МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ
Харківський національний університет
ім. В.Н.Каразіна
Загайко Андрій Леонідович
УДК 577.125:57.044:57.016.6
СИСТЕМА ТРАНСПОРТУ ЛІПІДІВ
ПРИ ОКСИДАТИВНОМУ СТРЕСІ
У ЩУРІВ
03.00.04 — Біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків — 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі біохіміі Харківського національ¬ного уні¬вер¬ситету ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти України (м.Харків).
Науковий керівник:
Доктор біологічних наук, професор
Каліман Павло Авксентійович,
завідувач кафедрою біохімії Харків¬ського націо¬наль¬ного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти України
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, доцент
Параніч Анатолій Валентинович, професор кафедри молекулярної та прикладної біофізики Харків¬ського націо¬наль¬ного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти України
Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Колодуб Фелікс Аркадійович, провідний науковий співро¬бітник Українського науково-дослідного інституту фармакотерапії ендокринних захворювань Міністерства охорони здоров’я України
Провідна установа:
Інститут біохімії ім. О. В. Пала¬діна НАН України (відділ біохімії ліпідів), м. Київ
Захист відбудеться «1» березня 2000 року о 1500 на засіданні вченої ради К 64.051.17 в Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.
З дисертацією можна ознайомитись у центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти України за адресою: 61077, Харків-77, пл. Свободи, 4.
Автореферат дисертації розісланий «28» січня 2000 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради, к.б.н. Падалко В.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. За умов сучасності перед біологічними науками та медициною дуже гостро постала проблема дослідження нових форм патологій, ро¬з¬виток яких викликаний впливом на організм з боку навко¬лиш¬нього середовища [Ав¬цын А.П. и др., 1991]. Багато з ксенобіотиків, що надходять до навколишнього сере¬до¬вища і організму людини з техно¬сфе¬ри, зрушують баланс в системі прооксиданти антиоксиданти в бік пер¬ших [Барабой В.А. и др., 1992]. Такою властивостю воло¬діють також інші стре¬сор¬ні фактори, наприклад, надходження до організму надлиш¬кових кіль¬кос¬тей есенціальних мікроелементів, зокрема, іонів кобальту [Stohs S.J., Bagchi D. 1995]. За умов генерування великої кількості ак¬тив¬них форм кис¬ню пош¬код¬жуються всі основні класи біологічних макромолекул та над¬мо¬ле¬куляр¬них комплексів, у тому числі біо¬логічні мембрани, знижу¬єть¬ся вміст віднов¬леного глутатіону та мак¬роергів [Голиков С.Н. и др., 1986]. При цьому різні фізі¬¬оло¬гічні системи, що підтримують го¬мео¬стаз, часто ма¬ють витримувати неа-дек¬ватні на¬ван¬¬таженням і перенапру¬ження, що суп¬ро¬воджується розвит¬ком оксидатив¬но¬го стре-су [Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Менщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1997, Калиман П.А. и др., 1997, 1998]. У від¬по¬відь формується ряд захисних реакцій, спря¬мованих на гальму¬вання вільнора¬ди-кального окислення та підтримання функці¬ональ¬ної ак¬тив¬ності клітини.
Ліпіди, як сполуки, що містять подвійні зв’язки (ненасичені жирні кис¬лоти та їх за¬лиш¬ки в складних ліпідах), становлять об’єкт, що легко пош¬код¬жується актив¬ни¬ми метаболітами кисню [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972]. Для кори¬гу¬вання по¬ру¬шень мембран недостатньо активності лі¬під¬син¬тезуючих ферментів періфе¬рич¬них тканин, значна частина ліпідів по¬вин¬на бути синтезована в пе¬чінці та транспор¬тована до тканин у вигляді лі¬ппротеїнів крові. Проте підтри¬мання гомео¬ста¬зу клітинних мембран за умов активації вільнора¬дикального окис¬лення та роль лі¬пі¬дів і ліпопро¬теї¬нів у захисних реакціях при окси¬дативному стресі вив¬чені недостат¬ньо. Крім того, важливою ланкою розвитку стрес-ре¬акції є пере¬микання метаболізму з використання вуглеводів як джерела енергії на ут謬лізацію ліпідів [Панин Л.Е., 1983, Калиман П.А. и др., 1997].
Таким чином, безперечно велике значення становить вивчення системи транспорту ліпідів в енергетичному обміні та в механізмах підтримання гомеостазу клітин¬них мембран за умов оксидатив¬ного стресу.
Ліпопротеїни крові відіграють важливу роль в атерогенезі [Климов А.Н., 1995]. Враховуючи відомий факт атерогенної дії іонів кобальту і стресу взагалі, важливим було вивчити стан окислення ліпопротеїнів, особливо апо-В-вміщуючих ліпопротеїнів, що є одними з пускових елементів атеро¬скле¬розу, на різних термінах розвитку оксидативного стресу, викликаного вве-денням іонів кобальту або тетрамізолу. Введення тетрамізолу було прик¬ладом, необхідним, щоб довести неспецифічність реакцій адаптації з боку сис¬теми транспорту ліпідів. Цей гідрофільний ксенобіотик, як відомо [Ка¬лиман П.А.и др., 1998], викликає в дозах, близьких до ЛД50, розвиток окси¬дативного стресу.
Зв’язок роботи з науковими програмами. Дисертаційне дослід¬ження стало частиною держбюджетної теми НДІ біології Харківського національного уні¬вер¬ситету ім. В.Н. Каразіна“Клітинні і молекулярні механізми адаптації метаблізму при оксидативному стресі” (№ ДР 0197U008188).
