.

Посилення трансдермального введення похідних 1,4-бенздіазепіну (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
95 2232
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Ларіонов Віталій Борисович

УДК 615.032:547.891.2

Посилення трансдермального введення похідних 1,4-бенздіазепіну

02.00.10 – біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Одеському національному університеті ім. І.І.
Мечникова.

Науковий керівник кандидат хімічних наук,

КРАВЧЕНКО Ірина Анатоліївна,

Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова,

професор кафедри фармацевтичної хімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник

ГАЛАТЕНКО Наталія Андріївна,

Інститут хімії високомолекулярних сполук НАН України, завідувач відділу
полімерів медичного призначення

доктор біологічних наук

ГАЛКІН Борис Миколайович,

Одеський національний університет ім. І.І.Мечникова, головний науковий
співробітник проблемної науково-дослідної лабораторії синтезу лікарських
препаратів

Провідна установа Державний науковий центр лікарських засобів НАН та МОЗ
України, лабораторія біохімічної фармакології, м. Харків.

Захист відбудеться 20 травня 2005 р. о 10-й годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії
та нафтохімії НАН України

(02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Інституту
біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Автореферат розісланий 20 квітня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
Д. М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Створення нових ефективних лікарських препаратів є
одним з важливих завдань біоорганічної хімії. Серед шляхів його
вирішення є розроблення методів хімічної модифікації молекул відомих
лікарських засобів з метою отримання більш активних аналогів.

Враховуючи зростання кількості неврологічних та психічних захворювань,
при лікуванні яких застосовуються похідні 1,4-бенздіазепіну, що
викликають побічну снотворну та міорелаксаційну дію, багато уваги
приділяється методам корекції цих наслідків за допомогою синтезу нових
похідних 1,4-бенздіазепіну або розробкою нетрадиційних шляхів їх
введення.

Найбільш перспективним є використання у таких випадках трансдермального
введення, яке забезпечує стабілізацію концентрації лікарської речовини в
організмі, пролонгує фармакологічну дію та зменшує ступінь метаболізму
препарату при першому проходженні через печінку.

Лікарська речовина (ЛР), яка використовується для трансдермального
введення, повинна задовольняти наступним вимогам: проникати крізь
непошкоджену шкіру, впливати на організм в малих концентраціях та не
надавати місцево-подразнюючої й алергізуючої дії.

Якщо кількість препарату, що проникає крізь шкіру, недостатня для
надання бажаного фармакологічного ефекту, проникність шкіри може бути
підвищена різними способами, найзручнішими з яких є використання
хімічних підсилювачів проникності або хімічна модифікація молекул ЛР.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами та темами. Робота була
виконана на базі навчально-науково-виробничого комплексу Одеського
національного університету ім. І.І. Мечникова МОН України та
Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України в рамках
теми: “Синтез і структурно-функціональне вивчення лігандів рецепторів
ЦНС, GP IIb/IIIa та нуклеїнових кислот” (2002-2004, № держреєстрації –
0120001465).

Мета і завдання дослідження – розробка методів посилення проникнення
похідних 1,4-бенздіазепіну крізь шкірні шари.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні
завдання:

вивчити вплив хімічних підсилювачів (кислот, спиртів та ін.) на
проникність шкіри в залежності від їх будови в експериментах in vitro та
in vivo;

дослідити залежність проникності шкіри для похідних 1,4-бенздіазепіну з
різними значеннями ліпофільності під дією підсилювачів;

вивчити вплив найефективнішого підсилювача проникності на біокінетику
феназепаму при трансдермальному введенні;

одержати та дослідити нові хімічно модифіковані похідні
1,4-бенздіазепіну з підвищеною здатністю проникати крізь неушкоджену
шкіру.

Об’єкт дослідження – трансдермальне проникнення похідних
1,4-бенздіазепіну.

Предмет дослідження – посилення проникності шкіри для похідних
1,4-бенздіазепіну.

Методи дослідження – спектроскопічні, радіоізотопні, фармакологічні,
статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

показано збільшення проникності шкіри для похідних 1,4-бенздіазепіну під
впливом вищих аліфатичних кислот, спиртів та ряду солей алкілпіридинію;

показано, що величина зміни проникності шкіри при дії підсилювачів
трансдермальної проникності залежить від переважного механізму їх дії та
ліпофільності похідних 1,4-бенздіазепіну;

показано, що застосування лауринової кислоти як підсилювача проникності
шкіри, змінює профіль протисудомної дії феназепаму при його
трансдермальному введенні, збільшуючи біодоступність в 3-4 рази;

вперше показана можливість оптимізації фармакотерапевтичної дії похідних
1,4-бенздіазепіну при їх трансдермальному введенні шляхом створення
біологічно активної речовини, що складається з фрагментів молекул
активної речовини та підсилювача проникності.

Практичне значення одержаних результатів. Використання підсилювачів
проникності дозволяє скоротити час досягнення терапевтичної концентрації
лікарської речовини в організмі і підтримувати її на необхідному
терапевтичному рівні протягом тривалого часу.

Застосування лауринової кислоти як підсилювача проникності шкіри для
феназепаму, дозволило збільшити його біодоступність при трансдермальному
введенні.

Синтезовано нову біологічно активну речовину – лауриловий естер
7-бром-5-(о-хлорфеніл) -1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, що легко
проникає крізь шкіру та має пролонговану фармакологічну дію при
трансдермальному введенні.

Особистий внесок здобувача. Автором проведений патентно-інформаційний
пошук, виконана експериментальна частина (нові речовини були синтезовані
у відділі медичної хімії ФХІ ім. О.В.Богатського НАН України, Одеса),
проведена статистична обробка результатів експериментів та сформульовані
висновки.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи
доповідались на 57-ій науковій конференції навчально-викладацького
складу та науковців (Одеса, 2002), V конференції молодих учених та
студентів-хіміків південного регіону України (Одеса, 2002 р.),
міжнародній науково-практичній конференції “Нові технології отримання та
використання біологічно-активних речовин” (Алушта, 2002),
науково-практичній конференції “Сучасні технології органічного синтезу
та медичної хімії” (Харків, 2003 р.), IV Українській науково-практичній
конференції “Актуальні питання фармакології” (Вінниця, 2004 р.),
Neuroscience 2003 (New Orleans, 2003) та XX Українській конференції
органічної хімії (Одеса, 2004).

