препаратів для профілактики так і комплексного
лікування виразкової хвороби.

Особливе місце серед противиразкових препаратів займає меланін, який
виявляє виражені антистресорні, імуномодулюючі та бактеріостатичні
властивості.

Згідно з отриманими результатами, відомо, що при аспіриновій виразці
зростає вміст МДА. В групі тварин, яким був введений одноразово меланін
перед виразкоутворенням показники вмісту МДА наближалися до контрольних
величин (таблиця 6).

Введення тваринам меланіну на фоні експериментально викликаних
ерозійно-виразкових ушкоджень аспірином не впливало на активність СОД,
але підвищувало активність каталази в 1,2 раза в гомогенаті слизової
оболонки шлунка щурів.

Така особливість меланіну може бути пов’язана з його протекторною дією,
що сприяє відновленню гідрофобного стану слизової оболонки шлунка.

Таблиця 7

Вміст МДА в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів при аспіриновій
виразці та після введення меланіну (М?м; n=10)

Групи тварин Вміст МДА

Нмоль/мг Спонтанне

накопичення

МДА

Нмоль/мг Fe2++аск-залежне накоп. МДА

Нмоль/мг НАДН-залежне накоп.МДА

Нмоль/мг

Контроль 208,5?16,5 397,0?23,7 492,5?19,8 1005,1?29,0

Контроль

+меланін

206,4?20,6

390,0?30,0

490,5?40,0

1000,0?35,0

Аспірин 371,2?14,0* 637,0?18,0* 811,0?18,6* 1295,9?20,1*

Аспірин +

меланін

310,7?30,0*

528,9?43,3*

602,4?28,3*

1243,8?45,0

Підсумовуючи отримані результати можна стверджувати, що при всіх
експериментальних виразках шлунка фактором агресії виступають процеси
перекисного окиснення ліпідів. Оптимальний субстрат процесу ПОЛ –
фосфоліпіди біомембран, точніше – полієнові жирні кислоти, що входять до
їх складу, а безпосередня мішень атаки окисних радикалів – подвійні
зв’язки в їх молекулах. Від їх нормального вмісту залежать текучість,
рухливість мембран, ефективність найважливіших фізіологічних функцій
(диференційна проникність, активний транспорт іонів та метаболітів,
захисна і опорна функції, участь в передачі збудження, скоротливість і
т.п.). Пошкодження структурних компонентів мембран в процесі ПОЛ
негативно відображається на всіх цих функціях. Зменшення кількості
фосфатидилсерину і фосфатидилінозитолу призводить до порушення базальної
активності аденілатциклази (АдЦ), знижує реактиваційну дію інших
ліпідів, а також, можливо, сприяє роз’єднанню АдЦ комплексу на окремі
компоненти, що призводить до порушення функціонування Са-мобілізуючої
поліфосфоінозитидної системи.

Встановлені загальні і специфічні зміни в мембранах клітин слизової
оболонки шлунка при різних експериментальних моделях виразки сприяють
розробці загальних методів діагностики виразкової хвороби шлунка.

Антиокиснювальна і цитопротекторна дія меланіну і сквалену дає підстави
їх використання як основи для створення майбутніх фармакологічних
препаратів для профілактики та лікування досліджуваної патології.

ВИСНОВКИ

1. Проведено комплексне дослідження стану мембран клітин слизової
оболонки шлунка щурів за умов різних експериментальних моделей виразки:
аспіринової, етанолової та стресової.

2. Доведено, що перекисне окиснення ліпідів є ключовим фактором
виразкоутворення, незалежно від причини виникнення виразки. При всіх
експериментальних моделях виразок збільшується вміст продуктів ПОЛ та
знижується активність антиоксидантних ферментів в гомогенаті слизової
оболонки шлунка щурів.

