.

Електрична активність та постсинаптичні струми нейронів культури гіпокампу (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
101 2838
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Москалюк Анастасія Олександрівна

УДК 577.353.5:612.822

Електрична активність та постсинаптичні струми нейронів культури
гіпокампу

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Міжнародному Центрі Молекулярної фізіології та
Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії Наук
України

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор,

чл.-кор. НАН України

Веселовський Микола Сергійович

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

завідувач відділом фізіології нейронних мереж

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України,

Магура Ігор Сильвестрович

Фізико-технічний Навчально-науковий центр

НАН України,

професор кафедри молекулярної фізіології і біофізики

кандидат біологічних наук,

Любанова Ольга Петрівна

Міжнародний центр молекулярної фізіології

НАН України

науковий співробітник

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України.

Захист відбудеться “6” грудня 2005 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ
01024.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ
01024.

Автореферат розісланий листопада 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Однією із властивостей нервових клітин, що забезпечує
їхню здатність до передачі інформації, є електрична збудливість. Велика
увага в сучасній біофізиці синаптичної передачі приділяється вивченню
механізмів електрозбудливості нервової клітини, оскільки імпульсна
електрична активність нейронів є тим ініціюючим фактором, який
призводить до вивільнення нейромедіатора з синаптичних терміналей і
забезпечує, таким чином, синаптичну передачу, яка лежить в основі
процесів обробки інформації в нервовій системі. Постсинаптичні струми,
які при цьому виникають, змінюють поляризацію мембрани постсинаптичної
клітини і, як наслідок, зумовлюють або генерацію та подальше поширення
нервового імпульсу, або блокування його проведення. Сумація вхідних
збуджуючих і гальмівних сигналів визначає численні функціональні
особливості нейрона, в тому числі його інтегративні властивості.

Згідно з сучасними уявленнями гальмівні ГАМК-ергічні інтернейрони є
ключовою ланкою у формуванні специфічних для гіпокампу ритмів
електричної активності і виконують функцію синхронізації роботи
величезної мережі пірамідних нейронів. Показано, що інтернейрони ЦНС
здатні генерувати серії потенціалів дії (ПД) у відповідь на тривале (0,5
– 1 с) прикладання деполяризуючого струму. На основі характеристик таких
серій ПД інтернейрони поділяють на такі, яким притаманна високочастотна
генерація ПД; такі, які генерують викликані ПД ритмічно з низькою
частотою, і такі, які демонструють пачечну активність (Erіsіr et al.,
1999). Одним із основних факторів, який зумовлює відмінності в
параметрах генерації серій ПД, є наявність у цих нейронах різних
комбінацій потенціалзалежних K+-каналів (Martіna et al., 1998;Erіsіr et
al., 1999).

У більшості робіт з дослідження імпульсної електричної активності
гальмівних ГАМК-ергічних інтернейронів увага приділяється вивченню
характеристик високочастотних серій ПД. Останні літературні дані
дозволяють вважати, що серед гальмівних інтернейронів гіпокампу існують
клітини, що здатні генерувати серії ПД з низькою частотою. Опубліковані
роботи, однак, не торкаються питання про те, наявністю яких саме типів
потенціалзалежних калієвих каналів визначається генерація гальмівними
ГАМК-ергічними інтернейронами серій ПД з низькою частотою. Так само
невідомо, канали яких типів зумовлюють відмінності в характеристиках
генерації ПД між збуджуючими та гальмівними нейронами.

Тому особливий інтерес представляє порівняння імпульсної електричної
активності гальмівних і збуджуючих нейронів. Також існує ще багато
питань про особливості синаптичної передачі нейронів, які проявляють
різні типи електричної активності.

Усе вищезгадане і визначило необхідність дослідження характеристик
імпульсної електричної активності та властивостей викликаних
постсинаптичних струмів гальмівних і збуджуючих нейронів у комплексі з
перевіркою наявності в їхніх мембранах певних типів потенціалзалежних
калієвих каналів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у рамках наукових програм Відділу Фізіології Нейронних Мереж Інституту
фізіології ім. О.О.Богомольця “Зміни калієвої провідності в
довгостроково культивованих нейронах гіпокампу”, а також наукових тем
Міжнародного Центру Молекулярної фізіології НАН України: “Дослідження
механізмів гальмівної синаптичної передачі нейронів центральної нервової
системи” і “Роль потенціалкерованих калієвих каналів у викиді ГАМК у
центральних нейронах”.

