УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ СВИНАРСТВА УААН
ГЕЙКО ОЛЬГА ОЛЕКСІЇВНА
УДК 612.1:547.964.42
ФІЗІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ ПРИРОДНОГО
ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСУ НИРОК ТА ЙОГО
СИНТЕТИЧНИХ АНАЛОГІВ В УМОВАХ
НОРМИ І ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ЇЇ ПОРУШЕННЯХ
03.00.13 – фізіологія людини і тварин
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Полтава – 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Центральній науково-дослідній лабораторії Української медичної стоматологічної академії (м. Полтава)
Науковий керівник: кандидат медичних наук, старший науковий
співробітник КАЙДАШЕВ ІГОР ПЕТРОВИЧ,
завідувач Центральної науково-дослідної
лабораторії, Українська медична стоматологічна
академія
Офіційні опоненти: – доктор біологічних наук, провідний науковий
співробітник ІС УААН МАРТИНЕНКО НІНА
АНТОНІВНА, Інститут свинарства УААН;
– кандидат біологічних наук ЛАЗАРЄВА ЗОРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, завідувач курсом патологічної фізіології Полтавского філіалу институту народної медицни (м.Полтава)
Провідна установа: – Київський національний університет
ім. Тараса Шевченка
Захист відбудеться “_10 ”_вересня 1999р.
в 10 годин на засіданні спеціалізованої вченої ради К 44.351.01 при Інституті свинарства УААН за адресою: 314006, Полтава, Шведська Могила.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту
свинарства УААН (м.Полтава, Шведська Могила).
Автореферат розісланий “26” 07 1999 р.
Вчений секретар кандидат
біологічних наук Підтереба О.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. До сьогодення однією з найважливіших проблем залишається взаємодія структурних елементів тканин у багатоклітинному організмі [Тепермен Дж., Тепермен Х. 1989]. Численними дослідженнями висунуто і доведено припущення про наявність в організмі біологічних регуляторів пептидної природи [Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1998; Чипенс Г.И., 1984; Фролькис В.В., 1999], які здійснюють перенос інформації, необхідної для функціонування, розвитку, взаємодії клітинних популяцій. Сполуки поліпептидної природи забезпечують клітинні взаємозв’язки в межах того органу, в якому вони утворюються. Проблема вивчення механізму дії і застосування природних пептидних біорегуляторів є однією з ключових в сучасній біології. Головною функцією регуляторних пептидів є участь у контролі генетичного гомеостазу, репаративних та адаптаційних процесів, неспецифічної резистентності організму [Кузник Б.И.1988; Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. 1998; Федосеев Г.Б. та співавтори 1987; Low T.L. et al. 1984].
Такі пептидні комплекси здатні впливати не лише на здорові клітини, але і на стан метаболічних процесів в ушкоджених клітинах, змінюючи їх, таким чином нормалізуючи функції. Встановлено, що регуляторні пептиди впливають на активність К+, Nа+, Са2+- АТФ-аз, змінюють фосфоліпідний склад мембран клітин. Не виключено, що подібні властивості притаманні багатьом пептидним комплексам, і залежать від того, з якої тканини вони виділені, від функціонального стану тканин, а також виду патологічного процесу [Кузник Б.И. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1998].
Препарати фізіологічно активних пептидів отримані з різних органів і тканин [Витковский Ю.А., 1990; Кайдашев И.П. та співавтори 1992; Литвиненко Н.В. 1992; Силенко Ю.И. 1992] Вони виявляють виражену модулюючу та корегуючу органоспецифічну дію на стан систем регуляції в ураженому органі та в цілому організмі. Таким чином, поліпептидні екстракти мають наступну ефекторну спрямованість [Кайдашев И.П. 1994]: дія на той орган, із якого вони виділені; на органи, яки з ним фізіологічно корелюють; неспецифічна дія на організм у цілому.
Важливість вивчення регуляції фізіологічних і патологічних процесів у нирці не викликає сумніву, оскільки нирка є об’єктом регуляторної дії багатьох біологічно активних речовин. Цей орган дуже чуйно реагує зміною функціональної активності на пептидні біологічно активні речовини. Наприклад, антидіуретичний гормон бере участь у фізіологічних процесах, які відбуваються в мозковій речовині нирок, особливо в реабсорбції води. Кініни, що утворюються в нирках, мають істотний вплив на резистентність їх судин, збільшують екскрецію натрію і води [Gill J.R. et all.1965]. Аргінін вазопресин (АВП) має виразну фізіологічну дію на ниркову і нениркові тканини, здійснює пресорну дію на гладеньку мускулатуру судин [Рибальченко В.К. 1998]. АВП чинить залежне від дози гальмування вивільнення нирками реніну [Shade R.E et al. 1973; Khokhar A.M. et al. 1976; Hesse B. et al. 1977], стимулює синтез простагландинів мозковою речовиною нирок [Zusman R.M. et al 1974].