Публікації. За матеріалами роботи опублікована 1 монографія, 7 статей та
тези 6 доповідей на міжнародних та вітчизняних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 138
сторінках машинопису і складається із вступу, п’яти розділів, висновків
та списку літератури. Робота містить 30 рисунків, 37 таблиць та список
використаних джерел, що налічує 264 найменування.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Вивчення проникності рогового шару in
vitro проводилося за допомогою дифузійної комірки Франца вертикального
типу, що містить роговий шар як напівпроникну мембрану. Зміна
проникності рогового шару оцінювалася по зміні кількості 14С-феназепаму,
який проникає крізь нього, що визначається в акцепторній рідині методом
рідинної сцинтиляційної фотометрії.

Зміну структури рогового шару при дії на нього підсилювачів проникності
визначали методом Фурье ІЧ спектроскопії.

Ступінь екстракції ліпідів з рогового шару визначали гравіметрично після
експозиції наважки рогового шару в розчині підсилювачів проникності в
1,2-пропіленгліколі. Загальний сумарний вміст ліпідів в роговому шарі
визначали за методом Фолча, екстрагуючи їх сумішшю хлороформ:метанол.

Вміст екстрагованого з рогового шару холестерину визначали в розчинах
1,2-пропіленгліколю фотоколориметрично по методу Лібермана-Бурхарда.

Протисудомний ефект похідних 1,4-бенздіазепіну визначали методом
внутрішньовенної інфузії коразолу, з подальшою реєстрацією мінімальних
ефективних доз, що викликають клоніко-тонічні судоми (ДКТС) та тонічну
екстензію (ДТЕ) експериментальних тварин.

Визначення вмісту радіоактивних продуктів в органах та тканинах
експериментальних тварин (миші-самці) при трансдермальному введенні
феназепаму проводилося методом рідинної сцинтиляційної фотометрії після
попередньої аплікації матриць, що містять 14С мічений препарат та
підсилювачі трансдермальної проникності.

Вміст в тканинах 3-гідроксифеназепаму та його лаурилового естеру після
трансдермального введення лаурату 3-гідроксифеназепаму визначали методом
тонкошарової препаративної радіохроматографії, заздалегідь екстрагуючи
ліпофільні речовини з крові та гомогенатів органів хлороформом, з
подальшим визначенням в них кількості радіоактивного матеріалу.

Результати дослідження і їх обговорення. Основними факторами збільшення
трансдермальної проникності є порушення структури ліпідів та протеїнів
рогового шару, збільшення гідратації, зміна ступеня розподілу препарату
та розчинника в роговому шарі, а також екстракція з нього ліпідів. Для
різних хімічних речовин ефект дії підсилювачів проникності визначається
переважним механізмом їх дії на роговий шар шкіри.

Використання методів in vitro дозволяє вивчати процес трансдермального
проникнення речовини в ретельно контрольованих умовах. Найпоширенішим
методом вивчення проникності шкіри в умовах in vitro, є процес дифузії
препарату крізь шкіру за допомогою дифузійної комірки Франца
(вертикального або горизонтального типу), що містить як напівпроникну
мембрану зразки шкіри або рогового шару, які здійснюють бар’єрну
функцію. Збільшення проникності рогового шару є наслідком зміни його
структури під впливом хімічних підсилювачів проникності та кількісно
може бути оцінене по зміні величини швидкості дифузії крізь нього
лікарської речовини.

Використання як підсилювачів проникності аліфатичних кислот (табл. 1)
значно підвищує швидкість дифузії 14С-феназепаму крізь роговий шар у
порівнянні з контролем. Вплив кількості атомів вуглецю в алкільному
ланцюзі аліфатичної кислоти на швидкість дифузії феназепаму крізь
роговий шар носить параболічний характер, при цьому максимальний
підсилюючий ефект має лауринова кислота.

Таблиця 1

Вплив аліфатичних кислот на швидкість дифузії 14С-феназепаму крізь
роговий шар in vitro

Підсилювач Швидкість дифузії, мкг·год-1·(см2)-1

Контроль 0,36?0,09

Енантова 0,83?0,25

Капронова 1,24?0,12***

Лауринова 1,92?0,11**

Тридеканова 1,72?0,22

Міристинова 1,67?0,17**

Пальмітинова 0,86?0,08*

Стеаринова 0,61?0,08

Вокозанова 0,42?0,11

Примітка: * – р ? 0,05, ** – р ? 0,01, *** – р ? 0,001 (у порівнянні з
контролем).

При використанні аліфатичних спиртів (табл. 2) залежність швидкості
дифузії 14С-феназепаму від кількості атомів вуглецю в радикалі носить
складний характер, що пов’язано з різними переважними механізмами дії
цієї групи підсилювачів проникності. Так, з нижчих аліфатичних спиртів
максимальну підсилюючу дію виявляє пентанол, а з вищих – тридеканол та
тетрадеканол.

Можливо, виявлені відмінності підсилюючої дії аліфатичних спиртів та
кислот є наслідком різних механізмів зміни структури рогового шару при
дії вказаних речовин.

Таблиця 2

Вплив аліфатичних спиртів на швидкість дифузії 214С-феназепаму крізь
роговий шар в експериментах in vitro

Підсилювач Швидкість дифузії, мкг·год-1·(см2)-1

Контроль 0,36?0,09

Метанол 0,93?0,37*

Етанол 0,94?0,15**

Пропанол-2 0,91?0,14**

Бутанол 0,95?0,17**

Пентанол 1,04?0,34**

Октанол 1,39?0,26**

Додеканол 1,00?0,05***

Тридеканол 1,36?0,18**

Тетрадеканол 1,16?0,17**

Примітка: * – р ? 0,05, ** – р ? 0,01, *** – р ? 0,001 (у порівнянні з
контролем)

Для підтвердження механізмів збільшення трансдермального проникнення
використовувався метод ІЧ Фурье спектроскопії.