Мета дослідження. Метою роботи було визначення параметрів потенціалів
дії та викликаних ними постсинаптичних струмів в синаптично зв’язаних
парах нейронів культури гіпокампу щура.

Завдання дослідження.

Порівняти характеристики серій ПД, що генеруються з високою та низькою
частотою гальмівними інтернейронами; серій ПД, що генеруються з низькою
частотою збуджуючими і гальмівними нейронами.

З’ясувати, який модулюючий білок (соматостатин чи парвальбумін) містять
досліджувані нейрони.

Визначити, чи співвідноситься здатність клітини генерувати ПД з низькою
частотою з наявністю в них одного певного або кількох різних типів
потенціалзалежних калієвих каналів.

Дослідити в умовах культивування взаємозв’язок між типом пресинаптичного
нейрона та характеристиками постсинаптичних струмів, які він викликає.

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі вперше на
первинній культурі дисоційованих нейронів гіпокампу було показано
присутність двох груп ГАМК-ергічних нейронів, які відрізняються за типом
імпульсної електричної активності. Використання культури з низькою
щільністю нейронів дозволило розглянути взаємодію окремих пар синаптично
зв’язаних нейронів і виявити зв’язок кінетичних параметрів
постсинаптичних струмів і специфічних (імуноцитохімічних і
морфологічних) властивостей пресинаптичних нейронів. У дисертаційній
роботі було показано, що параметри серій ПД з низькою частотою
відрізняються у гальмівних і збуджуючих нейронів, ці клітини експресують
різні комбінації потенціалзалежних калієвих каналів, які забезпечують
здатність нейрона генерувати серії ПД з низькою частотою.

Отримані експериментальні дані істотно доповнюють сучасні уявлення про
механізми електрозбудливості, що відповідають за здатність нервових
клітин генерувати потенціали дії з високою або низькою частотою.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати
представляють, насамперед, фундаментальний інтерес, оскільки отримано
нові дані щодо експресії калієвих каналів в нейронах культури гіпокампу.
Робота показала, що в умовах культивування пресинаптична клітина не
тільки безпосередньо викликає постсинаптичний струм і визначає амплітуду
цього струму в постсинаптичному нейроні, але й істотно впливає на його
кінетику. Крім того, в даній роботі було об’єднано новітні
електрофізіологічні методи, математичний апарат і імуноцитохімічні
дослідження, що дозволило глибше проаналізувати і зрозуміти відмінності
механізмів генерації серій ПД гальмівними і збуджуючими нейронами в
гіпокампі.

Особистий внесок автора в отримання наукових результатів. Робота з
отримання первинної культури нейронів гіпокампу щура низької щільності,
налагодження електрофізіологічної установки і системи локальної
аплікації, отримання та обробки експериментальних даних, створення
програми для розрахунку кінетичних параметрів потенціалів дії, аналізу і
узагальнення результатів досліджень зроблена особисто автором.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались
на поточних наукових семінарах Відділу Загальної Фізіології Нервової
Системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
конференціях “Pharmacology of synaptic transmission in nervous system”
(2002, Kиїв, Україна), “First Ukrainian Congress for Cell Biology”
(2004, Львів, Україна), IBRO Advanced School Of Neuroscience (2004,
Ялта, Україна), International Workshop in Cell Physiology “Transport
Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps”, (2004,
Санкт-Петербург, Росія), Joint International Meeting of The
Physiological Society and FEPS (2005, Брістоль, Великобританія).

Публікації. Результати роботи опубліковано в 3 статтях у наукових
фахових журналах та тезах 5 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, методів досліджень, результатів досліджень, обговорення
результатів, висновків та списку використаних джерел із 193 найменувань.
Роботу викладено на 134 сторінках та ілюстровано 33 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

У Вступі обґрунтовано актуальність дослідження типів електричної
активності, наявності певних типів потенціалзалежних калієвих каналів,
властивостей викликаних постсинаптичних струмів, сформульовано мету та
задачі дослідження, наведено відомості про наукову новизну, практичне
значення та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів
дисертації.

Розділ Огляд літератури присвячений висвітленню основних понять
мембранної теорії збудження; опису складу, типів, функцій
потенціалзалежних калієвих каналів; складу та властивостей ГАМК- та
глутаматних рецепторів.

Для досягнення поставленої мети у розділі Методика досліджень описано
використані матеріали та методи досліджень, а саме:

Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампу щура низької
щільності і культури нейронів зубчастої борозни гіпокампу щура.

Метод внутрішньоклітинної фіксації потенціалу на постсинаптичному
нейроні в конфігурації “ціла клітина”.