З нирок був виділений пептидний комплекс, який виявив виражену регуляторну дію на процеси зсідання крові, фібриноліз, активність імунної системи, вплив на процеси регенерації, а також на процеси секреції і реабсорбції в нирках [Кайдашев И.П. та співавтори 1994, Аль-Шукри С.Х., Горбачев А.Г., Тюрин А.Г., Амдий Р.Г., 1996]. Таким чином, експериментальне вивчення біологічної активності пептидних комплексів є однією з важливих проблем як фізіології, так і патофізіології, тому що є всі підстави вважати, що найближчим часом вони знайдуть найширше застосування в клінічній практиці. У той же час, перспективи практичного використання природних пептидів вимагають розробки синтетичних їх аналогів. Останнім часом були отримані синтетичні аналоги пептидного комплексу нирок [Кайдашев И.П. 1995], які мають таку амінокислотну послідовність: про-глу-ліз-асп-сер-арг-ліз – (PEKDSRK), про-глу-лиз-асп-лей-арг-ліз- (PEKDLRK), про-глу-ліз-асп-асп-арг-лей- (PEKDDRL) (в дужках наведений однолітерний код амінокислот). За синтез пептидів-аналогів приносим подяку проф. Рамензі і доктору Стефановічу (м. Гейдельберг, німецькій центр досліджень раку). Отримані синтетичні субстрати використовувались в подальшіх наших дослідженнях з метою формування теоретичної основи для їх подальшого застосування. Активність синтетичних пептидів порівнювалась з активністю природного пептидного комплексу нирок.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом науково-дослідних робіт: МОЗ України – “Роль дисбалансу пептидергічної системи регуляції в розвитку типових патологічних процесів і шляхи її відновлення інформаційними молекулами поліпептидної природи”; (UA01001570Р); ДКНТ України – “Роль дисбалансу системи поліпептидної регуляції в розвитку патологічних станів, пов’язаних із дією несприятливих факторів зовнішнього середовища, і шляхи корекції препаратами поліпептидної природи” (N 01934007913).
Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення фізіологічної активності природного пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів за фізіологічних умов та при деяких експериментальних моделях патологічного стану для поглиблення знань про природу пептидної регуляції функцій нирок.
Відповідно до мети роботи були поставлені задачі дослідити:
– дію природного пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів за фізіологічних умов;
– фізіологічну активність природного пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів при експериментальному аутоімунному нефриті на щурах і хом’яках з оцінкою видоспецифічності дії;
– фізіологічну активність природного пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів при токсичному ураженні нефротропними речовинами;
– порівняти фізіологічну активність пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів як потенційних лікарських препаратів.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано, що природний пептидний комплекс нирок бере участь у регуляції единої фізіологічної системи підтримки резистентності організму, яка в свою чергу, утворена системами антиоксидантного захисту, гемостазу та імунітету. Ці дані підтверджені при використанні синтетичніх пептидів. Показано, що синтетичні пептиди PEKDSRK, PEKDLRK, PEKDDRL мають фізіологічну активність, спрямовану на регуляцію процесів ПОЛ, АО гемостазу та імунітету, яка збігається з активністю природного пептидного комплексу нирок.
Вперше доведено, що синтетичні пептиди PEKDSRK, PEKDLRK, PEKDDRL можуть бути використані для дослідження пептидної регуляції метаболічних процесів (ПОЛ та фізіологічної АОС) в нирках. Показано, що досліджені синтетичні пептиди не мають ознак видоспецифічності дії, що передбачає універсальність пептидної регуляції нирок у різних видів. Отримані нові дані, що підтвержують концепцію про існування в нирках локальної системи пептидної регуляції, яка впливає не тільки на фізіологічні процеси в цьому органі, але й в інших органах та системах (кров, тимус, кістковий мозок).
Розкрита фізіологічна активність синтетичних пептидів дозволяє розглядати їх як можливих коректорів фізіологічних процесів, порушених при нирковій патології.
Практична цінність отриманих результатів. Одержані результати, які стосуються фізіологічної дії синтетичних пептидів PRKDSRK і PEKDDRL, можуть бути використані для подальшого їх дослідження в клініці з метою застосування в якості біокоректорів систем: імунної. антиоксидантної, гемостазу. Окремі матеріали дисертації є фрагментом доклінічних іспитів пептидного комплексу нирок, як потенційного лікарського препарату з терапевтичними властивостями.
Особистий внесок здобувача. Автор особисто розробив програму наукових досліджень, виконав цитологічні та імунологічні дослідження. Самостійно провів аналіз всього отриманого фактичного матеріалу. Розробка основних положень і висновків роботи також належить дисертанту.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації повідомлені на підсумкових наукових конференціях Української медичної стоматологічної академії (1994-1996); конференціях молодих вчених “Фізіологія і патологія перекисного окислення, гемостазу і імуногенезу” (1995, 1996, 1997, 1998, 1999 Полтава).
Апробація дисертації проведена на засіданні Апробаційної ради №1 Української медичної стоматологічної академії (1999).
Публікації. Результати дисертації викладено в 6 наукових роботах.
Обсяг роботи. Дисертація викладена на 119 сторінках друкованого тексту українською мовою і складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи досліджень”, власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, списку використаних літературних джерел, що містить 174 роботи, з них 102 – латиніцею. Дисертація містить 20 таблиць, ілюстрована 8 мікрофотографіями.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для вирішення поставлених завдань використали 96 білих статевозрілих щурів-самців лінії Wistar та 72 золотистих хом’яка.
Частина спостережень була проведена на крові 25 донорів віком 25 – 31 рік. У відповідності з завданнями і обраними експериментальними моделями були використані цитологічні, імунологічні, біохімічні і гістологічні методи дослідження, які подані в табл. 1
Таблиця 1.