3. Встановлено зменшення вмісту фосфоліпідів мембран клітин слизової
оболонки шлунка щурів при всіх моделях виразок, найбільш статистично
значуще зниження фосфоліпідів всіх груп виявлено при стресовій виразці –
в 2 рази.; вміст етерів холестеролу підвищується при етаноловій та
стресовій виразках в 2,5 раза.

4. Виявлено зниження активності мембранозв’язаних ферментів:
5’-нуклеотидази, Са2+,Mg2+-АТФази, Nа+,К+-АТФази в мембранах клітин
слизової оболонки шлунка щурів при всіх моделях виразок.

5. Показані різнонаправлені зміни активності протеїнкіназ: цАМФ-, цГМФ-,
Са2+, фосфоліпідзалежної та тирозинової. Активність протеїнкіназ
знижується при аспіриновій виразці і підвищується при етаноловій та
стресовій виразках в мембранах клітин слизової оболонки шлунка щурів.

6. Дослідження впливу біологічно-активних речовин на процес
виразкоутворення показало, що меланін та сквален характеризуються
корегуючим антиоксидантним та цитопротекторним потенціалом і можуть бути
рекомендовані до використання при створенні засобів профілактики та
комплексного лікування виразкової хвороби.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Ковальова В.А., Дробінська О.В., Скопенко О.В., Остапченко Л.І.
Перекисне окислення ліпідів та стан антиоксидантної системи при різних
експериментальних моделях виразки шлунку // Фізика живого. – 2003.-
Т. 11, №1.- С.84-88. (Здобувачем проаналізовано літературу, проведено
відбір матеріалу, здійснено математичну обробку та інтерпретацію
результатів експерименту, підготовлено матеріали до друку).

Ковальова В.А., Дробінська О.В., Проценко Т.Л., Остапченко Л.І. Вміст
продуктів вільнорадикального окиснення ліпідів та стан антиоксидантної
системи в тимоцитах щурів при експериментальній аспіриновій виразці
шлунка // Вісник Київського національного університету імені Тараса
Шевченка. Біологія. – 2003.- Вип.39.- С.27-28. (Здобувачем
проаналізовано літературу, особисто досліджено вміст продуктів
пероксидації ліпідів в гомогенаті слизової оболонки шлунка та тимоцитах
щурів, проведено математичну обробку та аналіз результатів, підготовлено
матеріали до друку).

Кучеренко М.Є., Остапченко Л.І., Ковальова В.А., Дробінська О.В.,
Скопенко О.В. Процеси пероксидного окиснення та стан антиоксидантної
системи в слизовій оболонці шлунка щурів при експериментальній стресовій
виразці // Доповіді Національної академії наук України. – 2004.- №1.-
С.162-164. (Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено активність
ферментів, проведено інтерпретацію отриманих експериментальних даних, їх
математичну обробку, підготовлено матеріали до друку).

Ковальова В.А., Скопенко О.В., Гавриш Л.І., Остапченко Л.І. Стан
системи пероксидного окиснення ліпідів у гомогенаті слизової оболонки
шлунка та тимоцитах щурів за умов розвитку експериментальної виразки //
Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Біологія. – 2003.- Вип. 40.- С.62-63. (Здобувачем проаналізовано
літературу, особисто визначено вміст продуктів пероксидації ліпідів та
активність антиоксидантних ферментів в гомогенаті слизової оболонки
шлунка щурів, проведено інтерпретацію отриманих експериментальних даних,
їх математичну обробку, підготовлено матеріали до друку).

Гавриш Л.І., Остапченко Л.І., Ковальова В.А. Активність протеїнкіназ
клітин слизової оболонки шлунку за умов розвитку експериментальної
моделі виразки // Фізика живого. – 2003.- Т. 11, №2.- С.101-105.
(Здобувачем проаналізовано літературу, досліджено активність
протеїнкіназ в мембранах клітин слизової оболонки шлунка щурів,
проведено інтерпретацію отриманих експериментальних даних, їх
математичну обробку, підготовлено матеріали до друку).