Мета і задачі дослідження. Метою цієї роботи стало встановлення механізмів впливу оксидативного стресу, що був спричинений введенням хлориду кобальту або тетрамізолу, на транспорт ліпідів у щурів. В зв’язку з метою дослідження, а також враховуючи, що транспорт ліпідів здійснюється в формі ліпопротеїнів крові, синтез і катаболізм значної кількості яких відбувається в печінці, в роботі було вивчено:
1. Вміст та ліпідний склад ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів за умов розвитку оксидативного стресу, що спричинений введенням хлориду кобальу або тетрамізолу in vivo.
2. Вплив інгібіторів білкового синтезу (актиноміцину D та циклогексиміду) на вміст та ліпідний склад ліпопротеїнів цитозолю печінки та сироватки крові через 2 год. та добу після введення хлориду кобальту на фоні дії інгібітора.
3. Оксидативні модифікації ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів за тих же умов.
4. Вплив іонів кобальту на вміст та склад ліпопротеїнів цитозолю печінки і сироватки крові in vitro.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що введення тва¬ри¬нам сублетальних доз есенційного мікроелементу — кобаль¬ту — викликає істотне і довгострокове підвищення в сироватці крові прак¬тично всіх ліпопротеїдних фрак¬цій водночас зі зниженням в печінці фрак¬цій, що там секретуються. Знайдено, що за цих умов відбувається активне окислення ліпо¬про¬теїнів, що проявляється в істот¬ному підвищенні в їх складі вмісту пер¬вин¬них і вторинних продуктів ПОЛ, та зниження вмісту антиоксидан¬тів; при¬чо¬му -ліпопротеїни найдовше з усіх фракцій зали¬шаються в окис¬леному стані. Вперше встановлено, що введення інгібіторів синтезу білку істотно зглад¬жує гіперліпопротеїнемію при оксидативному стресі, що викли¬каний введен-ням хлориду кобальту. Показано, що іони кобальту здатні без¬посеред¬ньо впливати на лі¬по-протеїни, спричиняючи їх деструкцію. Вста¬новлено, що атеро¬генний характер оксидативного стресу прояв¬ля¬ється як в оксидативних модифі¬каціях ліпопротеїнів, так і в перерозподілі їх фракцій на користь атеро¬генних. Показано, що реакції відповіді на оксидативний стрес з боку транспорту ліпідів є в значній мірі неспецифічними, та не залежать від стресуючого агента.
Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані в роботі дані по¬глиᬬлюють відомості про механізми дії сублетальних доз іонів кобальту та ро¬з¬витку окисного стресу в клітинах тварин в цілому. Виявлені деякі мож¬ливі меха¬ніз¬ми підтримання клітиною гомеостазу мембран на молеку¬ляр¬¬но¬му рі¬вні. Вказана роль системи транспорту ліпі¬дів, що включає ліпопротеїни крⳠта печінки, в анти¬оксидантному захисті клітини. Ці дані можуть ста¬н¬вити основу для подальшого вив¬чен¬ня механізмів розвитку стрес-реакції і адаптації клітини до несприятливих умов на клітинно-молекулярному рів¬ні.
Практична значимість роботи полягає в пошуках шляхів до розробки за¬со¬бів корекції пошкоджень ліпідних структур клітини і, можливо, організму в цілому за умов впливу факторів, що активують ліпопероксидацію. Вивчення деяких механізмів атерогенезу може бути використане при розробці заходів профілактики та лікування цього захворювання.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконано під ке¬рів¬ництвом доктора біол. наук. П.А.Калімана, в співробітництві з Р.В. Ша¬лବ¬мо¬вим, з якими автор має сумісні пуб-лікації. Усі результати, що приведені в руко¬писі, отримані пошукачем самостійно. Дисертантом особисто про¬ведені експерименти та визначення показників, що обрані для досліджень, обговорені отримані результати.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної робо¬ти доповідалися на засіданнях кафедри біохімії протягом 1995-1998 ро¬ків, науковій конференції молодих вчених ХДУ в 1996 р., респуб¬ліканській нବуково-практичній конференції молодих вчених “Сучасні фу¬н-даментальні та прикладні проблеми кліні¬ки внутріш¬ніх захворювань”, Хар¬ків – 1997, конференції “Екологічна токсикологія на порозі ХХІ сто¬річчя”, Ки¬їв – 1997, VII Українському біохі¬мічному з’їзді, Київ – 1997 (де от¬ри¬мала ІІ пре¬мію на конкурсі робіт молодих вчених), науковій конференції “Фун¬даментальні та прикладні аспекти сучасної біохімії”, С.-Петербург, 1998 р.
Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 11 нау¬кових робіт, серед яких 6 статей та 5 тез доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, двох розділів ре¬зультатів дослід¬жень та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури та додатків. Робота викладена на 153 сторінках машино¬писного тексту і містить 11 рисунків та 33 таблиці. 3 рисунка та 3 таблиці винесено на окремі сторінки. Список літератури містить 287 джерел та розта¬шо¬ва¬ний на 27 сторінках. Додатки містять 11 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У першому розділі роботи подано огляд літератури за темою дисертації. Особлива увага приділена розгляду стану системи транспорту ліпідів ссавців при дії на організм екстремальних чинників.
У другому розділі описано матеріали та основні методи дослідження.
ОБ’ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Постановка експерименту. У роботі використовували білих щурів-самців лінії Wistar 3-х місячного віку, вагою 180-220 г, що утримувались у стан¬дартних умовах віварію Харківського університету. Об’єктом дослід¬ження виступали цитозоль печінки та сироватка крові щурів.