Методика парної реєстрації електричних сигналів від синаптично зв’язаних
нейронів.

Метод локальної позаклітинної перфузії для аплікації блокаторів
гальмівної та збуджуючої синаптичної передачі і селективних блокаторів
калієвих каналів.

Метод імуноцитохімічного аналізу.

Математичні методи обробки даних і результатів.

Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампу. Новонароджених
щурів лінії Вістар декапітували, гіпокамп (при культивуванні гранулярних
клітин зубчастої борозни гіпокамп поперечно розрізали на частини 0,5 мм
завтовшки і з кожної виділяли лише область зубчастої борозни) виділявся
та оброблювався 0,025% розчином трипсину (Sigma, США) на протязі 6
хвилин при температурі 23?C. Після механічної дисоціації клітини
висівалися на вкриті полі-L-орнітином та ламініном (Sigma, США) чашки
Петрі з щільністю 30 тис. од. на 1 см2. Клітини культивувалися у
середовищі, що складалося з середовища MEM, 10% кінської сироватки, 2,3
г/л NaHCO3, 6 мг/мл інсуліну, пеніциліну та стрептоміцину. Для
припинення проліферації гліальних клітин на третій день культивування до
культурального середовища додавали 5 мкмоль/л
цитозин-A-D-арабіно-фуранозиду (Sigma, США) на 24 години.

Об’єкт досліджень. Електрофізіологічні властивості гальмівних
ГАМК-ергічних інтернейронів вивчалися на синаптично зв’язаних нейронах
культури гіпокампу щурів. Пресинаптичний нейрон відбирався візуально;
його ГАМК-ергічність визначалася за наявністю на постсинаптичній клітині
викликаних моносинаптичних струмів (за умови присутності в
зовнішньоклітинному розчині блокаторів збуджуючої нейропередачі DL-AP5,
20 мкмоль/л і DNQX, 20 мкмоль/л) при стимуляції пресинаптичної клітини.
Електрофізіологічні властивості збуджуючих (глутаматергічних) нейронів
вивчалися на синаптично зв’язаних парах “гранулярна клітина –
постсинаптичний нейрон”. В умовах культури гранулярні клітини
ідентифікувалися на основі їхніх морфологічних і електрофізіологічних
властивостей. Вивчення збуджуючих постсинаптичних струмів проходило за
наявності в зовнішньоклітинному розчині блокатору ГАМКА-рецепторів
(бікукуліну метобромід, 10 мкмоль/л).

Електрофізіологія. Електрофізіологічні експерименти проводились на
синаптично зв’язаних нейронах культури гіпокампу щурів; здійснювалась
одночасна реєстрація від двох клітин в конфігурації “ціла клітина”.
Таким чином, ПД відводилися від пресинаптичної клітини в режимі фіксації
струму, а викликані струми – від постсинаптичної, в режимі фіксації
потенціалу при підтримуваному потенціалі -75 мВ. Для експериментів
відбирались клітини, які знаходились в умовах культивування від 14 до 28
днів.

В експериментах використовувався зовнішньоклітинний розчин наступного
складу (ммоль/л): NaCl 140, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, Hepes 20, глюкоза
30. Піпеточний розчин містив (ммоль/л): К-глюконат 100, KCl 50, EGTA 10,
MgCl2 5, HEPES 20. Заповнені розчином, піпетки мали опір 8-10 МОм.
Експериментальна установка була зібрана на базі інвертованого мікроскопу
Axiovert 25 (Carl Zeiss, ФРН), який при використанні фазовоконтрастного
об’єктиву забезпечував 320-кратне оптичне збільшення. В експериментах
використовувались 2 підсилювача електричних сигналів EPC8 (HEKA, ФРН).
Сигнали відцифровувались та записувались за допомогою АЦП Digidata 1322A
та програмного пакету pClamp 9.0 (Axon Instruments, США) з частотою
дискретизації 50 кГц.

Аплікація блокаторів здійснювалась за методикою швидкої локальної
суперфузії (Veselovsky et al., 1996).

Імуноцитохімічний аналіз. Після електрофізіологічних експериментів на
вибраних збуджуючих і гальмівних нейронах проводився імуноцитохімічний
аналіз для вивчення локалізації на їхніх мембранах потенціалзалежних
калієвих каналів Kv1.2, Kv3.1, Kv4.2 типів, а також для визначення
наявності модулюючих білків – соматостатину і парвальбуміну.