Відомо, що внаслідок порушення розташування ліпідних алкільних ланцюгів
збільшується їх конформаційна рухливість, що приводить до зміни їх ІЧ
спектрів поглинання. Більшість ІЧ спектральних частот рогового шару може
бути приписано молекулярним коливанням ліпідів або білків. Вуглеводневі
ланцюги ліпідів дають симетричні та антисиметричні СН2-коливання при
2848 та 2918 см-1. Збільшення свободи та рухливості вуглеводневих
ланцюгів ліпідів рогового шару виявляється в зміні інтенсивності смуг
поглинання С-Н груп. Флюїдизація ліпідів рогового шару визначається по
збільшенню інтенсивності та площі смуг коливань С-Н зв’язків метиленових
груп.

Обробка рогового шару 1,2-пропіленгліколем (ПГ) або його сумішшю з
аліфатичними кислотами приводить до зміни величини поглинання в області,
яка характерна для поглинання –СН2- груп алкільних ланцюгів (валентні
коливання у області 2850 та 2918 см-1) та збільшенню площі цих піків, що
є наслідком збільшення їх конформаційної рухливості (табл. 3). Зменшення
виразності піків та їх практично повне злиття обумовлено збільшенням
області поглинання метиленових груп. Аналогічні зміни спостерігаються
при обробці рогового шару вищими аліфатичними спиртами (табл. 4).

Слід, проте, відзначити, що при обробці рогового шару вищими
аліфатичними спиртами зміни в спектрах поглинання у області 2848 та 2918
см-1 носять набагато більш виражений характер, що свідчить про значно
більший вплив вищих аліфатичних спиртів на розташування алкільних
ланцюгів ліпідів (табл. 4).

Таблиця 3

Залежність інтенсивності та площі піків ІЧ спектрів поглинання рогового
шару при 2848 та 2918 см-1, обробленого розчинами деяких аліфатичних
кислот

в 1,2-пропіленгліколі

Підсилювач Інтенсивність, I

Площа піку

До обробки

Після обробки

До обробки Після обробки

ПГ 3,6 ? 0,2** 3,9 ? 0,2** 182,2 ? 4,2** 930,2 ? 4,8**???

ПГ+Капронова кислота 1,9 ? 0,3*

2,4 ? 0,5** 2,1 ? 0,1*

2,6 ? 0,4** 581,5 ? 70,2*

137,3 ? 9,6** 597,1 ? 111,9*

151,1 ? 10,9**

ПГ+Лауринова кислота 1,9?0,3*

2,3?0,5** 2,9?0,1*??

4,8?0,9**? 574,4?64,8*

133,1?10,1** 818,6?214,6*

149,7?3,7**

ПГ+Міристинова кислота 1,5 ? 0,2*

1,8 ? 0,3** 1,9 ? 0,1*

2,4 ? 0,4** 508,6 ? 44,1*

103,2 ? 6,2** 595,9 ? 116,2*

146,1 ? 10,6**???

Примітка: * – максимум смуги поглинання -2848 см-1

** – максимум смуги поглинання -2918 см-1

? – р ? 0,05, ?? – р ? 0,01, ??? – р ? 0,001 (у порівнянні з
необробленим зразком)

Таблиця 4

Залежність інтенсивності та площі піків ІЧ спектрів поглинання рогового
шару при 2848 та 2918 см-1, обробленого розчинами вищих аліфатичних
спиртів

в 1,2-пропіленгліколі

Підсилювач Інтенсивність, I

Площа піку

До обробки

Після обробки

До обробки

Після обробки

ПГ 3,6 ? 0,2** 3,9 ? 0,2** 182,2 ? 4,2** 930,2 ? 4,8**???

ПГ+Октанол 1,7 ? 0,2*

2,1 ? 0,4** 1,9 ? 0,1*

2,3 ? 0,4** 492,3 ? 57,9*

118,1 ? 8,8** 523,5 ? 101,1*

139,4 ? 10,9**

ПГ+Додеканол 2,1 ? 0,2*

2,4 ? 0,4** 2,3 ? 0,1*

2,8 ? 0,5** 639,3 ? 68,9*

144,7 ? 9,2 659,1 ? 136,9*

174,1 ? 11,9**?

ПГ+Тридеканол 2,2 ? 0,3*

2,6 ? 0,5** 2,3 ? 0,1*

2,8 ? 0,2** 677,5 ? 76,5*

146,3?11,5** 816,8 ? 117,3*

178,5 ? 4,7**??

ПГ+Тетрадеканол 1,9 ? 0,2*

2,3 ? 0,4** 2,6 ? 0,2*?

3,2 ? 0,6** 611,7 ? 57,3*

135,8 ? 8,7** 679,8 ? 166,*

193,8 ? 16,3**??

Примітка: * – максимум смуги поглинання -2848 см-1

** – максимум смуги поглинання -2918 см-1

? – р ? 0,05, ?? – р ? 0,01, ??? – р ? 0,001 (у порівнянні з
необробленим зразком)

Як видно з наведених даних (табл. 3,4), вплив вищих аліфатичних кислот
та спиртів на ліпідні компоненти шкіри є одним з важливих механізмів, за
допомогою яких досягається збільшення її проникності. Вказаний механізм
дії може реалізуватися при застосуванні не тільки аліфатичних кислот та
спиртів, а й поверхнево–активних речовин (ПАР), які можуть зменшувати
поверхневий натяг на межах розподілу фаз. Вивчення як підсилювачів
проникності катіонних ПАР, зокрема, солей алкілпіридинію, має практичний
інтерес, оскільки, хоча в доступній літературі є обмежене число даних по
їх впливу на проникність шкіри, була продемонстрована можливість
значного збільшення проникності при їх застосуванні [Achton P., 1992].

У ІЧ спектрах поглинання зразків рогового шару, обробленого розчинами
солей алкілпіридинію в 1,2-пропіленгліколі, спостерігається значна зміна
форми смуг поглинання при 2918 і 2848 см-1 (табл. 5), що є наслідком
зміни конформаційної рухливості алкільних ланцюгів та загальним
розупорядкуванням ліпідних областей мембран. При цьому також помітна
зміна інтенсивності та збільшення площі піків, що відображує збільшення
ступеня свободи алкільних ланцюгів ліпідів (табл. 5).