Після декапітації анестезованої хлоралозо-урета¬но¬вим нарко¬зом тварини пе¬чінку перфузували холодною середою виділення та гомо¬г嬬нізували у гомо¬генізаторі Поттера на льоду. Цитозоль печінки одержували шляхом ди¬ференційного центрифу¬гування гомогенатів у центрифузі VAC-601 [Фин¬длей Дж., Эванз У., 1990].
Проведення електрофорезу ліпопротеїнів. Сироватку крові або цитозоль пе¬чін¬ки фар¬бували насиченим розчином Судана Чорного 10В. Ліпопро¬теїни фра¬к¬ціо¬нували методом діск-электрофорезу у вертикаль¬них плас¬тинах ПААГ [Колб В.Г., Камышников В.С., 1979]. В залежності від розта¬шування на електрофореграмі, ліпо¬протеїни ідентифікували як 1-, 2-, -, пре--ліпо¬про¬теїни та хіло¬мікрони. Фарбу вимивали сумішшю оц¬то¬вої кис¬ло¬ти та ета¬нолу з додецил¬суль¬фатом натрію. Оптичну густину елюату ви¬зна¬чали спек¬тро¬фото¬мет¬рично за допомогою СФ-26 для розрахунку від¬сот¬кового вмісту кожної з фракцій.
Концентрацію - та пре--ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю пе¬чін¬ки в су¬мі визначали також турбідіметричним методом [Колб В.Г., Камышников В.С., 1982]. Використовуючи здобуту таким чином концен¬трацію апо-В-вміщуючих ліпо¬про¬теїнів, та дані про відсоткове співвідно¬шення між фракціями ліпопротеїнів, що були отримані за допомогою електрофорезу, розраховували вміст кожної з ліпопро¬те¬їдних фракцій.
Ліпіди з ліпопротеїнів цитозолю печінки та сироватки крові після фрак¬ці¬о¬нування екстрагували за методом Bligh and Dyer [1959] з деякими моди¬фікаціями.
Вміст фосфоліпідів (ФЛ) визначали за фосфором, що входить до їх скла¬ду [Sundhu R., 1976].
Вміст моно-, ді- та тригліцеридів (ТГ) визначали за реакцією формаль¬де¬гі¬ду, що утворився при окисленні гліцерину [Tixer M., Claude J., 1976], з солянокислим фенілгідра¬зи¬ном. В деяких випадках концентрацію гліцеридів визначали за допо¬могою стандартного ферментативного набору фірми “KONE” (Фінляндія).
Вміст вільного та етерифікованого холестеролу (ВХ та ЕХ) визначали за ре¬акцією з хлорним залізом та подальшим осадженням ВХ дігіто¬ніном [Финдлей Дж., Эванз У., 1990]. В деяких випадках концентрацію ВХ та за¬галь¬¬ного холестеролу визначали за допомогою стандартних фермента¬тив¬них холестерол¬оксидаз¬них наборів фірми “Boehringer Mannheim GmbH diag¬nostica” (Німеччина).
Концентрацію загальних ліпідів (ЗЛ) визначали за допомогою стан¬дар¬тного набору Eagle Diagnostics (США).
Визначення кількості продуктів переокислення ліпідів в ліпопротеїнах. Фракції ЛВГ (ліпопротеїнів високої густини) та ЛНГ+ЛДНГ (ліпопротеїнів низької та дуже низької густини) розділяли центрифугуванням сироватки крові та цитозолю печінки, до яких попередньо додавали розчини гепарину та СаCl2 в присутності ЕДТА. Вимірювали оптичну густину гептан-ізо¬про-панольних екстрактів вказаних фракцій при довжині хвилі 220 нм (для ізо¬льованих подвійних зв’язків), 232 нм (для дієнових кон’югатів) та 278 нм (для кетодієнів та сполучених трієнів) [Волчегорский И.Ф. и др., 1989]. Вміст загальних гідроперекисів вимірювали реакцією з тіоціанатом амоні¬ю [Романова Л.А., Стальная И.Д., 1977].
Визначення кількості -токоферолу проводили за кольоровою реакці¬єю з двва¬лентним залі-зом (індикатор , ‘-біпіридил); до результатів ви¬зна¬чення вносили поправку на присутність холестеролу [Кибардин С.А., 1951].
Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом Х-крітерію Ван-дер-Вардена [Закс Л., 1976].
У третьому та четвертому розділах дисертації наведено основні результати досліджень та їх обговорення.
ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
ВПЛИВ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕСУ, СПРИЧИНЕНОГО ІОНАМИ КОБАЛЬТУ, НА ТРАНСПОРТНІ ФОРМИ ЛІПІДІВ У ЩУРІВ.
Вплив хлориду кобальту на вміст та склад ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів. Тварин декапітували через 30 хв., 2, 24, 48, 72 та 96 год після одноразової ін’єк¬ції солі або фізіологічного розчину (для кон¬троль¬них тварин). Тривалий час експозиції кобальту дав змогу простежити розвиток оксидативного стресу на різних етапах з вмиканням як термінових, так і довгострокових механізмів ре¬гуляції. Вивчали вміст окремих фракцій ЛП (ліпопротеїнів), їх ліпідний склад, а також стан оксидації в ЛП.
В сироватці крові нами виявлено 5 фракцій ліпопротеїнів (1-ЛП, 2-ЛП, -ЛП, пре--ЛП та хіломікрони), а в цитозолі печінки — 4 фракції (-ЛП, -ЛП, пре--ЛП та фракція стартової зони). Електрофоретична рухливість фракцій ЛП цитозолю пе¬чін¬ки відповідала рухливості ЛП крові, з чого ми виходили при узгодженні змін в вмістах ЛП сироватки крові і цитозолю печінки.