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Показники,
що вивчалися Субстрат Автори методик
1. Т- і В-лімфоцити Т-хелпери,
Т-супресори, О-клітини. кров, люди Лебедев К.А.,
Панякина И.Д., 1990
2. Т- і В-лімфоцити кров, тварини Binaghi R.A., 1975
3.Мембранні маркери лімфоцитів – CD-3, 4,8,72. кров Boyum A., 1968
4. ЛКБ кров Пигаревский В.Е., 1978
5. Кількість еритроцитів кров Меньшиков В.В., 1987
6. Фагоцитоз кров Herscowitz H.B., 1981
7. Кількість лейкоцитів кров Меньшиков В.В., 1987
8.Бласттрансформація кров Чернушенко Е.Ф., 1978
9.Залишковий азот кров Предтеченский В.Е., 1950
10. СОД кров Брусов О.С., и др. 1976
11. Каталаза кров Архипова О.Г., 1988
12. Дієнові кон’югати плазма Воскресенский О.Н., 1982
13.Церулоплазмін плазма Колб В.Г., и др. 1982
14. Хлориди плазма Меньшиков В.В., 1987
15.В-ліпопротеїди сироватка Меньшиков В.В., 1987
16.Цитохромоксидаза тканина нирок Straus W., 1954
17.Креатинін сироватка Popper H., 1937
18.Сечовина сироватка Breintk, 1970
19.Кінетика накопичення МДА тканини нирки Владимиров Ю.А., 1972 ,
Арчаков А.И., 1972
20.Холестерин сироватка Меньшиков В.В., 1987
21. Кількість РНК та ДНК в тканинах тканини нирок Трудолюбова М.Т., 1977
22. Час рекальцифікації плазма Bergerhof H.D., Roka L. 1954
23.Протромбіновий час плазма Quick A.J., 1966
24.Тромбіновий час плазма Biggs R.M., et. al.
25.АЧТЧ плазма Biggs R.M.
26.Антитромбін – ІІІ плазма Hensen A. et al.
27.Фібриноліз плазма Котовщикова М.А.,
Федорова З.Д. 1966
28.Спонтанний гемоліз еритроцитів кров Спиричев В.Б. та др. 1979
Експериментальні групи тварин
Таблиця 2
№ серії Експериментальна модель Доза, термін і спосіб введення фізіологічно активних речовин
1 2 3
1 Аутоімунний нефрит, ЩУРИ
1 – інтактна група
2 – тварини з нефритом 0,2 мл фізіологічного розчину, 7 діб в/м.
3 – тварини з нефритом 0,12 мг/кг PEKDSRK, 7 діб в/м
4 – тварини з нефритом 0,12 мг/кг PEKDLRK, 7 діб в/м
5 – тварини з нефритом 0,12 мг/кг PEKDDRL, 7 діб в/м
6 – тварини з нефритом 0,12мг/кг ППКН, 7 діб в/м
2 Аутоімунний нефрит, ХОМ”ЯКИ
1 – інтактна група
2 – тварини з нефритом 0,2 мл фізіологічного розчину, 7 діб в/м.
3 – тварини з нефритом 0,12 мг/кг PEKDSRK, 7 діб в/м
4 – тварини з нефритом 0,12 мг/кг PEKDLRK, 7 діб в/м
5 – тварини з нефритом 0,12 мг/кг PEKDDRL, 7 діб в/м
6 – тварини з нефритом 0,12мг/кг ППКН, 7 діб в/м
3 Фториста інтоксикація, ЩУРИ
1 – інтактна група
2 – контрольна група 0,2 мл фізіологічного розчину, 7 діб в/м.
3 – контрольна група 0,12 мг/кг ППКН, 7 діб в/м
4 Гостре ортуення етиленгліколем, ЩУРИ
1 – інтактна група
2 – контрольна група 0,2 мл фізіологічного розчину, 7 діб в/м.
3 – контрольна група 0,12 мг/кг ППКН, 7 діб в/м
5 Віддалений термін після отруення етіленгіколем, ХОМ”ЯКИ
1 – інтактна група
2 – контрольна група почінаючі з 5 доби, 0,2 мл фізіологічного розчину, 7 діб в/м.
3 – контрольна група 0,12 мг/кг PEKDSRK, 7 діб в/м
4 – контрольна група 0,12 мг/кг PEKDLRK, 7 діб в/м
5 – контрольна група 0,12 мг/кг PEKDDRL, 7 діб в/м
6 – контрольна група 0,12мг/кг ППКН, 7 діб в/м
Експериментальну модель аутоімунного ураження нирок відтворювали за методикою Kment A., Hofescker G. [1976]. Водно-сольовий екстракт нирок змішували з ад’ювантом Фрейнда (1:1) до утворення стійкої емульсії, яку вводили тваринам внутрішньом’язово в дозі 0,2 мл тричі з інтервалом в 7 діб. Починаючи з 15 доби, тварин ділили на групи: перша – інтактні тварини, друга – контрольна з аутоімунним нефритом (АН) та введеннням фізіологічного розчину, третя – АН з введенням пептиду PEKDSRK, четверта – АН з введенням PEKDLRK, п’ята – АН з введенням PEKDDRL, шоста – АН з введенням природного пептидного комплексу нирок (ППКН). У всіх дослідах ППКН та його синтетичні аналоги вводили у дозі 0,12 мг/кг в 0,2 мл фізіологічного розчину. Порівняння проводили з группою інтактних тварин.
Гостре токсичне ураження етиленгліколем викликали шляхом перорального введення його щурам в дозі 1г/кг ваги тіла. Через добу тварин поділяли на 2 групи: – контрольну (етиленгліколь з іньекцією фізіологічного розчину) і дослідну (етиленгліколь з іньекцією ППКН) на протязі 7 діб.
Наслідки токсичного ураження етиленгліколем у віддалений термін і фізіологічну роль ППКН та його синтетичних аналогів вивчали на хом’яках шляхом перорального введення розчину етиленгліколю в дозі 1г/кг ваги тіла. Через 5 діб тварин розподіляли на групи: 1-ша – інтактні тварини, 2-га – контрольні (ураження етиленгліколем і введення фізіологічного розчину), 3-я – ураження етиленгліколем і введення пептиду PEKDSRK, 4-та – введення пептиду PEKDLRK, 5-та – введення пептиду PEKDDRL, 6-та – природний пептидний комплекс нирок.
Гостру інтоксикацію фтористим натрієм індукували у щурів шляхом введення в шлунок 3% розчину фториду натрію із розрахунку 250 мг/кг маси тіла [Авцин А.П., Жаворонков А.А., 1982]. Через добу тварин поділіли на 2 групи – контрольну (фторид натрію з додаванням фізіологічного розчину) і дослідну (фторид натрію з додаванням природного пептидного комплексу нирок).