Таблиця 5

Залежність інтенсивності та площі піків ІЧ спектрів поглинання рогового
шару при 2848 та 2918 см-1, обробленого розчинами солей алкілпіридинію

в 1,2-пропіленгліколі

Підсилювач Інтенсивність, I

Площа піку

До обробки

Після обробки

До обробки

Після обробки

ПГ 3,6 ? 0,2** 3,9 ? 0,2** 182,2 ? 4,2** 930,2 ? 4,8**???

ПГ+Децилпіридиній хлорид 1,9 ? 0,3*

1,9 ? 0,1** 2,1 ? 0,1*

2,4 ? 0,3**? 571,8 ? 63,3*

85,1 ? 0,5** 665,8 ? 82,6*

154,4 ? 8,3**???

ПГ+Додецилпіридиній хлорид 1,9 ? 0,1*

1,8 ? 0,2*

2,2 ? 0,5** 83,3 ? 0,6*

541,5 ? 66,5*???

129,5 ? 9,7**

ПГ+Тетрадецил-піридиній хлорид

2,3 ? 0,4** 2,6 ? 0,2*

3,2 ? 0,6**

135,8 ? 8,7** 679,7 ? 166,4*

193,8 ? 16,3**??

ПГ+Цетилпіридиній хлорид 1,6 ? 0,2*

1,9 ? 0,4** 2,1 ? 0,2*

2,5 ? 0,5** 514,9 ? 46,7*

114,3 ? 8,2** 612,6 ? 102,4*

155,5 ? 11,5**??

Примітка: * – максимум смуги поглинання -2848 см-1

** – максимум смуги поглинання -2918 см-1

? – р ? 0,05, ?? – р ? 0,01, ??? – р ? 0,001 (у порівнянні з
необробленим зразком)

Зміна конформації білків також є одним з важливих механізмів збільшення
проникності рогового шару. Найбільш інформативними та показовими в ІЧ
спектрах рогового шару є валентні коливання білків – амід I та амід II
при 1640 та 1550 см-1. Смуга поглинання амід I обумовлена валентними
коливаннями С=О, а амід II – С-N валентними та N-Н коливаннями вигину.
Частоти цих двох зв’язків, особливо зв’язку амід I, чутливі та
зміщуються в бік вищих або нижчих частот відповідно до змін в
конформації білків. У роговому шарі, обробленому вказаними розчинниками,
спостерігається істотне зменшення висоти та площі піків, що також
свідчить про зміну конформації білків після обробки. Такі розчинники, як
метанол, етанол, можливо, сприяють набуханню та розгортанню протеїнів в
клітинах рогового шару, що приводить до зміни третинної структури білків
внаслідок заміщення пов’язаних з протеїнами молекул води.

Таким чином, розглянуті підсилювачі проникності надають комплексний
вплив на шкіру, що приводить до збільшення її проникності. Проте, можна
виділити переважні напрями зміни структури рогового шару – збільшення
рухливості гідрофобних вуглеводневих радикалів (при застосуванні
розчинників та речовин, що містять вуглеводневі радикали – аліфатичних
кислот та спиртів), а також вплив на білки рогового шару.

Разом із зміною упаковки алкільних ланцюгів та збільшенням їх
розупорядкування підвищення проникності шкіри досягається частковою
екстракцією ліпідів рогового шару та зміною розподілу проникаючої
речовини в інтерцелюлярному матриксі внаслідок збільшення його
розчинності. Цей механізм дії характерний для нижчих аліфатичних спиртів
та 1,2-пропіленгліколю, які мають достатньо високу розчинну здатність.
Малі розміри молекул розчинника дозволяють йому проникати в гідрофобні
ділянки бішару, викликаючи зменшення мікров’язкості мембран та
поліпшуючи трансмембранну дифузію. Використання як чистого
1,2-пропіленгліколю, так і його сумішей з нижчими аліфатичними спиртами
приводить до значної екстракції ліпідів із зразків рогового шару (табл.
6).

Вміст холестерину в роговому шарі та ступінь його екстракції при обробці
шкіри підсилювачами проникності також є важливими чинниками, що
обумовлюють її проникність.

В ході досліджень було показано, що через 24 години експозиції
1,2-пропіленгліколем з рогового шару екстрагується ~ 50 % холестерину,
який знаходиться в ньому (загальний вміст холестерину в роговому шарі
складає 23,6 % від загального вмісту ліпідів) (табл. 6). У присутності
спиртів кількість екстрагованого холестерину зростає на 10-20 %.
Імовірно, збільшення проникності рогового шару під дією нижчих спиртів
пояснюється екстракцією холестерину з мембран, збільшенням розчинності
речовини, що проникає, до міжклітинного матриксу та накопиченням молекул
аліфатичного спирту в гідрофобних регіонах ліпідних мембран.

Таблиця 6

Вплив 1,2-пропіленгліколю та розчинів нижчих аліфатичних спиртів на
ступінь екстракції ліпідів та холестерину з рогового шару in vitro

Підсилювач проникності % екстракції ліпідів % екстракції холестерину

Пропіленгліколь (ПГ) 67 ± 2 33 ± 3

Метанол + ПГ 68 ± 2 63 ± 2??

Етанол + ПГ 73 ± 2 71 ± 3??

Пропанол-2 + ПГ 62 ± 1 71 ± 1???

Бутанол + ПГ 62 ± 2 69 ± 2???

Пентанол + ПГ 71 ± 2 66 ± 1???

Примітка: ?? – р ? 0,01, ??? – р ? 0,001 (у порівнянні з
1,2-пропіленгліколем)

Таким чином, ефект розглянутих підсилювачів проникності є комплексним та
обумовлений поєднанням різних механізмів дії.