В табл. 1 наведені дані вмісту загальних ЛП, а на рис. 1 — вмісту фракцій ЛП сироватки крові та цитозолю печінки щурів за умов розвитку оксидативного стресу, спричиненого введенням СоСl2. Як видно, вміст за¬гальних ЛП крові значно підвищується на 2 год спостереження та зали-шається під¬вищеним у подальшому. При цьому зростає вміст всіх фракцій ЛП, окрім хіло¬мікронів (ХМ). Динаміку змінень вмісту загальних лі¬по¬про¬теїнів повторюють фракції - та пре--ЛП, тоді як рівень -ЛП до 24 год залишається зниженим. Загальний рівень ЛП в сироватці крові залишається під¬вищеним протягом усього експерименту, а в цитозолі печінки він норма¬лізується через 3 доби, а потім знову знижується через 4 доби після ін’єкції.
Таблиця 1.
Вплив хлориду кобальту на вміст загальних ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів, мг/мл(г), n=6.
контроль 30 хв 2 год 24 год 48 год 72 год 96 год
кров 2.690.03 2.660.01 6.48 0.03* 6.830.06* 5.870.05* 5.230.24* 3.35 0.25*
печінка 6.810.10 5.640.25* 5.17 0.06* 7.860.04* 7.710.32* 6.06 0.28 5.39 0.05*
* — Вірогідні зміни (р0.05 до контролю)
Зниження в цитозолі печінки вже на 30 хв вмісту пре--ЛП (Рис. 1), во¬чевидь, свідчить про викид пула готових ЛП до крові. Це можна розгля¬да¬ти як один з показників розвитку стрес-реакції та переми¬кання мета¬бо¬лізму на утилізацію ліпідів [Панин Л.Е., 1983, Калиман П.А., Шаламов Р.В., Загайко А.Л., 1997] у відповідь на дію хлориду кобальту. На користь цього говорить і різке зниження вмісту ХМ у сироватці крові, та їх зникнення до 72 год, можливо, пов’язане з активацією ліпопротеїнліпази (ЛПЛ) за умов стресу.
Спостереження в нашому експерименті істотного підвищення в ліпідному скла¬¬ді -ЛП печінки на 30 хв вмісту всіх ліпідних фракцій, з прийняттям до ува¬ги, що насцентні -ЛП практично не містять ЕХ, які утворюються в кро¬в’я¬ному руслі під дією ЛХАТ [Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995], дає змгу припусти¬ти, що ці ЛП захоплені печінкою з крові, тобто від¬бу¬вається при-скорення погли¬нання печінкою циркулюючих ЛП. Змінення до 30 хв скла¬ду і пре--ЛП печінки та крові, можливо, відображає підвищену потре¬бу тканин у ліпідах, пов’язану з активацією ПОЛ. Зниження вмісту загаль¬них ліпідів в стар¬товій зоні цитозолю печінки, можливо, свідчить про поси¬лен¬ня включення ліпідів до ЛП, що синтезуються в печінці, головними з яких є пре--ЛП. Відзначене до 2 год підвищення вмісту всіх фракцій ЛП (окрім ХМ) сиро¬ватки крⳠта зниження їх у цитозолі печінки (Рис.1) свід¬чить про активацію секреції ЛП пе¬чінкою. Загальний вміст ЛП у сироватці крові до цього часу істотно підвищується (Табл.1).
Сироватка крові
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
1-ЛП 2-ЛП -ЛП пре--ЛП ХМ
Цитозоль печінки
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
-ЛП -ЛП пре--ЛП старт
1- контроль, 2- 30 хв експозиції Со2+, 3-2 год, 4-24 год, 5-48 год, 6-72 год, 7-96 год.
*— Вірогідні зміни в порівнянні з контролем (р0.05)
Рис. 1. Вплив хлориду кобальту на вміст ліпопротеїнів сироватки крові і цитозолю печінки щурів (мг/мл, г тканини), n=6.
Звернемо увагу на те, що рівень -ЛП підвищується разом зі зростанням кон¬¬¬центрації пре--ЛП, що свідчить про активну роботу тригліцеридліпази (ТГЛ), що секретується печінкою. Ак¬ти-вація ліполі¬тичних ферментів — важ¬ли¬ва ланка стрес-реакції, спрямована на забез¬печення клітин джерелами енергії.
Склад всіх ЛП крові (окрім пре--ЛП), як відзна¬ча¬лося, до 2 год характе¬р謬зується істотним зниженням в них рівня ЗЛ, і характерна для стре¬су гіпер¬ліпідемія, що носить адапта¬ційний характер, досягається за рахунок під¬вищення вмісту цих обіднених ліпідами ЛП. Окрім зниження рівня ЗЛ, -ЛП крові збіднюються ФЛ, ВХ та ЕХ. Протилежні зміни скла¬ду -ЛП печінки вказують на інтенсив¬ний обмін ліпідами між ЛП крові та клі¬ти¬нами пери¬феричних тканин. Зниження вмісту ФЛ також в пре--ЛП сирватки крові, ймовірно, пов’язано з їх активною утилізацією тка¬нинами для гомео¬статичного коригування ліпідного складу мембран. Це підтвер-джується і тим, що у пре--ЛП печінки вміст ФЛ продовжує підви¬щу¬ва¬тись, тобто ослаблення їх включення у знову синтезовані частки не відбу¬вається.
Збільшення вмісту ЗЛ у стартовій зоні цитозолю печінки вказує, очевид¬но, на активацію до цього часу лі¬під¬синтезуючих систем або на вичерпання пулу апоЛП, що призводить до накопичення ліпідів, не зв’язаних з білками.