Скло з нейронами промивали розчином фосфатного буферу (phosphate buffer
salіne, PBS), потім клітини фіксували 4% параформальдегідом протягом 30
хвилин при температурі 20-23?С, після чого витримували у PBS, що містив
0,37% гліцину і 0,27% хлориду амонію. Після кількох промивань PBS у
клітин збільшували проникність мембран, використовуючи 0,1% розчин
Trіton X-100 у PBS протягом 15 хвилин, а потім інкубували протягом 60
хвилин у блокуючому розчині PBS, що містив 2% бичачих сироваткових
альбумінів (BSA) та 2% телячої сироватки. Знову промивали препарат PBS
та розчином PBS з 1% BSA. Після цих процедур клітини інкубували протягом
16 годин при температурі 4(С у розчині з первинними антитілами,
розведеними в PBS з 1% BSA. Використані первинні антитіла були
поліклональними афінно-очищеними кролячими імуноглобулінами,
специфічними до соматостатину і парвальбуміну (1:500), поліклональними
цапиними імуноглобулінами проти Kv1.2, Kv3.1, Kv4.2 (1:500; Santa Cruz
Bіotechnology, США).

Після інкубації з первинними антитілами клітини промивалися розчином 1%
BSA у PBS, а потім витримувались із вторинними антитілами протягом 60
хвилин (при кімнатній температурі, в темряві). Використані вторинні
антитіла були кон’юговані з флуоресцентними мітками, які мають максимуми
спектрів випромінювання на довжинах хвиль 519 і 573 нм при максимумах
поглинання на довжинах хвиль 495 і 556 нм відповідно (Fluorescent Alexa
Fluor 488 donkey antі- rabbіt Іg, Fluorescent Alexa Fluor 488 і Fluor
546 donkey antі-goat Іg; 1:1000, Molecular probes, США). Після цього
клітини промивалися наступними розчинами: 1% BSA у PBS, чистим PBS,
дистильованою водою. Препарат (покривне скло з клітинами) розташовували
на предметному склі й вміщували в краплю специфічного середовища, що не
перешкоджає флуоресцентному світінню (Daco, Великобританія).

Для того, щоб перевірити специфічність зв’язування антитіл (як
первинних, так і вторинних), було проведено контрольні експерименти за
відсутності первинних антитіл або з використанням преінкубації з
відповідним блокуючим пептидом (Passmore et al., 2003).

Аналіз даних. Кінетичні параметри викликаних постсинаптичних струмів
визначались за допомогою програмного пакета Clampfit 9.0 (Axon
Instruments, США), кінетичні параметри ПД розраховувались програмою
Spike, створеною в середовищі Mathlab 6.0 (MathWorks, США) автором. Для
кластеризації даних за внутрішньогруповими середніми використовувався
алгоритм k-середніх

(Spath, 1985).

Поріг виникнення ПД визначали як потенціал у момент часу, в який друга
похідна зміни потенціалу досягала потроєного значення
середньоквадратичного відхилення в момент, що передував виникненню ПД.
Амплітуда ПД визначалася як різниця між максимумом цього потенціалу і
згаданим значенням порога ПД. Амплітуда постактиваційної
гіперполяризації вимірювалась як різниця між пороговим значенням
потенціалу і максимальним негативним відхиленням слідового потенціалу.
Тривалість ПД вимірювалася на половинному значенні його амплітуди.
Максимальні швидкості деполяризації та реполяризації знаходились
відповідно як максимум і мінімум першої похідної від зміни потенціалу.
Миттєва частота генерації ПД вимірювалась як обернене значення
міжімпульсного інтервалу. Максимальна стаціонарна частота генерації ПД
знаходилась як результат усереднення миттєвих частот генерації ПД
протягом останніх 100 мс прикладання стимулу. Ця частота досягалася при
такому значенні стимулу, коли подальше підвищення його амплітуди
приводило до втрати клітиною здатності безупинно генерувати ПД протягом
500-мілісекундного подразнення. За цією “максимальною” серією ПД
розраховували також характеристику адаптації протягом 200 мс, A200, як
відношення різниці миттєвих частот на початку стимулу і через 200 мс до
частоти на початку стимулу.

Результати представлені в тексті як середнє значення ± похибка
середнього.