Речовини з різним значенням ліпофільності проникають крізь шкіру,
використовуючи крізьклітинний, міжклітинний, або обидва шляхи
проникнення. Очевидно, що збільшення проникності шкіри буде максимальним
та найефективнішим, якщо підсилювач буде впливати на переважний шлях
проникнення молекул препарату. Таким чином, необхідним є вивчення
посилення проникності шкіри під дією підсилювачів проникності для
речовин, що мають різне значення ліпофільності.

b

?

?

?OF

|

`

b

?

oe

b°?F

?

O

O

O

O

„ ¤^„Ae`„

O

O

O

O

O

&

O

O

ph

O

O

O

O

O

O

O

O

O

$

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

„ ¤`„lkd?

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

$

O

Oe0@

@

$

O

O

O

O

O

@

@

O

O

O

O

O

O

O

$

O

O

O

$

O

O

O

O

O

O

я подальшого використання їх у складі ТТС. Крім того, в дослідах in vivo
можна оцінити зміну фармакокінетичних параметрів ТТС та вивчити
фармакологічну дію препарату в залежності від зміни складу лікарської
форми.

Вивчення збільшення проникності шкіри для похідних 1,4-бенздіазепіну,
які мають різне значення ліпофільності (рис. 1), проводилося в умовах in
vivo по антагонізму з коразолом.

феназепам,

log P = 3,0 3-гідроксифеназепам,

log P= 2,1 клоназепам,

log P = 1,6

Рис. 1. Похідні 1,4-бенздіазепіну з різним значенням ліпофільності

Застосування як підсилювачів трансдермального проникнення аліфатичних
кислот приводить до нерівномірного збільшення МЕД коразолу при аплікації
матриць, які містять феназепам, при цьому величина протисудомного
ефекту, що реєструється, залежить від кількості атомів вуглецю в
алкільному ланцюзі, як і швидкість дифузії його крізь роговий шар in
vitro (табл. 1).

Одержані дані свідчать, що нижчі аліфатичні кислоти трохи збільшують
проникність шкіри для найбільш ліпофільного феназепаму (log P = 3,0),
тоді як при використанні аліфатичних кислот, що містять від 11 до 15
атомів вуглецю в аліфатичному радикалі, збільшення проникності шкіри
досягає максимальних значень (рис. 2А) та складає 300-400 % від
контрольних значень.

При використанні клоназепаму (log P = 1,6) не спостерігається
статистично достовірного збільшення протисудомної дії, що свідчить про
недостатній вплив аліфатичних кислот на шляхи проникнення клоназепаму
крізь шкіру (рис. 2 В).

При трансдермальному введенні 3-гідроксифеназепаму, що має проміжне
значення ліпофільності (log P = 2,1) зміна проникності шкіри під дією
аліфатичних кислот носить виражений характер (рис. 2Б), при цьому значну
підсилюючу дію надають як нижчі, так і вищі аліфатичні кислоти,
максимальну підсилюючу дію надає лауринова кислота.

Використання аліфатичних спиртів для похідних 1,4-бенздіазепіну
показало, що, як і при використанні аліфатичних кислот, спостерігається
залежність між ліпофільністю похідних 1,4-бенздіазепіну та переважним
шляхом їх проникнення крізь шкіру.

Рис. 2. Вплив кількості атомів вуглецю в радикалі аліфатичної кислоти на
протисудомний ефект похідних 1,4-бенздіазепіну при їх трансдермальному
введенні (А – феназепам, Б – 3-гідроксифеназепам, В – клоназепам)

Так, для феназепаму (log P= 3,0) найбільший підсилюючий ефект надають
вищі аліфатичні спирти (С12-С14), протисудомний ефект при цьому досягає
400-500 % від контролю (рис. 3А). Для більш гідрофільного клоназепаму
(log P=1,6) найбільша підсилююча дія спостерігається при використанні
нижчих аліфатичних спиртів (С2-С4), тоді як при використанні вищих
аліфатичних спиртів підсилюючий ефект практично не спостерігається (рис.
3В).

Для 3-гідроксифеназепаму (log P = 2,1) підсилюючий ефект найбільш
виражений при використанні як вищих (С13), так і нижчих (С2) аліфатичних
спиртів (рис. 3Б).

Рис. 3. Вплив кількості атомів вуглецю в радикалі аліфатичного спирту на
протисудомний ефект похідних 1,4-бенздіазепіну при їх трансдермальному
введенні (А – феназепам, Б – 3-гідроксифеназепам, В – клоназепам)

Враховуючи, що ліпофільність клоназепаму ще нижча (log P=1,6), він легше
розчиняється в більш полярному ізопропанолі, ніж в менш полярних
спиртах, що й обумовлює його підсилюючий ефект.

Таким чином, було показано, що для досягнення оптимального
фармакологічного профілю використання підсилювачів проникності при
створенні ТТС повинне проводиться з урахуванням ліпофільності активного
компоненту.

Зміна профілю концентрації лікарського препарату в організмі протягом
часу є прямим наслідком зміни фармакокінетичних характеристик лікарської
форми, при цьому використання підсилювачів черезшкірної проникності у
складі трансдермальних форм впливає на такі показники, як середній час
утримання лікарської речовини в організмі та його біодоступність.
Враховуючи, що проникність шкіри для феназепаму найбільшою мірою
змінюється під впливом лауринової кислоти, було вивчено її вплив на
зміну фармакокінетичних параметрів феназепаму при його трансдермальному
введенні.

В результаті збільшення проникності шкіри під дією лауринової кислоти
відбувається зміна фармакокінетичних параметрів трансдермальної форми
феназепаму (ТТС), що виражається в збільшенні середнього часу утримання
(MRT) та абсорбції (MAT) препарату (за даними вмісту радіоактивних
продуктів в плазмі крові) (табл. 7). Також слід зазначити значне (~ у 3
рази) достовірне (p ? 0,01) збільшення біологічної доступності
феназепаму, що свідчить про збільшення ступеня його проникнення крізь
шкіру у внутрішнє середовище організму.