Відзначена у літературі [Авцын А.П. и др., 1991] атерогенна дія кобальту може проявлятись у перерозподілі холестеролу між атерогенними пре--ЛП та антиа¬те¬ро¬генними -ЛП на користь пер¬ших (при значному підвищенні вмісту загального холестеролу в сироватці крові [Шаламов Р.В., 1999]).
Важливим представляється зниження до 48 год вмісту ТГ у -ЛП цито¬золю печін¬ки. Воно, ймовірно, пов’язане з активацією за умов стресу печін¬кової ТГЛ, з ураху¬ванням відомого факту [Machley R.W., Hussian M.M., 1991], що ТГ потрап¬ляють до ЛВГ з ремнантів ХМ. Останні, як і зба-гачені ТГ -ЛП, є субстратом ТГЛ.
Р.В.Шаламовим [1999] було в謬су¬нуто припущення про інгібування за умов розвитку оксидативного стресу леци¬тин:холестерол-ацилтрансферази (ЛХАТ). На користь цього свідчать і відзначені в нашій роботі зміни в складі -ЛП печінки до 24 год: того часу, як рівень ВХ в них підвищений, вміст його ефірів — знижений в порівнянні з контролем .
У цитозолі печінки загальний вміст ЛП до 96 год знижується в порів¬нян¬ні з контролем (Табл.1), що, ймовірно, пов’язано з все ще інтен¬сив¬ною секрецією їх до кровообігу. Нормалізація рівня ЗЛП в цитозолі печінки до 3 доби при підвищеному їх рівні в сироватці крові може бути наслідком насичення до цього часу периферичних тканин ліпідами, і, отже, послаб¬лення синтезу останніх печінкою.
Іони кобальту індукують окислення ЛНГ, що приводить до істотного змінення їх оксидативного статусу: вже на 30 хв експерименту вміст ізольованих подвійних зв’язків падає як у ЛВГ, так і у ЛНГ крові (Табл.2), причому у ЛВГ це зниження більш істотно (у 2 рази). Це може бу¬ти пов’язане з високим рівнем в ЛВГ ФЛ, що містять ненасичені жирні кислоти. До 2 год ці змінення ще більш виражені, та відзначаються навіть через добу після ін’єкції. Рівень продуктів ПОЛ у ЛВГ та ЛНГ крові підвищується до 30 хв експерименту, та повертається до норми тільки на 4 добу.
Таблиця 2.
Вплив хлориду кобальту на показники перекисного окислен¬ня ліпідів - ліпо¬про¬теїнів си¬ро-ватки крові та - +пре-- ліпопротеїнів сироватки крові і цитозолю печінки щу¬рів, n=6.
- ліпопротеїни
кон¬троль 30 хв 2 год 24 год 96 год
Сполуки з ізольованими подвійними зв’язками, Е/мл сироватки 5,67 0,16 2,15 0,10 1,97 0,09 5,64 0,29 5,88 0,12
Загальні гідроперекиси, нмоль/мл сироватки 41,15 1,25 81,83 2,24 168,07 1,37 46,92 1,77 42,15 0,25
– Токоферол, нмоль/мл сироватки 9,88 0,72 1,96 0,22 0,28 0,03 7,17 0,14 8,54 0,61
- +пре-- ліпопротеїни
Сироватка крові
Сполуки з ізольованими подвійними зв’язками, Е/мл сироватки 2,11 0,14 1,68 0,13* 0,84 0,08 1,86 0,15 1,59 0,09*
Загальні гідроперекиси, нмоль/мл сироватки 51,47 1,84 52,91 2,14 82,24 1,43 69,03 3,15 53,86 1,06
– Токоферол, нмоль/мл сироватки 3,02 0,09 2,87 0,13 сліди 0,13 0,02 2,84 0,19
Цитозоль печінки
Сполуки з ізольованими подвійними зв’язками, Е/г тканини 3,18 0,14 0,99 0,09 0,85 0,08 1,88 0,18 2,84 0,26
Загальні гідроперекиси, нмоль/г тканини 75,29 1,86 502,8142,79 221,625,48 74,16 2,28 79,16 6,91
– Токоферол, нмоль/г тканини 4,14 0,36 0,19 0,02 сліди 0,32 0,03 3,42 0,34
* — вірогідні зміни (р0.05 до контролю)
Окисляються і ЛНГ печінки: вже до 30 хв експозиції кобальту у них під¬вищується вміст первинних і вторинних продуктів ПОЛ. Привертає увагу динаміка -токоферолу: у ЛВГ та ЛНГ крові його вміст різко падає на 30 хв, а у ЛНГ крові та печінки він до 2 год експерименту не вияв-ля¬ється (Табл. 2).
Як видно, ЛВГ підвладні окисним модифікаціям не в меншому ступеню, ніж ЛНГ, але вони є і краще захищеними — зокрема, мають первісно у 2 рази більш високий рівень токоферолу, ніж ЛНГ. За рахунок наявності в них великої кількості токо¬феролу, а також ненасичених ЖК фосфоліпідів, -ЛП можуть виступати пасткою вільних радикалів. Крім того, саме ці ЛП найдовше циркулюють в крові, виконуючи захисну функцію. У той час, як вміст -токоферолу у ЛВГ повертається до норми на 4 добу експерименту, його рівень у ЛНГ у цей час все ще знижений.
Ще раз підкреслимо, що окисно-модифіковані ЛНГ виявляються і в печінці. Те, що пік накопичення продуктів ПОЛ у них відзначається пізніше, ніж у крові, може свідчити як про поглинання печінкою окислених ЛП з кровообігу, так і про активацію ПОЛ в органі [Калиман П. А. и др., 1997].