Об’єктами досліджень були: кров донорів та тварин, сироватка крові, тканини нирок, тимусу, печінки, мозку, наднирників, селезінки.
Визначення Т- та В-лімфоцитів у тварин (золотисті хом’яки) проводили методом розеткоутворення з аутологічними еритроцитами, навантаженими антисироватками, що були отримані до тканин тимусу та лімфатичних вузлів [Фримель Г. 1987].
Визначення мембранних маркерiв донорів проводили методом непрямої флюоресценцiї з одночасним контролем в фазовому контрастi на мiкроскопi “Люмам-Р8” (ЛОМО, Росiя) [Фримель Г. 1987]. Лiмфоцити видiляли з периферічної кровi, стабiлiзованої гепарином, на градієнті фікол-верографін (густина 1.077г/мл). Відмиті лімфоцити в об’ємі 50 мкл (концентрація 1х106/мл) інкубували 45 хвилин при +40С з 5 мкл моноклональних антитіл (МКА). Використовували МКА виробництва Інституту імунології МОЗ Росії до СD-3, CD-4, CD-8, CD-72.. Спостерігали зелену флюоресценцію. Розраховували середній цитохімічний коефіцієнт [Astald G., Verga L. 1957].
Кількісне визначення РНК та ДНК в тканинах нирок проводили за методом [Трудолюбова М.Т. 1977], в основу якого покладено виділення нуклеїнових кислот з послідовним вилученням кислоторозчинних продуктів білків і ліпідів лужним (РНК) та кислотним (ДНК) гідролізом з наступним визначенням оптичної густини при 260 нм (РНК), 290 нм (ДНК) в порівнянні з екстинцією 270 нм за формулою ((Е270 – Е290)/ 0,19)* 10,1.
Отриманий цифровий матеріал був статистично оброблений на ПЕОМ ІВМ РС/АТ-286 “Omega”. Проводили обчислення середньої арифметичної (М), помилки середньої арифметичної (м), вірогідность отриманих результатів по коефіцієнту Ст’юдента (t).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
У відповідності із задачами роботи, нами була вивчена дія природного пептидного комплексу нирок (ППКН) та його синтетичних аналогів: про-глу-ліз-асп-сер-арг-ліз – PEKDSRK, про-глу-ліз-асп-лей-арг-ліз – PEKDLRK, про-глу-ліз-асп-асп-арг-лей – PEKDDRL за фізіологічних умов і при відтворенні різних експериментальних моделей.
ППКН, який виділений із тканини нирок [Патент], має як оганоспецифічні властивості – нормалізує функції нирок при різних ураженнях, так і імуномодулюючу дію – впливає на Т-клітинний ланцюг імунітету [Веснина Л.Э., Кайдашев И.П.,1998].
Враховуючи отримані дані, ми дослідили активність синтетичних пептидів у порівнянні з ППКН. Для цього ставили тести розетко-утворювання з еритроцитами барана та миші за методикою Лєбедєва К.О. та Панякіної І.Д. [1990].
Як показали наші дослідження, за фізіологічних умов синтетичні аналоги активували процеси фагоцитозу, прооксидантну та протеолітичну функції нейтрофілів, причому PEKDLRK найбільш підсилював кисень-активуючу функцію нейтрофілів, а PEKDSRK найбільш істотно підсилював протеолітичну активність.
Було встановлено, що синтетичні пептиди впливали на функціональну активність імунокомпетентних клітин: збільшували кількість Е-РУЛ теофілін-чутливих клітин. Найбільш активним виявився синтетичний пептид PEKDSRK, який збільшував кількість Е-РУЛ теофілін-чутливих в 1,6 рази відносно показників контрольної групи, синтетичний пептид PEKDLRK – в 1,2 рази, як і ППКН, а синтетичний пептид PEKDDRL – в 1,3 рази. Досліджені нами пептиди стимулювали фагоцитарну активність нейтрофілів, найбільш активним був ППКН, якій підсилював фагоцитарну активність в 1,8 рази. Пептиди PEKDDRL, PEKDSRK – в 1,7 та 1,5 рази відповідно. На показники М-РУЛ як природний пептидний комплекс так і його аналоги вірогідного впливу не мали.
Ми також дослідили вплив ППКН та його синтетичних аналогів на експресію поверхневих рецепторів лімфоцитів за допомогою реакції непрямої флюоресценції з використанням моноклональних антитіл СD-4 проти Т-хелперів/індукторів, СD-8 проти Т-супресорів/цитотоксичних клітин, СD-3 проти загальних Т-клітин, СD-72 проти В-лімфоцитів.
Виявилось, що під впливом ППКН та його синтетичних аналогів спостерігались зміни експресії специфічних рецепторів лімфоцитів. Стосовно СD-3 рецепторів зміни відбувались в бік їх збільшення. На експресію СD-4 рецепторів пептиди діяли різнонаправлено. Пептиди PEKDLRK та PEKDDRL підсилювали експресію лімфоцитів в 1,8 і 2,3 рази відповідно, а пептид PEKDSRK і ППКН практично не здійснювали впливу на рецепторний апарат. Пептид PEKDLRK підсилював експресію СD-8 рецепторів в 1,8 рази, інші пептиди не впливали на експресію СD -8 рецепторів. Вплив пептиду PEKDLRK на експресію СD-72 рецепторів відбувався аналогічно. Тільки цей пептид підсилював експресію в 3,2 раза, а інші пептиди суттєво не впливали на експресію СD-72 рецепторів лімфоцитів.
Ці зміни свідчать про здатність ППКН та його аналогів впливати на функціональну активність Т-клітин.