Ковальова В.А., Дробінська О.В., Остапченко Л.І. Вплив сквалену на
процеси пероксидного окиснення ліпідів слизової оболонки шлунка щурів
при експериментальній виразці // Вісник Київського національного
університету імені Тараса Шевченка. Біологія. – 2003.- Вип.
41 .- С.112-113. (Здобувачем проаналізовано літературу, особисто
визначено вміст продуктів пероксидації ліпідів та активність
антиоксидантних ферментів в гомогенаті слизової оболонки шлунка щурів,
проведено інтерпретацію отриманих експериментальних даних, їх
математичну обробку, підготовлено матеріали до друку).

Гавриш Л.І., Ковальова В.А., Хілько Т.Д. Дослідження
активності 5’-нуклеотидази, Са2+, Mg2+ -АТФази та Na+, K+- АТФази в
плазматичних мембранах клітин слизової оболонки шлунку за умов
експериментальних моделей виразки шлунку //Тези доповідей Установчого
з’їзду Українського товариства клітинної біології. – Львів, 2004.-
С.240.

Дробинская О.В., Ковалева В.А., Чайка В.А. Состояние окислительного
гомеостаза у лиц, проживающих на территории загрязненной радионуклидами
// Тезисы докладов 3-го Международного симпозиума “Механизмы действия
сверхмалых доз”.- Москва, 2002.- С.77.

Ковальова В.А., Скопенко О.В., Дробінська О.В. Вплив меланіну на
процеси пероксидації ліпідів у гомогенаті слизової оболонки шлунка за
умов розвитку експериментальної моделі виразки // Тези доповідей Х
Конгресу Світової Федерації Українських лікарських товариств. –
Чернівці, 2004.- С.288.

Ostapchenko L.I., Kovalyova V.A., Seleznyova L.I. Scvalen influence on
the lipids peroxidation processes in the way of aspirin stomach ulcer //
International conference “Neuro-humoral and cellular regulatory
mechanisms of digestion processes”. – L’viv, 2003. – P.30-31.

АНОТАЦІЯ

Ковальова В.А. Вплив пероксидації ліпідів на стан слизової оболонки
шлунка щурів за умов розвитку виразки. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню біохімічних механізмів
виникнення виразкових патологій шлунка за умов експериментальних
виразок, оцінці стану біологічних мембран клітин слизової за даних умов
та пошуку речовин природного походження як основи для створення
профілактичних та лікувальних засобів. В результаті проведених
досліджень встановлено особливості активації процесів перекисного
окиснення ліпідів на трьох моделях (аспіриновій, стресовій та
етаноловій) виразки шлунка. Показано, що пероксидація ліпідів є
провідним фактором виразкоутворення, а порушення ліпоперокисного
гомеостазу в цілому обумовлене виснаженням антиоксидантної системи.
Виявлені зміни ліпідного складу плазматичних мембран клітин слизової
оболонки шлунка, які свідчать про пошкодження структури мембран,
призводять до порушення її функцій, а саме до зміни активності
мембранозв’язаних ферментів та порушення в системі функціонування
циклонуклеотидзалежних, Са-фосфоліпідзалежних та тирозинових
протеїнкіназ. Ці зміни різнонаправлені за різних моделей виразок,
що, можливо, пов’язано зі змінами
функціонування Са-поліфосфоінозитидного та аденілатциклазного
месенджерних каскадів. Встановлено, що тирозинові протеїнкінази є
чутливим ланцюгом в каскадах трансдукції сигналів та відіграють провідну
роль в інтеграції зовнішніх і внутрішніх стимулів при виразкоутворенні.
Показано позитивний вплив на показники досліджуваної системи
біологічно-активних сполук (сквалену і меланіну). На підставі
експериментальних результатів запропоновано їх використання як основи
при розробці фармакологічних препаратів для комплексного лікування та
профілактики виразкової хвороби.