Таким чином, отримані результати свідчать, що одноразове введення хлориду ко¬баль¬ту, який викликає розвиток оксидативного стресу, істотно впливає на тран¬спорт лі¬пі¬дів. Ймовірно, це пов’язано з функціо¬нуванням систем, що підтр¬иму¬ють структур¬но-фун¬кціональну цілісність біологічних мембран, та забезпечують кліти¬ни джерела¬ми енергії. Можна стверджу¬вати, що оксидативний стрес, викликаний вве¬ден¬ням хлориду кобальту, носить атерогенний характер. Він прояв¬ляється як у перерозподілі ліпопротеїдних фракцій на користь атерогенних, так і у оксидативних модифікаціях ЛП.
Вплив інгібіторів білкового синтезу на вміст та склад ліпопротеїнів си¬ро¬ват¬ки крові і цитозолю печінки щурів при оксидативному стресі, викли¬какному введенням хлориду кобальту. Для вияснення можливих ме¬ханізмів впливу оксидативного стресу, спричиненого введенням іонів кобальту, було про¬ведено серію досліджень по вивченню змін відповіді на стрес з боку лі¬пі¬дів за умов вимикання синтезу білку на етапах транскрипції і трансляції. Це дало підстави припустити, як відбувається зміна актив¬ності ферментів ліпід¬ного обміну – за рахунок змін транскрип¬ції відповідних ге¬нів, трансляції наявного пулу мРНК або через зміни активностей вже син¬тезованих ферментів, а також простежити вплив обмеження синтезу апо¬біл¬ків на характер реакцій відповіді з боку збирання та катаболізму ліпопротеїнів. Для цього за 30 хв. до ін’єкції тваринам СoCl2, їм вводили одноразово внутрішньочеревно AmD (актиноміцин D — інгібітор транскрипції) або ЦГИ (цик¬логексимід — інгібітор тран¬сляції) [McCormick C.C., et al., 1991]. Вивчали вміст та склад ЛП цитозолю печінки та сироватки крові.
Самі антибіотики досить істотно впливають на вміст ЛП. Так, анти¬біо¬тики до 2.5 год експерименту хоча і не викликали зміни загального вмісту лі¬по¬протеїнів, але привели до певного перерозподілу їхніх фракцій (Табл.3). І Аm D, і ЦГИ викликали зниження вмісту фракцій -ЛП і пре--ЛП, тобто фракцій, переважно синтезованих печінкою. Ця дія аналогічна дії окси¬дативного стресу, спричиненого кобальтом. У той же час кіль¬¬кість -ЛП, що голов¬ним чином поглинаються печінкою, підви¬щується. Те, що Со2+ не ви¬кликає підвищення вмісту -ЛП, можна зв’язати з тим, що при оксида¬тив¬ному стресі окислені ЛП захоплюються у великій кількості макрофагами [Зенков Н.К., Меншикова Е.Б., 1996], а антибіотики, як було знайдено, не викликають істот¬них оксидативних мо¬дифікацій ЛП, хоча і, вочевидь, дещо активують вільно¬ради¬каль¬не окислення. Схожі тенденції спосте¬рігаються і в апо-В-ЛП сироватки крові та цитозолю печінки.
В сироватці крові в умовах нашого експерименту відзначені розбіж¬нос¬ті в дії антибіотиків і оксидативного стресу на вміст ЛП (Табл.3). Так, Аm D викликає зростання до 2.5 год концентрації 1-ЛП, а ЦГИ — її зниження. Те ж характерно і для пре--ЛП. На підставі цих даних можна при-пустити, що зни¬ження вмісту зазначених фракцій у печінці може бути зв’язане при вве¬денні антибіотиків не тільки з необхідністю викиду ЛП у кров, як при окси¬да¬тивному стресі, але і з гнобленням синтезу апобілків, кон¬центрація яких у знач¬ній мірі лімітує швидкість утворення ЛП [Климов А.Н., 1995]. Причому ос¬таннє більш характерно для ЦГИ (ін¬гі¬бітору трансля¬ції), що говорить про мож¬ливість існування в гепатоциті пула мРНК для апо¬білків пре--ЛП і -ЛП. Крім того, оксидативний стрес вик¬ликав зни¬жен¬ня в цитозолі печінки вміс¬ту ліпідів, не зв’язаних із біл-ками (фракція стар¬то¬вої зони — див. вище), мабуть, у результаті їхнього актив¬ного вклю¬чен¬ня до ЛП, а антибіотики не ви¬являли такої дії, що також говрить на користь припущення про дефіцит апо¬білків, котрий викли¬ка¬ється антибіотиками.
Таблиця 3.