ППКН та PEKDLRK значно підвищували проліферацію лімфоцитів донорів, індуковану антигеном нирки та Кон-А.
Літературні дані щодо ефективності дії синтетичних пептидів при аутоімунних процесах та отримані нами результати про імунотропні властивості досліджених пептидів обгрунтували подальші дослідження.
Як експериментальну модель було використано нефрит Хеймана, який максимально наближений до мембранозної гломерулопатії у людей [Драник Г.Н. 1989; Natori Y et al. 1987]. Антигени, що відповідають за розвиток нефриту Хеймана, розташовані в клубочковій базальній мембрані, щітковій каємці. Великий інтерес викликає наявність перехресно реагуючих антигенів в щітковій каємці канальців нирок та коркової речовини тимусу [Bakler R.K. et al. 1987]. Патогенетична основа патології полягає в гранулярних відкладеннях імуноглобуліну G під епітелієм. Ці дані добре узгоджуються з нещодавніми повідомленнями про те, що пептиди, які моделюють епітоп Т-клітинного розпізнавання, здатні гальмувати розвиток аутоімунних захворювань [Кайдашев И.П. 1996].
Під час введення ППКН та його синтетичних аналогів було зареєстровано істотні зміни показників імунітету у щурів.
Пептид PEKDLRK стимулював бласттрансформацію лімфоцитів та фагоцитарну активність нейтрофілів. Пептид PEKDSRK підвищував кількість еритроцитів, гемоглобіну, а також стимулював бласттрансформацію лімфоцитів і фагоцитарну активність нейтрофілів. Пептид PEKDDRL підвищував кількість лімфоцитів.
Коефіцієнт маси нирок підвищували пептиди PEKDLRK та ППКН. Синтетичний аналог PEKDDRL істотно впливав на масу тімусу та селезінки, підвищуючи їх.
Введення всіх пептидів викликало в різній мірі нормалізацію морфологічної структури нирок, найбільш активними були пептиди PEKDLRK та PEKDDRL.
Наступним важливим питанням з точки зору фізіології та імунології було встановлення видоспецифічності дії фізіологічно активних речовин, що досліджувались. Для цього був змодельований аутоімунний нефрит на хом’яках.
Розвиток аутоімунного процесу на хом’яках призводив до порушення антиоксидантного захисту, зниження відсотка Т-клітин в 1,4 рази, зниженню фагоцитарної активності нейтрофілів в 1,5 рази та активності ЛКБ в них в 1,1 рази. Приверта увагу зниження кількості імунних комплексів у сироватці крові в 7,3 рази.
Пептиди, які ми вводили, сприяли нормалізації порушених процесів. ППКН підвищував відсоток моноцитів в 17,5 рази і зменшував кількість еозинофілів в 1,8 рази. Знижував відсоток Т- і В-клітин та коефіцієнт маси тимусу.
Встановлено, що регуляторні пептиди поряд з нервовою та гуморальною регуляцією мають імунологічну регуляцію фізіологічних функцій [Кузник Б.И. та співавтори 1998]. Доведено, що Т-лімфоцити втручаються в процеси репарації і регенерації тканин, виступають регуляторами еритропоезу, стимулють лейкопоез і тромбоцитопоез.
Не виключено, що імунологічна регуляція фізіологічних функцій здійснюється при безпосередній участі біологічно активних речовин.
Введення ППКН підвищувало фагоцитарну активність нейтрофілів в 1,5 рази, а також кількість в периферичній крові еритроцитів в 1,2 рази та вміст гемоглобіну в них.
Синтетичний пептид PEKDSRK сприяв підвищенню масу хом”яків в 1,4 рази та коефіцієнту маси нирок, збільшував фагоцитарну активність нейтрофілів в 1,5 рази, сприяв підвищенню концентрації циркулюючих імунних комплексів в 4,6 рази, впливав на гемопоез, підвищуючи не тільки кількість еритроцитів, а і вміст гемоглобіну в них.
Пептид PEKDLRK сприяв підвищенню кількості лейкоцитів в 1,3 рази. Зростала фагоцитарна активність в 1,9 рази, кількість циркулюючих імунних комплексів підвищувалась в 4,6 рази, зростала маса тварин в 1,3 раза. При цьому кількість еритроцитів збільшуалась, але без адекватного підвищення вмісту гемоглобіну.
Пептид PEKDDRL підвищував відсоток великих гранулярних лімфоцитів в 1,6 рази, зменшував в 3,8 рази відсоток еозінофілів в периферичній крові. Фагоцитарна активність нейтрофілів підвищувалась до 44% від 38,5% у контролі. Пептид сприяв підвищенню активності СОД в 1,2 рази. Підвищував не тільки кількість еритроцитів, але і вміст гемоглобіну в них.
Таким чином, всі вивчені нами пептиди виявляли біологічну активність, але в різній мірі. Найбільш активним був пептид PEKDDRL, його ефекти суттєво не відрізнялись від ППКН. Привертає увагу здібність пептидів, що вивчались, впливати на гемопоез, порушений в умовах ниркової патології. Це, можливо, свідчить про те, що ці пептиди здатні впливати на продукцію еритропоетинів. Крім того, є важливим факт, що нирки у внутрішньоутробному періоді виконують гемопоетичні функції. З тканин нирок дорослих організмів був виділений пептид, який є фрагментом епсилон-ланцюга гемоглобіну [Кайдашев И.П. 1995, 1996].
Порівняння біологічної активності ППКН та його синтетичних аналогів при аутоімунному нефриті у щурів та хом’яків доводить відсутність у цих біологічно активних речовин видоспецифічності, що підкреслює загально – біологічну роль цих речовин.
Під час розвитку аутоімунної відповіді на ниркові антигени (нефрит Хеймана) ППКН знижував її прояви, що спрямовані на антигени нирки, можливо, шляхом відновлення імунологічної толерантності.