У розділі Результати викладено результати досліджень гальмівних
ГАМК-ергічних інтернейронів, для яких характерна або високочастотна
генерація серій ПД (fast-spіkіng, частота генерації ПД більше 50-70 Гц),
або ритмічна генерація ПД з низькою частотою (regular spіkіng, частота
генерації ПД близько 25-35 Гц) (Erіsіr et al., 1999), а також збуджуючих
нейронів, які генерують ПД низькочастотно. Особливу увагу було приділено
вивченню морфологічних властивостей нервових клітин, їхньої електричної
активності, експресії модулюючих білків та потенціалкерованих калієвих
каналів, а також дослідженню кінетики постсинаптичних струмів,
викликаних різними

типами ПД.

Два типи інтернейронів. При дослідженні електрофізіологічних
властивостей 49 ГАМК-ергічних інтернейронів було розглянуто розподіл
такого характеристичного параметру серії ПД, як максимальна стаціонарна
частота генерації ПД. Виявилось, що цей розподіл істотно відрізняється
від нормального (тест Шапіро-Уілка, Р„A? ® e i i Z„A, ? ? o „@ `„@ l l % А - Приклади вольт-амперних залежностей викликаних ГПСС для постсинаптичних клітин двох типів - із швидкою (1) та повільною (2) кінетиками вГПСС. Б - Приклад апроксимації за допомогою одноекспоненційного рівняння спадів швидких (1) та повільних (2) гальмівних постсинаптичних струмів. REF SHAPE \* MERGEFORMAT Обидва типи постсинаптичних струмів були високочутливими до бікукуліну - селективного блокатору ГАМКА рецепторів. Оскільки істотної кореляції кінетичних параметрів вГПСС з іншими характеристиками постсинаптичного нейрона (розмір соми, кількість відростків, вхідний опір, відстань між пре- і постсинаптичними клітинами) не відзначалось, ми припустили, що виявлені відмінності між швидкими та повільними струмами можуть бути зумовлені особливостями пресинаптичних клітин. Оскільки пресинаптичні клітини вже було розділено на дві групи відповідно до їхніх морфологічних характеристик, а постсинаптичні клітини - за кінетичними характеристиками вГПСС, то, використовуючи алгоритм k-середніх (Spath, 1985), ми виявили групування досліджених пар нейронів за трьома параметрами: 1) розмір соми пресинаптичної клітини, 2) кількість відростків у цієї клітини, 3) потенціал реверсії вГПСС в постсинаптичній клітині. Центри отриманих кластерів були достатньо віддалені один від одного, а елементи кожного кластеру розташовувалися між собою досить близько. Центри кластерів мали такі значення: для першої групи клітин - розмір соми 24,3 мкм, потенціал реверсії -22,0 мВ, кількість відростків 4,5 для другої групи - 16,8 мкм, -40,6 мВ, 3,1 відповідно. Такий поділ синаптично зв’язаних пар добре узгоджується з поділами на групи тільки пресинаптичних або тільки постсинаптичних клітин. Таким чином, напрошується природний висновок про наявність істотного впливу пресинаптичного нейрона на кінетику постсинаптичного струму. Для того, щоб підтвердити чи спростувати це припущення, ми розрахували матриці парних коефіцієнтів кореляції R вектора, рядки якого складаються з результатів спостережень (розмір соми, кількість відростків, потенціал реверсії) і рівнів значимості P, використаних при перевірці гіпотези про відсутність кореляції. 1,000 0,000 0,009 R(i,j)= 0,8 1,0 0,6 P(i,j)= 0,000 1,000 0,002 0,5 0,6 1,0 0,009 0,002 1,000 Кожне значення Р тут є значенням імовірності одержати більшу величину коефіцієнту кореляції, ніж її розраховане вибіркове значення під дією випадкових факторів, коли дійсне значення коефіцієнту кореляції дорівнює нулеві. Якщо певне P(і,j) менше за 0,05, відповідне значення коефіцієнту кореляції R(і,j) буде значимим. Як видно, недіагональні значення матриці P(і,j) менші за 0,05, з чого випливає, що недіагональні значення матриці коефіцієнтів кореляції R(і,j) є значимими. Отже, між розміром соми, кількістю відростків пресинаптичної клітини і потенціалом реверсії ГПСС, викликаного в постсинаптичній клітині, існує невипадкова залежність. Таким чином, можна зробити висновок, що пресинаптична клітина зумовлює не тільки виникнення постсинаптичного струму та визначає його амплітудні характеристики, а й здатна деякою мірою впливати на кінетику таких вГПСС. Окрім того, існує залежність між морфологічними властивостями пресинаптичної клітини та потенціалом реверсії вГПСС. Гранулярні