Ключові слова: експериментальна модель виразки, слизова оболонка шлунка,
плазматичні мембрани, ліпіди, мембранозв’язані ферменти.

АННОТАЦИЯ

Ковалева В.А. Влияние пероксидации липидов на состояние мембран клеток
слизистой оболочки желудка крыс при экспериментальной язве. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет
имени Тараса Шевченко, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению биохимических механизмов образования язвы
желудка, оценке интегрального состояния биорегуляторных процессов при
данной патологии и подборке веществ природного происхождения, которые
могут быть использованы для создания профилактических и лечебных
препаратов при язвенной болезни желудка. В результате проведенных
исследований было установлено, что активация процесса пероксидации
липидов проходит по-разному в зависимости от вида экспериментальной
модели язвы, а также, что процесс перекисного окисления является
основополагающим фактором язвообразования. Нарушение липоперекисного
гомеостаза, в целом, связано с нарушением антиоксидантной системы:
снижением активности супероксиддисмутазы и каталазы. Таким образом,
изменения процесса перекисного окисления липидов свидетельствует о
нарушении структуры липидов мембран клеток слизистой оболочки желудка.

Установленные изменения липидного состава плазматических мембран клеток
слизистой оболочки желудка свидетельствуют о нарушении структуры
мембран, что, возможно, и есть основной причиной нарушения их функций.
Установлены изменения активности мембраносвязанных ферментов и нарушения
в системе функционирования как циклонуклеотидзависимых, так и
Са-фосфолипидзависимой протеинкиназ. Эти изменения разнонаправленные при
разных моделях язвы, что может быть связано с изменениями
функционирования Са-полифосфоинозитидного и аденилатциклазного
мессенджерных каскадов.

Установлено, что тирозиновые протеинкиназы являются чувствительным
звеном в каскадах трансдукции сигналов и играют ведущую роль в
интеграции внешних и внутренних стимулов при язвообразовании.

Применение биоактивных веществ (сквалена и меланина) нормализовало
состояние исследованной системы. Вынесено предложение по их
использованию для разработки фармакологических препаратов в комплексном
лечении язвенной болезни желудка.

Ключевые слова: экспериментальная модель язвы, слизистая оболочка
желудка, плазматические мембраны, липиды, мембраносвязанные ферменты.

SUMMARY

Kovalyova V. A. Lipid peroxidation processes influence state of cells
mucous stomach membranes in the way ulcer. – Manuscript.

The thesis for PhD degree in speciality o3.00.04 – Biochemistry. – Taras
Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, 2005.

The dissertation is devoted to investigation of problem blistering
stomach’s ulcer in the way differenties exsperiment model ulcer,
appraisal integration state bioregulation system in the way this
pathology and seek new natural preparation for originate ulcer medicine.

Results of the investigation showed, that in the way different
experimental ulcer the stomach mucous capsule of rats lipid peroxidation
processes is principal factor by this pathology. When pathology
development studying enzyme activities of antioxidant protection had an
ability to establish statistically SOD and katalase decreasing
activities. The disturbances of lipid peroxidatoin processes at single
infringement structure of membranes. Infringment structure of membranes
setting to function changes them: statistically it was established
decreasing activities membranes enzymes and infringement in system of
function cyklonukleotid- and Ca, phospholipid – dependent proteinkinase.
This changes is different in the way models ulcer. It was concerned with
changes to function of Ca-
polyphosphoinositid and adenilatciklase kaskads.

Install ,that tyrosine proteinkinase to play a part in integration
outside and inside stimuls in the way ulcer.

These data show, that scvalen and melanin have antioxidant properties
and it can be used for profilactic and complex treatment of stomach
ulcer.

Key words: experimental model ulcer, mucous stomach, plazmatic’s
membranes, lipids, enzymes of membranes.

PAGE \* Arabic 1

Мкмоль /мг хв /мг?хв vuvvuмг?хв

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020