Таблиця 7

Вплив лауринової кислоти на фармакокінетичні параметри феназепаму при
його трансдермальному введенні

Фармакокінетичний параметр ТТС1

ТТС2

Плазма крові

Головний мозок

Плазма крові

Головний мозок

Середній час утримання, MRT, год 19,3 ? 0,3 38 ? 2 32 ? 11 32 ? 13

Середній час абсорбції, MAT, год 13,8 ? 0,5 22 ? 2 27 ? 9* 15 ? 6

Біодоступність, f 0,38 ? 0,01 0,20 ? 0,01 0,9 ? 0,2** 0,83 ? 0,01***

Примітки:

ТТС1 – трансдермальна терапевтична система з феназепамом без лауринової
кислоти;

ТТС2 – трансдермальна терапевтична система з феназепамом, що містить
лауринову кислоту.

* – р ? 0,05, ** – р ? 0,01, *** – р ? 0,001.

Таким чином, використання підсилювачів проникності при трансдермальному
введенні дозволяє збільшити біодоступність активної речовини.

Іншим перспективним способом збільшення проникнення крізь шкіру є
хімічна модифікація молекул лікарських речовин. На підставі одержаних
даних про підсилюючу дію аліфатичних кислот на трансдермальне
проникнення похідних 1,4-бенздіазепіну було синтезовано ряд складних
естерів 3-гідроксифеназепаму та аліфатичних кислот.

Вони були отримані взаємодією 3-гідроксифеназепаму з хлорангидрідом
відповідної кислоти (рис. 4).

Рис. 4. Схема синтезу естерів 3-гідроксифеназепаму та вищих аліфатичних
кислот

При вивченні залежності величини протисудомної дії отриманих естерів при
їх трансдермальному введенні найвищий протисудомний ефект був відмічений
при використанні лаурилового естеру 3-гідроксифеназепаму (рис. 5).

Рис. 5. Залежність величини протисудомної дії складних естерів
3-гідроксифеназепаму при їх трансдермальному введенні

Виходячи з того, що лауриловий естер 3-гідроксифеназепаму виявився
найефективнішим при трансдермальному введенні, було вивчено зміну його
протисудомної дії (по зміні мінімально-ефективних доз коразолу (МЕД), що
викликають клоніко-тонічні судоми (ДКТС) та тонічну екстензію (ДТЕ) у
мишей при його внутрішньовенному введенні) в залежності від часу
аплікації. Помітно (рис. 6), що протисудомний ефект складного естеру при
трансдермальному введенні спостерігається вже в перші години після
аплікації. Він стабільний протягом всього часу експерименту та не
знижується до рівня контрольних значень до 72 годин з моменту аплікації
ТТС, що свідчить про пролонгацію фармакологічної дії.

При немодельній оцінці основних фармакокінетичних параметрів лаурилового
естеру 3-гідроксифеназепаму при його трансдермальному введенні відмічені
високі значення середнього часу утримання (у порівнянні з іншими
похідними 1,4-бенздіазепіну), а також той факт, що константа елімінації
(kel) для нього на порядок нижча показника kel для 3-гідроксифеназепаму
(табл. 8), обумовлює пролонговану дію запропонованої біологічно активної
речовини.

Рис. 6. Залежність величини протисудомної дії лаурилового естеру
3-гідрокси-феназепаму при його трансдермальному введенні.

Таблиця 8

Фармакокінетичні параметри лаурату 3-гідроксифеназепаму при його
трансдермальному введенні

Фармакокінетичний параметр Кров

Мозок

3-гідрокси-феназепам

Лауриловий естер 3-гідрокси-феназепаму

3-гідрокси-феназепам

Лауриловий естер 3-гідрокси-феназепаму

Середній час утримання, MRT, год 61,0 ± 14,3 116 ± 32 1027 ± 278 575 ±
142

Середній час абсорбції, MAT, год 21 ± 5

991 ± 268

Константа елімінації, kel, год-1 0,025 ± 0,005 0,008 ± 0,002 0,028 ±
0,005 0,0018±0,0001

Біодоступність, f 0,09 ± 0,02 0,09 ± 0,02 0,19 ± 0,03 0,51 ± 0,07

Таким чином, в результаті хімічної модифікації було одержано нове
похідне 1,4-бенздіазепіну, яке легко проникає крізь шкіру при
трансдермальному введенні та має пролонговану фармакологічну дію.

ВИСНОВКИ

В дисертації встановлена залежність ефективності трансдермального
введення похідних 1,4-бенздіазепіну від хімічної будови та
фізико-хімічних властивостей підсилювачів проникності. Запропоновані
нові хімічно модифіковані похідні 1,4-бенздіазепіну з підвищеною
здатністю проникати крізь неушкоджену шкіру.

Аліфатичні кислоти, спирти та піридинієві солі значно збільшують
швидкість дифузії феназепаму крізь роговий шар в умовах in vitro, при
цьому максимальний ефект спостерігається при використанні лауринової
кислоти. Залежність підсилюючої дії аліфатичних кислот від кількості
атомів вуглецю в радикалі носить параболічний характер.

Методами ІЧ спектроскопії показані зміни конформаційних станів ліпідів
та білків рогового шару під впливом аліфатичних кислот і спиртів, які
посилюють проникність шкіри.

Посилення трансдермальної проникності під дією нижчих аліфатичних
спиртів обумовлене підвищенням (до 71 %) екстракції холестерину з
рогового шару.

Вибір оптимального підсилювача проникності залежить від ліпофільності
активної речовини. Так, для феназепаму (log P=3,0) проникність шкіри
підвищується при використанні кислот та спиртів з вуглецевим ланцюгом
С11-С13, а для клоназепаму (log P=1,6) – спиртів, що містять від двох
до п’яти атомів вуглецю. При використанні 3-гідроксифеназепаму (log
P=2,1) можливе застосування як тих, так й інших підсилювачів.

При використанні лауринової кислоти як підсилювача трансдермального
введення феназепаму підвищується його біодоступність в 3 рази.

В результаті хімічної модифікації одержано ряд складних естерів
3-гідроксифеназепаму та вищих аліфатичних кислот з підвищеною здатністю
крізьшкірного проникнення. Найбільшу активність проявив лауриловий естер
3-гідроксифеназепаму, пролонгована дія якого обумовлена високим
значенням середнього часу утримання в організмі (більше 100 год) та
низькою константою елімінації.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

И.А.Кравченко, С.А. Андронати, В.Б. Ларионов. Физико-химические основы
усиления трансдермального введения лекарственных препаратов / Одесса:
“Астропринт”, 2002.-224 с.