Вплив антибіотиків на вміст ліпопротеїнів цитозолю печінки та сироватки крові щурів при оксидативному стресі, мг/г тканини (мг/мл сироватки), Mm, n=6
цитозоль печінки Загальні ЛП -ЛП -ЛП пре- -ЛП старт
контроль 6.890.15 0.810.05 1.010.09 3.920.12 1.150.09
AmD 6.73±0.29 0.53±0.05* 1.48±0.03* 3.37±0.24* 1.35±0.09
2.5 ЦГИ 6.15±0.55 0.62±0.04* 1.25±0.09* 3.17±0.25* 1.11±0.09*
год AmD+Co2+ 4.630.14*# 0.41±0.04* 0.82±0.06*# 2.18±0.11*# 1.22±0.12#
ЦГИ+Со2+ 4.66±0.16*# 0.37±0.04*# 0.78±0.05*# 2.12±0.14*# 1.39±0.09*#
AmD 7.11±0.25 0.69±0.05* 1.45±0.08* 3.56±0.21* 1.41±0.09*
24 ЦГИ 6.29±0.47 0.49±0.05* 1.31±0.11* 3.55±0.14* 0.98 ±0.08
год AmD+Co2+ 7.13±0.35# 0.91±0.06# 1.01±0.11 3.54±0.29# 1.67±0.15*#
ЦГИ+Со2+ 6.95±0.22# 0.99±0.03# 0.97±0.07 3.44±0.18*# 1.55±0.06*#
сироватка крові 1-ЛП 2-ЛП -ЛП пре--ЛП ХМ
кон¬троль 0.50± 0.05 0.49± 0.04 0.83± 0.06 0.72±0.05 0.09± 0.01
Am D 0.39± 0.03# 0.45±0.04# 0.92±0.04# 0.65±0.02# 0.05± 0.01*#
2,5 ЦГИ 0.37± 0.02*# 0.50±0.03# 0.85±0.05# 0.62±0.04*# 0.10± 0.02
год AmD+Со2+ 1.05± 0.09* 1.30±0.06* 2.09±0.09* 1.91±0.08* 0.08± 0.03
ЦГИ+Со2+ 0.97± 0.08* 1.25±0.09*# 1.95±0.24* 1.75±0.12* сліди*#
Am D 0.36± 0.02*# 0.42±0.03# 0.97±0.05*# 0.61± 0.04# сліди*#
24 ЦГИ 0.29± 0.03*# 0.44±0.04# 0.79±0.08# 0.54±0.05*# сліди*#
год AmD+Со2+ 1.06± 0.05*# 0.98±0.08*# 1.33±0.09*# 1.29±0.11*# cліди*#
ЦГИ+Со2+ 0.86± 0.05*# 1.00± 0.09* 1.52± 0.08*# 1.14±0.12*# сліди*#
*- вірогідно до контролю (р0.05); #- вірогідно до Со2+ (р0.05)
До 24 год антибіотики привели до зникнення з крові ХМ (Табл.3), можливо, у результаті інгібування синтезу їхніх апобілків у стінці ки¬шеч¬ни¬ка, або впливу на процеси всмоктування жирів. Ймовірно, в результаті не¬до¬стачі апобілків1 антибіотики викликають і підвищення загального вміс¬ту ліпідів у складі -ЛП крові і печінки. Такий ефект не характерний для інших фракцій ЛП. Це, з прийняттям вищевис¬казаного припущен¬ня, гово¬рить про най¬більшу залежність саме цих ЛП від синтезу апобілків.
При спільному введенні з хлоридом кобальту, антибіотики в печінці до 2.5 год під¬силюють зниження ЗЛП (Табл.3), яке при оксидатив¬ному стресі, могло бути пов’я¬зано з посиленням секреції ЛП у кров. В крові цей ефект спосте¬рі¬гається більш виражено до 24 год, коли антибіотики істотно згладжують виникаючу при ок¬с謬датив¬ному стресі гіпер¬ліпопро¬теїдемію.
На тлі підвищеного в крові рівня -ЛП, їх¬нє надходжен¬ня до пе¬чін¬ки, ма¬буть, не підсилюється і при сумісному введенні анти¬бі¬отиків і хлориду ко¬баль¬ту. Раніше нами було висловлене припущення, що підви¬щення в печінці вмісту -ЛП при оксидативному стресі зв’язано з поси¬лен-ням їхнього поглинання, а не синтезу. Про це свідчило підвищен¬ня в них кіль¬кості ЕХ. При вве-денні антибіотиків, особливо ЦГИ, навпаки, кількість ЕХ у -ЛП печінки зни¬жене, на підставі чо-го можна припустити роз¬ходження в меха¬ніз¬мах зниження концентрації цієї фракції під дією оксидативного стресу й антибіотиків, а саме — при¬гні¬чен¬ня під дією анти¬біотиків складання ЛП. На користь ослаблення складання -ЛП говорить і згадуване вже зба¬га¬чення цих ЛП у печінці ЗЛ, особливо ФЛ і ВХ. Ці ліпіди, як відомо, поряд з апобілками починають формування ЛП частин¬ки, створюючи її повер¬хневий гідрофільний шар, і підвищення їхнього пи¬томого вмісту в ЛП час-тинці може бути компен¬саторним при нестачі апбіл¬ків. Цікаво, що самі анти¬біотики, ймовірно, викликають зниження актив¬ності ЛХАТ-реакції, можли¬во, через пригні¬чення синтезу самого ферменту або його білків-акти¬ваторів, про що свідчить підвищення в -ЛП крові вмісту вільного холе¬сте¬рину на тлі зниження в них кількості ЕХ. Антибіотики викликають до 24 год достовірне зниження вмісту пре--ЛП печінки і крові (Табл. 3) в порівнянні з дією оксидативного стресу, що вказує на високу швидкість обміну апобілків цих ЛП. По¬діб¬ні зміни вмісту -ЛП можуть свідчити про те, що в умовах стресу можуть швидко обмінюватись загальні для цих ЛП апобілки, тобто апо С. На користь нестачі цього апобілка, що, як відомо, є ак¬ти¬ва¬тором ЛХАТ (апо C I) і ЛПЛ (апо С II) говорять зга¬дані вище дані про перерозподіл холесте¬ролових фракцій, а також іс¬тот¬не підвищення рівня ТГ у -ЛП і -ЛП крові під впливом антибіотиків.
Таким чином, можна припустити, що в умовах розвитку оксидативного стре¬су синтез стресорних білків є найважливішою реакцією, і його пору¬шен¬ня істотно псує хід процесів адаптації. Виявлено, що не стільки самі анти¬біотики, скільки антибіотики разом з хлоридом кобальту досить істотно впливають на вміст і склад ліпопротеїнів. Це може бути зв’язане як із їхньою безпосередньою дією як інгібіторів синтезу білка, так і з їхньою дією, як ксенобіотиків. Ми припускаємо можливість част¬кової заміни апоЛП, що виконують структурну функцію, амфіфільними ліпідними фракціями, а також різну швидкість обміну різних апобілків при оксидативному стресі.