Таким чином, отримані нами синтетичні пептиди – PEKDSRK, PEKDDRL, PEKDLRK – аналоги ППКН були здатні блокувати розвиток аутоімунного нефриту, але в різній мірі виявляли риси фізіологічно активних речовин.
Нами встановлено вплив пептидів на зміни морфологічних структур нирок при недосить тривалому їх введенні тваринам. Нормалізація порушених функцій забезпечується за рахунок гіперплазії та внутрішньоклітинних регенераторних (гіперпластичних) процесів.
Імунна система має функціональні зв’язки з іншими системами резистентності крові – коагуляційною та перекисним окисленням ліпідів разом із антиоксидантним захистом [Кузник Б.А. та співавтори 1989; Бокарев И.Н. та співавтори 1989; Мищенко В.П. та співавтори 1989], тому ми дослідили ці процеси в експерименті токсичного ураження фтористим натрієм.
Дані літератури свідчать про те, що фториста інтоксикація призводить до ураження нирок, серця, судинної стінки [Жирнов В.В. та співавтори 1983; Набиева Ш.Д. 1973; Новосельцева Т.В. 1982; Франчук К.Р. 1986], викликає цілий ряд морфологічних, біохімічних, коагуляційних та імунологічних змін в організмі [Антонян О.А. 1980; Soni M.G. et al 1984]. Накопичені факти дозволяють вважати, що в основі цитотоксичного впливу фтору лежить його здатність уповільнювати синтез білку у еукаріотів та стимулювати процеси перекисного окислення ліпідів біологічних мембран [Окунев В.Н. та співавтори 1985].
Отримані нами дані свідчать про те, що фториста інтоксикація призводить до пошкодження тканин нирок за рахунок підвищення ПОЛ, що відповідає літературним даним [Окнев В.Н., Жирнов В.В., 1985]. Це супроводжується зростанням активності субстратіндуцибельного ферменту СОД, а також зниженням активності церулоплазміну. Ці зміни були як в крові, так і в тканинах нирки.
Введення ППКН тваринам з токсичним ураженням фторидом натрію виявило такі основні риси дії: блокування зовнішнього шляху зсідання крові, блокування тромбіну та активація фібринолізу. Ці властивості дуже важливі з точки зору функціонального локального гемостазу [Kanfer A. 1984, 1989, 1990].
Під впливом ППКН підвищувалась резистентність еритроцитів до перекисного гемолізу, знижувались рівень ТБК-активних продуктів, накопичення МДА. Відновлювались показники активності ферментів АОЗ. Очевидно, зниження рівня ПОЛ в тканині нирок призводить до нормалізації мембран, відновлення процесів зсідання крові.
Поряд з нормалізуючим впливом на процеси ПОЛ, ППКН здійснював корегуючий вплив на процеси гемокоагуляції: подовжувався час рекальцифікаціі, протромбіновий час, АПТЧ.
Гіпокоагуляційний ефект препарату обумовлений зниженням рівня ПОЛ в крові і тканині нирок [Мищенко В.П. 1987]. Подібний ефект можливий за рахунок антитромбіну ІІІ, який заважає утворенню протромбінази і тромбіну.
Наступним завданням, яке стояло перед нами, було вивчення дії ППКН і його синтетичних аналогів в умовах гострого отруєння етиленгліколем та у віддалені строки токсичного ураження. Інтоксикація етиленгліколем є тяжким отруєнням, яке посилюється через швидке всмоктування в кров із шлунково-кишкового тракту. Через кілька годин відбуваються порушення в діяльності серцево-судинної системи, нирок, печінки [Шиманенко И.И. 1977].
Дія ППКН призводить до зниження гемолізу еритроцитів в 1,6 рази, а рівень ТБК-активних продуктів до і після інкубації зростав. Знижувався рівень бета-ліпопротеїдів і дієнових кон’югат, що супроводжувалося ще більшим зниженням активності СОД в 1,1 рази, каталази і церулоплазміну в 1,3 рази. У тканині нирки ППКН збільшує рівень ТБК-активних продуктів до інкубації, але зменшує приріст МДА. Знижується активність СОД.
Ці дані відповідають дослідженням Звягольської І.М. [1998], що поліпептидний препарат, який виділений з тканин нирок, володів біорегулюючою дією, нормалізував стан показників системи ПОЛ .
У віддалений термін токсичного ураження етиленгліколем спостерігались помірні, але стійкі порушення функцій нирок. Введення пептидів сприяло зменшенню маси тіла в усіх групах відносно контрольних тварин, що свідчить про нормалізацію видільної функції нирок. Введення експериментальним тваринам ППКН та його синтетичних аналогів призводило до посилення продукції еритроцитів та гемоглобіну, нормалізувало обмін нуклеїнових кислот та рівень перекисного окислення ліпідів в паренхімі нирок після токсичного ураження. Кожен з синтетичних пептидів, що вивчались, мав характерні особливості дії: PEKDSRK здійснював еритропоетинподібну дію, PEKDDRL впливав на лейкопоез та активність лейкоцитів, PEKDLRK виявився найбільш близким по дії до ППКН, і в ряді випадків виявляв найбільшу фізіологічну активність. Синтезовані пептиди-аналоги мають властивості потенційних фізіологічно активних речовин для профілактики наслідків токсичного ураження нирок.
В нирках існує локальна система пептидної регуляції, що забезпечує нормальне протікання метаболічних процесів, імунних реакцій і підтримання гемостазу. Аналіз еволюційного значення біологічно активних речовин [Кузник Б.И. 1988; Слепушкин В.Д. та співавтори 1987; Степанов М.А. 1988] дозволяє висунути припущення про наявність подібного принципу біорегуляції на всіх рівнях живої матерії, що підтверджує єдність регуляторних механізмів в біогенезі.