Вплив жирних кислот та алкілпіридиній хлоридів на ефективність
трансдермального введення феназепаму /В.Б. Ларіонов, І.А. Кравченко,
О.І. Александрова, В.І. Павловський // Фізіол. акт. речовини.-2002.- №
2(34).- С.70-72.

Влияние усилителей проницаемости кожи на трансдермальное введение
феназепама in vitro / И.А. Кравченко, В.Б. Ларионов, А.И. Александрова,
Н.В. Овчаренко, А.А.Полищук, С.А. Андронати //Хим.-фарм. журн. -2003.-
Т.37, № 7.-С.31-35.

Аліфатичні спирти, кислоти та солі алкілпіридинію як підсилювачі
трансдермального проникнення 3-гідроксифеназепаму / О.І. Александрова,
І.А. Кравченко, В.Б. Ларіонов, Н.В. Овчаренко// Медична хімія.-2003.-
т.5, №1.-С.80-82.

Влияние алифатических спиртов на трансдермальное введение феназепама in
vivo / В.Б. Ларионов, И.А. Кравченко, С.А. Андронати, С.И. Щукин //
Хим.-фарм. журн.-2003.- Т. 37, №1.- С.3-5.

Влияние лауриновой кислоты на трансдермальное введение феназепама in
vivo. Кравченко И.А., Головенко Н.Я., Ларионов В.Б., Александрова А.И.,
Овчаренко Н.В. // Бюлл. эксп. биологии и медицины.- 2003.-Т.136,№12.-с.
657-660.

Синтез и фармакологические свойства
3-лаурилокси-7-бром-5-(о-хлор)фенил-1,2-дигидро-3н-1,4-бенздиазепин-2-он
а при его внутривенном и трансдермальном введении / Кравченко И.А.,
Александрова А.И., Андронати С.А., Ларионов В.Б., Овчаренко Н.В.,
Павловский В.И., Тахтарова А.И.// Вестник ОНУ.-2003.- т.8, вып.
8.-С.131-137.

М.Я. Головенко, В.Б. Ларіонов, Кравченко І.А. Вивчення аліфатичних
кислот, спиртів та алкілпіридиній хлоридів як посилювачів черезшкірної
проникності для клоназепаму // Ліки.-2003.-№1-2.- С.65-68.

Ларіонов В.Б. Застосування посилювачів чрезшкіряного проникнення для
трансдермального введення бензодіазепинів. // V Конференція молодих
учених та студентів-хіміків Південного регіону України. Одеса,
2002.-С.38.

Усилители чрезкожной проницаемости для чрезкожного введения /Ларионов
В.Б., Кравченко И.А., Александрова А.И., Овчаренко Н.В., Тахтарова
А.И.// Международная научно-практическая конференция “Новые технологии
получения и применения биологически активных веществ”. – Алушта 2003. –
С. 164.

Кравченко И.А., Ларионов В.Б., Александрова А.И. Усиление
трансдермального проникновения производных 1,4-бенздиазепина //Тези
Всеукраїнської науково-практичної конференції “Сучасні технології
органічного синтезу та медичної хімії”.-Харків, 2003. –С.100.

Laurilhydroxyphenazepam a new derivative of 1.4-benzdiazepine with
prolonged anticonvulsive effect / Kravchenko I.A., Larionov V.B.,
Pavlovsky V.I., Werby E., Andronati S.A. //Abstracts of Neuroscience
2003 – New Orleans, 2003/ – Online.

Сравнительная фармакодинамика новых ацилпроизводных 3-гидроксифеназепама
при их трансдермальном введении / Ларионов В.Б., Мальцев Е.В., Тахтарова
А.И., Кравченко И.А. / Матеріали IV Української науково-практичної
конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології “Актуальні
питання фармакології”.- Вінниця, 2004.-С.82.

Выбор оптимальных усилителей проницаемости для трансдермального введения
лекарственных препаратов /Ларионов В.Б., Тахтарова А.И., Кравченко И.А.,
Овчаренко Н.В., Павловская Е.С. // XX Українська конференція з
органічної хімії. – Одеса, 2004 р. – С. 521.

Ларіонов В.Б. Посилення трансдермального введення похідних
1,4-бенздіазепіну.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 02.00.10 – біоорганічна хімія. Інститут біоорганічної
хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена вивченню можливості посилення трансдермального
проникнення для похідних 1,4-бенздіазепіну. У роботі розглянуті як
підсилювачі проникності шкіри такі хімічні речовини, як аліфатичні
кислоти, спирти, солі алкілпіридинію, а також показана можливість
хімічної модифікації лікарських засобів з метою збільшення їх здатності
проникати крізь шкіру.

Розглянуті механізми збільшення проникності шкіри під дією різних
підсилювачів проникності. Запропонований переважний механізм збільшення
проникності рогового шару при дії аліфатичних спиртів та похідних
алкілпіридинію. Встановлено, що їх підсилюючий ефект є комплексним та
обумовлений впливом на ліпідні і білкові структури рогового шару, а
також частковою екстракцією з нього ліпідів і холестерину.

Виявлено залежність між ліпофільністю похідних 1,4-бенздіазепіну та
збільшенням їх трансдермальної проникності. Для феназепаму (log P = 3,0)
проникність шкіри найбільшою мірою змінюється при використанні вищих
аліфатичних кислот (С11-С15, в 3,5-4 рази) та спиртів (С12-С14, в 3-4,5
рази), тоді як для клоназепаму (log P = 1,6) – під впливом нижчих
аліфатичних спиртів (у 3,5-4 рази). Для 3-гідроксифеназепаму (log P =
2,1) підсилюючий ефект спостерігається при використанні як тих так й
інших підсилювачів трансдермального проникнення.

Застосування лауринової кислоти як підсилювача проникності для
феназепаму приводить до значного збільшення його біодоступності при
трансдермальному введенні (в ~ 3 рази).