Вплив іонів кобальту на вміст та склад ліпопротеїнів сироватки крові і цитозолю печінки in vitro. Зміни в ліпідному статусі, що спостерігаються in vivo є ре¬зуль¬татом складної взаємодії багатьох метаболічних ланок і чин¬ників. У зв’язку з цим важливою є розробка модельних систем для вивчення окремих дільниць дії оксидативного стресу. Зокрема, це могло да¬ти змогу вивчити дію іонів кобальту на ЛП, не опосередковану гормо¬наль¬ною та іншими регуляторними системами.
Нами вивчено вплив іонів кобальту на вміст та склад ЛП сироватки крові та цитозолю печінки щурів.
Виявлені істотні відмінності між дією теплової їнкубації та інкубації в при¬сутності іонів кобальту1. Привертає увагу також різниця між вмістом ЗЛП, визначеним турбі¬диметричним методом, та сумою окремих фракцій. Це вказує на те, що в сироватці крові, інкубованій з додаванням іонів ко¬баль¬ту, з’являються вільні ліпіди, які при електрофорезі залишаються на ста¬р¬ті, домішуючись до фракції ХМ. Схожа картина спостерігається і в пе¬чін¬ці. Це може свідчити про індукцію іонами кобальту розпаду ЛП части¬нок.
Відзначимо, що найбільш чутливими як до теплової деструкції, так і до дії іонів кобальту, виявилися апо-В-ЛП. Так, вміст пре--ЛП крові падає при тепловій інкубації, хоча вміст решти фракцій залишається незмінним. В печінці теплова інкубація призводить до зниження рівня усіх фракцій ЛП, що може, як ми припускаємо, бути наслідком їх ще неповного збиран¬ня, зокрема, недостатньої кількості антиоксидантів. Іони кобальту спри¬чиняють зниження вмісту апо-В-вміщуючих ЛП в порівнянні як з нормою, так і з холостою інкубацією.
Припущення про безпосередній розпад ЛП часток підверджується також і тим, що в складі ЛП сироватки крові відзначається зменшення загальної кількості ліпідів. В цитозолі ж печінки ці зміни більш виражені при інкубації з Со2+. Того ж часу, кількість ліпідів, що залишилися на старті, тобто не зв’я¬заних з білками, зросла в сироватці крові. В печінці ж, вочевидь, ліпіди пере-розподіляються між ЛП різних фрак¬цій. Зниження вмісту ЕХ, що спос¬терігається в ЛП цитозолю печінки, ймовірно, відбувається за рахунок їх гідролізу, а утворений ВХ, принаймні частково, утилізується -ЛП, внас¬лідок чого рівень ВХ в -ЛП підвищений. При інкубації з Со2+, вірогідно, до цього залучаються і пре--ЛП.
Приверає увагу зниження в усіх ЛП фракціях крові кількості ВХ та ЕХ. Са¬ме випадання ВХ та зниження вмісту ФЛ може бути причиною розпаду ЛП часток.
Узагальнюючи вищевикладене, можна відзначити, що іони Со2+ безпо¬се¬редньо впливають на ЛП частки, викликаючи руйнування останніх, при¬чому до їх дії вияв¬ляються більш чутливими апо-В-вміщуючі ЛП, що узгод¬жується з відомими фактами. Це також підтверджує висловлені вище при¬пущення про неспецифічність атеро¬генної дії високих доз кобальту. Також відзначимо, що під впливом як холостої, так і інкубації з Со2+ в печінці, ймовірно, відбувається головним чином розпад ЛП частинок, а в сироватці крові — їх модифікація, того часу, як іони Со2+ можуть спричиняти інтенсивну деградацію ЛП і сироватки крові. В ефектах, які ми спостерігали при вивченні розвитку оксидативного стресу, спричиненого іонами кобальту, визначену роль відіграє і безпосередній вплив цих іонів на ЛП частки. Однак в умовах in vivo вільні ліпіди, які утворюються при розпаді ЛП, можуть зв’язуватись альбуміном або вільними апобілками, синте-зованими печінкою [Климов А.Н., 1995], що в значній мірі нормалізує реакції відповіді на оксидативний стрес.
ВПЛИВ ТЕТРАМІЗОЛУ НА ВМІСТ ТА СКЛАД ЛІПОПРОТЕЇНІВ СИРО¬ВАТКИ КРОВІ І ЦИТОЗОЛЮ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ.
Введення тетрамізолу ([+]-2,3,5,6-тетрагідро-6-феніламідазо-{2, 1-b}-тіазолу) щу¬рам у дозах, близьких до ЛД50 активує вільнорадикальне окислення, що суп¬ро¬вод¬жу¬ється розвитком оксидативного стресу [Калиман П.А. и др., 1998]. Ви¬ходячи з цьо¬го, ми використали одноразове внутріш¬ньо¬черевне введення тва¬ринам тет¬ра¬мі¬золу як мо¬дель ок¬си¬дативного стресу, щоб вияснити, чи є ре¬аꬬції ві¬дповіді, що спос¬¬те¬рігалися в експ嬬риментах з введенням хлориду кобальту, специфічними для саме цього стресу¬ючого агента.
Вже через 30 хв після введення тетрамізолу у фракції -ЛП крові підвищується вміст гідропероксидів ліпідів, що свідчить про активацію ПОЛ. У подальші 1.5 год їх вміст ще більше зростає (р
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