Таким чином, отримані результати демонструють взаємозв’язок між ПОЛ, АОЗ, гемостазом і імунною системою що утворюють єдину систему захисту організму, яка в значній мірі може бути опосередкована біологічно активними речовинами. Система поліпептидів відновлює не тільки функцію, а і структуру пошкоджених органів. Важливою властивістю природних регуляторів, що розглядаються, є їх здатність давати ефект в низьких концентраціях. Пептиди не накопичуються в організмі, мало токсичні. Не мають токсичності і продукти їх метаболізму – амінокислоти, аналогічні тим, що утворюються при розщепленні харчових білків [Ашмарин И.П. та співавтори 1991; Iwersen L.L. et al. 1980; Martinez J.L. et al 1981].
Висновки
1. Природний пептидний комплекс нирок та його синтетичні аналоги за фізіологічних умов здатні регулювати функційний стан лейкоцитів. Досліджені пептиди стимулюють фагоцитарну активність нейтрофілів: природний пептидний комплекс нирок – в 1,8 рази пептид PEKDDRL – в 1,7, PEKDLRK в 1,5 рази. Вони також регулюють експресію лімфоцитарних рецепторів СD- 3, 8, 72.
2. Природний пептидний комплекс нирок та його синтетичні аналоги в умовах порушення гемопоезу, внаслідок розвитку аутоімунного нефриту, виявляють еритропоетинподібну активність, збільшуючи кількість еритроцитів та вміст гемоглобіну в них.
3. Природний пептидний комплекс нирок, та його синтетичні аналоги за умов аутоімунного нефриту відновлюють стан імунної системи шляхом блокування імунної відповіді на тканинні антигени нирок.
4. Фізіологічна активність природного пептидного комплексу нирок та синтетичних пептидів PEKDDRL, PEKDLRK, PEKDSRK не має видоспецифічності за умов введення щурам, хом’якам та при внесенні у кров донорів.
5. При індукуванні експериментальних моделей, пов’язаних з вираженими порушеннями зсідання крові (інтоксикація етиленгліколем та фторидом натрію і аутоімунний нефрит), виявлена фізіологічна активність природного пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів, спрямована на блокування тромбіну, зростання рівня антитромбіну-ІІІ, підсилення фібринолізу.
6. В умовах індукції у тварин експериментальної патології з вираженими порушеннями процесів вільнорадикального окислення (фториста інтоксикація, аутоімунний нефрит) фізіологічна активність природного пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів виражалась у відновленні рівня антиоксидантних ферментів (СОД, каталази) в тканинах нирок та зниженні накопичення продуктів пероксидації (вміст МДА, та дієнових кон’югат), такі ж зміни відбувалися і в крові.
7. Порівняльний аналіз фізіологічної активності біологічно активних речовин, що досліджувалися, доводить, що найбільш активними є пептиди: PEKDSRK, якій має виражену метаболічну та еритропоетин-подібну дію, та PEKDDRL, якій відрізняється значними імунотропними властивостями.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:
1. Гейко О.А., Боброва Н.А., Кайдашев И. П. Сравнительное изучение активности естественного пептидного комплекса почек и его синтетических аналогов при аутоиммунном нефрите// Экспериментальная и клиническая фармакология.- 1998.- т.61, №4.- С.44-47.
2. Гейко О.А., Кайдашев И.П. Изучение терапевтическй активности синтетических пептидов – аналогов естественного пептидного комплекса почек на некоторые показатели гомеостаза у хомяков при аутоиммунном нефрите// Проблеми єкології та медицини.- 1997.-т. 1, №1-2.- С.24-26.
3. Ножинова О.А., Гейко О.А., Боброва Н.А., Бобович О.В., Рябенко В.В., Веснина Л.Э., Гаркович А.Л., Кайдашев И.П. Влияние пептидного комплекса печени на процессы апоптоза в клетках печени, индуцированные тетрахлорметаном// Проблеми єкології та медицини.- 1998.- т.2, №1-2.- С.4-7.
4. Гейко О.А., Баштовенко О.А., Звягольская И.Н., Кайдашева Э.И., Квак О.В., Беркало Л.В. Корригирующее действие синтетических пептидов – аналогов естественного пептидного комплекса почек на состояние организма крыс при аутоиммунном нефрите// Проблеми єкології та медицини.- 1999.- т.3, №1-2.- С.120-124.
5. Гейко О.А. Влияние естественного пептидного комплекса почек и его синтетических аналогов на некоторые показатели иммунитета и перекисного окисления/ Матеріали конференції молодих вчених “Фізіологія і патологія перекисного окислення, гемостазу та імуногенезу”, м. Полтава, 1998 р.// Проблеми єкології та медицини.- 1999.- т.3, №1-2.- С.26-27.
6. Гейко О.А., Кайдашев И.П., Звягольская И.Н., Баштавенко О.А., Соколенко В.Н., Веснина Л.Э., Беркало Л.В. Влияние природного пептидного комплекса почек и его синтетических аналогов на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов доноров// Проблеми єкології та медицини.- 1999.- т.3, №3-4.- С.94-95.
Гейко О.О. Фізіологічна активність природного пептидного комплексу нирок та його синтетичних аналогів в умовах норми та при експериментальних її порушеннях. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини та тварин. – Українська академія аграрних наук, Інститут свинарства УААН, Полтава, 1999.
Вивчена фізіологічна активність природного пептидного комплексу нирок (ППКН) та його синтетичних аналогів: PEKDSRK, PEKDLRK, PEKDDRL при внесенні в кров донорів in vitro в умовах фізіологічної норми та аутоіммунного нефриту на двох видах тварин, а також при фтористій інтоксикації та ураженні етиленгликолем. Указані пептиди не мають видоспецифічності дії.