З синтезованих естерів 3-гідроксифеназепаму та аліфатичних кислот
найбільшу здатність проникати крізь шкіру має лауриловий естер
3-гідроксифеназепаму. Синтезований препарат має низьку величину
константи елімінації kel, що обумовлює його пролонгований
фармакологічний ефект.

Ключові слова: трансдермальне введення, підсилювачі проникності,
ліпофільність, похідні 1,4-бенздіазепіну.

Ларионов В.Б. Усиление трансдермального введения производных
1,4-бенздиазепина.-Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 02.00.10 – биоорганическая химия. Институт биоорганической
химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению возможности усиления трансдермального
проникновения для производных 1,4-бенздиазепина. В работе рассмотрены в
качестве усилителей проницаемости кожи такие химические соединения, как
алифатические кислоты, спирты, соли алкилпиридиния, а также показана
возможность химической модификации лекарственных веществ с целью
увеличения их способности проникать через кожу.

В экспериментах in vitro продемонстрирована способность алифатических
кислот и спиртов увеличивать проницаемость рогового слоя для феназепама.
Установлено, что усиливаюший эффект при использовании алифатических
кислот носит параболический характер в зависимости от количества атомов
углерода в алифатическом радикале, при этом максимальным воздействием на
роговой слой обладает лауриновая кислота. Также показана возможность
увеличения чрезкожной проницаемости для феназепама при использовании
производных алкилпиридиния.

Рассмотрены механизмы увеличения проницаемости кожи под действием
различных усилителей проницаемости. Установлены основные факторы
воздействия алифатических спиртов и производных алкилпиридиния на
структуры рогового слоя, обуславливающие увеличение его проницаемости.
Установлено, что усиливающий эффект указанных соединений является
комплексным, и обусловлен влиянием на липидные и белковые структуры
рогового слоя, а также частичной экстракцией из него липидов и
значительным (до 70 %) увеличением экстракции содержащегося в роговом
слое холестерина. Методами ИК спектроскопии показано изменение
конформационного состояния алкильных цепей липидов и белков рогового
слоя при воздействии усилителей проницаемости.

В экспериментах in vivo выявлена зависимость между липофильностью
производных 1,4-бенздиазепина и увеличением их проницаемости через кожу
под воздействием различных усилителей трансдермальной проницаемости, что
связано с влиянием на различные структуры рогового слоя. Так, для
феназепама (log P=3,0) проницаемость кожи в наибольшей степени
изменяется при использовании высших алифатических кислот (С11-С15, в
3,5-4 раза) и спиртов (С12-С14, в 3-4,5 раза), тогда как для клоназепама
(log P=1,6) – под воздействием низших алифатических спиртов (в 3,5-4
раза). В случае 3-гидроксифеназепама (log P=2,1) усиливающий эффект
отмечается при использовании и тех и других усилителей трансдермального
проникновения.

Применение лауриновой кислоты в качестве усилителя проницаемости для
феназепама приводит к значительному увеличению его биодоступности при
трансдермальном введении ~ в 3 раза. В присутствии лауриновой кислоты
содержание феназепама в органах и тканях мышей значительно превышает эти
показатели при трансдермальном введении в ее отсутствие.

С целью улучшения трансдермального проникновения был синтезирован ряд
сложных эфиров 3-гидроксифеназепама и алифатических кислот. Из
синтезированных сложных эфиров наибольшей способностью проникать через
кожу обладает лауриловый эфир 3-гидроксифеназепама. При изучении
фармакокинетических показателей и концентрационного профиля
синтезированного препарата при его внутривенном и трансдермальном
введении установлено, что лауриловый эфир 3-гидроксифеназепама обладает
низкой величиной константы элиминации из организма kel, что
обуславливает его пролонгированный фармакологический эффект. Также
показано, что содержание лаурилового эфира 3-гидроксифеназепама и его
физиологически активного метаболита 3-гидроксифеназепама регистрируется
в органах и органах и тканях уже в первые часы после аппликации и
остается на практически постоянном уровне на протяжении всего времени
аппликации (до 72 часов).

Ключевые слова: трансдермальное введение, усилители проницаемости,
липофильность, производные 1,4-бенздиазепина.

Larionov V.B. Transdermal delivery enhancement for 1.4-benzdiazepine
derivatives.-Manuscript.

Thesis for the degree of candidate of biological sciences by speciality
02.00.10 – bioorganic chemistry.- Institute of bioorganic chemistry and
petrochemistry of NAS of Ukraine, Kyiv, 2005.

The aim of the dissertation – the possibility studying of transdermal
delivery enhancement for 1.4-benzdiazepine derivatives. As chemical
permeability enhancers were studied ranges of aliphatic acids, alcohols
and alkylpyridine salts. Also the possibility of active drug chemical
modification with the purpose of increasing its ability to penetrate
through a skin was shown.

The mechanisms of increase of permeability of skin under action of
different permeability enhancers were considered. The enhancement effect
of all chemicals found to be complex, involving influence on both lipid
and protein structures of stratum corneum and partial lipid and
cholesterol extraction.

There was shown the dependence between lipophilicity of
1.4-benzdiazepine derivative and enhancement effect of various chemical
permeability enhancers. For phenazepam (log P=3,0) permeability of skin
is changed mostly when using higher aliphatic acids (C11-C15, in 3,5-4
times) and alcohols (C12-C14, in 3-4,5 times), while for clonazepam (log
P=1,6) – with lower aliphatic alcohols (in 3,5-4 times). In the case of
3-hydroxyphenazepam (log P=2,1) enhancement effect is registered with
both groups of noted permeability enhancers.

Lauric acid, when used as permeability enhancer for phenazepam,
increases its bioavailability ( at ~ 3 times).

Among the range of 3-hydroxyphenazepam and fatty acids esters the
highest ability penetrate skin was noted at lauric ester. The substance
synthesized has prolonged pharmacological effect and circulates the
organism for a long time (has little kel value).

Key words: transdermal delivery, permeability enhancers, lipophilicity,
1.4-benzdiazepine derivatives.

PAGE \* Arabic 1

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020