клітини зубчастої борозни. Культивовані гранулярні клітини характеризувались чітко вираженою краплевидною формою і середнім розміром 13,37(0,62 мкм. Апікальні відростки гранулярних клітин роздвоювалися, в той час як каудальні були одиночними і практично не мали відгалужень ( REF _Ref111520417 \h \* MERGEFORMAT Рис. 8 А). Середній потенціал спокою таких нейронів дорівнював -52,13(1,71 мВ, середній вхідний опір – 748,56(91,61 MОм. Для аналізу електрофізіологічної активності було обрано п’ятнадцять гранулярних клітин. Всі вони були здатні генерувати серії ПД, електрофізіологічні параметри яких наведено у таблиці 2. Для визначення експресії калієвих каналів і наявності білків соматостатина та парвальбуміна було проведено подвійні імуноцитохімічні фарбування клітин з відомими електрофізіологічними характеристиками. На препаратах, пофарбованих SS-специфічними антитілами, усі досліджені гранулярні клітини (n=9) демонстрували високий рівень імунореактивності до даного типу антитіл. Флуоресцентні мітки чітко визначалися як на нейронних сомах, так і на всіх відростках ( REF _Ref111520417 \h \* MERGEFORMAT Рис. 8 Б, REF _Ref111520425 \h \* MERGEFORMAT Рис. 9 Б). Гранулярні клітини не були імунореактивними до PV-специфічних антитіл. За результатами імуноцитохімічного дослідження у гранулярних клітин було виявлено присутність потенціалзалежних калієвих каналів Kv4.2 і Kv1.2 типів. Однак інтенсивність флуоресцентного світіння, а також просторовий розподіл міток значним чином відрізнялися: Kv4.2-мітки локалізувалися як на нейронних сомах, так і на нейритах ( REF _Ref111520417 \h \* MERGEFORMAT Рис. 8 В); Kv1.2-імунореактивність чітко визначалася лише на сомах, а по мірі віддалення від останніх слабшала ( REF _Ref111520425 \h \* MERGEFORMAT Рис. 9 , В). Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 8 Мікрофотографія культивованих гранулярних клітин: А - клітина перед початком електрофізіологічного експерименту (світловий мікроскоп, фазовий контраст). На решті знімків - та ж сама клітина, пофарбована антитілами, специфічними до соматостатину (флуоресценція) (Б) та Kv4.2 калієвих каналів (флуоресценція) (В). Kv3.1-специфічного забарвлення на мембранах культивованих гранулярних клітин виявлено не було. REF SHAPE \* MERGEFORMAT Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 9 Мікрофотографія пари досліджуваних нейронів. А - клітини перед початком електрофізіологічного експерименту, гранулярна клітина вгорі, постсинаптичні - внизу (світловий мікроскоп, фазовий контраст). На решті знімків - ті ж самі клітини, пофарбовані антитілами, специфічними до соматостатину (флуоресценція) (Б) та Kv1.2 калієвих каналів (флуоресценція) (В). Таким чином, імуноцитохімічні дослідження показали, що гранулярні клітини в умовах культури демонстрували високу SS-імунореактивність і з високою щільністю експресували калієві канали Kv1.2 і Kv4.2 типів, що добре узгоджується з електрофізіологічними експериментами, проведеними на цих клітинах. Стимуляція гранулярних клітин деполяризуючим струмом викликала в них ритмічну серію ПД з низькою частотою. В результаті на постсинаптичному нейроні такі ПД викликали появу збуджуючих постсинаптичних струмів ( REF _Ref111520789 \h \* MERGEFORMAT Рис. 10 ). Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 10 Приклад реєстрації серії ПД з низькою частотою, яку генерує гранулярна клітина у відповідь на стимуляцію поштовхом струму (А) і постсинаптичних відповідей при підтримуваному потенціалі -75 мВ (Б). Струми, зареєстровані в постсинаптичних клітинах, були розділені на два типи в залежності від їхніх кінетичних характеристик. В одній групі середній час наростання викликаних збуджуючих постсинаптичних струмів (вЗПСС) становив 0,70(0,10 мс, а середнє значення постійних часу спаду ( - 3,50(0,27 мс (n=7). В іншій групі струми наростали і спадали порівняно повільніше: середній час наростання складав 1,53(0,19 мс; середнє значення постійних часу спаду ( дорівнювало 10,09(0,88 мс (n=8), ( REF _Ref111521707 \h \* MERGEFORMAT Рис. 11 А, Б). Середні значення часів наростання і постійних часу спаду в цих двох групах статистично достовірно відрізнялися (критерій Ст’юдента, P

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020