В крові донорів in vitro пептиди здійснювали вплив на Т-клітинну ланку імунітету. ППКН та його синтетичні аналоги сприяли збільшенню експресії CD-3,4,8,72 молекул на поверхні лімфоцитів, посилювали проліферацію лімфоцитів та фагоцитарну активність нейтрофілів.
При аутоімунному нефриті пептиди блокували аутоімунну відповідь на антигени, проявляли еритропоетинподібну активність.
При різних видах інтоксикації етиленгліколем здійснювали регуляторну дію на процеси регенерації та репарації, нормалізували коагуляційний потенціал крові, обмін нуклеінових кислот та процеси перекисного окислення ліпідів в тканинах нирок. За умов інтоксикаціі фтористим натрієм відновлювали показники гемостазу.
Таким чином, пептиди нирок мають важливе значення в підтримці фізіологічного стану нирок та цілісного організму.
Ключові слова: пептиди, нирки, фізіологічна активність, вільно- радикальне окислення, імунітет, гемостаз.
Гейко О.А. Физиологическая активность природного пептидного комплекса почек и его синтетических в норме и при экспериментальных ее нарушениях. – Рукопись.
Дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Украинская академия аграрных наук, Институт свиноводства УААН, Полтава, 1999.
Изучена физиологическая активность природного пептидного комплекса почек (ППКП) и его синтетических аналогов: PEKDSRK, PEKDLRK, PEKDDRL при внесении в кровь доноров in vitro, в условиях аутоиммунного нефрита на крысах и хомяках. При фтористой интоксикации и поражении этиленгликолем.
При внесении в кровь доноров in vitro в тестах розеткообразования пептиды оказывали функциональную активность на иммунокомпетентные клетки, увеличивали количество Е-РОЛ теофилин-чувствительных клеток и
активность лизосомальных катионных белков в нейтрофильных лейкоцитах. Показатели М-РОЛ практически не менялись. Колическтво Е-РОЛ теофилин-резистентнх уменьшалось. ППКП и его синтетические аналоги оказывали свое влияние на Т-клеточное звено иммунитета и практически не влияли на В-лимфоциты.
Исследуя влияние ППКП и его синтетических аналогов на экспрессию поверхностных рецепторов лимфоцитов, выявили, что данные физиологически активные вещества влияют на экспрессию поверхностных маркеров лимфоцитов. Изучение проводилось с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител CD-3 против общих Т-лимфоцитов, CD-4 против Т-хелперов/индукторов, CD-8 против Т-супрессоров/цитотоксических клеток, CD-72 против В-лимфоцитов.
Установили, что вводимые пептиды способствовали увеличению экспрессии CD-3,4,8,72 молекул на поверхности лимфоцитов. А так же усиливали пролиферацию лимфоцитов, индуцированную Кон-А и антигеном почки. ППКП и его аналоги оказывали устойчивый эффект на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов в сторону повышения.
Для изучения физиологической активности пептидов почек, направленной на регуляцию активности иммунной системы, была выбрана модель аутоиммунного нефрита. А воспроизведение его на хомяках и крысах, а так же при внесении в кровь доноров проведено для установления видоспецифичности действия пептидов почек.
Изучаемые пептиды блокировали аутоиммунный ответ на тканевые антигены почек, обеспечивая физиологическую иммунологическую толерантность. Стимулировали фагоцитарную активность нейтрофилов, проявляли эритропоэтинподобную активность, увеличивая число эритроцитов и гемоглобина в них.
Не проявляли видоспецифичности действия при внесении в кровь доноров и при проведении исследований на разных видах животных.
Пептиды почек оказывали регуляторное действие на процессы регенерации и репарации при различных видах интоксикации этиленгликолем. Нормализовали коагуляционный потенциал крови. Способствовали снижению спонтанного гемолиза эритроцитов, активности супероксиддисмутазы, снижали уровень церулоплазмина и процент прироста малонового диальдегида в тканях почек. Пептиды PEKDSRK, PEKDLRK и ППКП нормализовали обмен нуклеиновых кислот и процессы перекисного окисления липидов в тканях почек.
Фтористая интоксикация вызывала грубые нарушения процессов перекиского окисления липидов и антиоксидантной защиты. Развитиию гиперкоагуляции на фоне снижения антикоагулянтной активности и активности ферментов фибринолитической системы.
ППКП увеличивал активность антитромбина ІІІ, время рекальцификации и тромбиновое время. Участвовал в поддержании уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в тканях почек.
Таким образом, пептиды почек имеют важное значение в поддержании физиологического состояния почек и целостного организма.
Ключевые слова: пептиды, почки, физиолгическая активность, свободно радикальное окисление, иммунитет, гемостаз.
Geico O.A. “Physiological activity of natural peptide complex of the kidneus and its synthetic analogs im autoimmune and toxic viclations of kidneys”. Manuscript.
The dissertation on completition of a scientific degree of the Candidate of Biological scinces on a speciality 03.00.13 – Human and Animals Phisiology.- Ukrainian academy of agrarian sciendes, Poltava Research Institute for pig-breeding. Poltava, 1999.
Ihere was studied physiological activity of natural peptide complex of kidneys (NPCK) and its syntetic analoges PEKDDRL, PEKDLRK, PEKDSRK in intcoducing into the donor’s blood in vitro in condition phisiologycal norma and of autoimunic nephritis on two spectes of animals as well as in fluoride intoxication and ethyleneglycol.
When intkoducing into the donor’s blood in vitro in tests of rosulaformation peptides revealed their functional activity on the immunocompetent cell.
NPCK and its syntetic analogys assist in increasing of expression CD-3,4,8,72 molecules on the surface of lymphocytes, strenthen lymphocytes proliferation and ed phagocytic activity of neutrophiles.
Peptides blocked the autoimmunic response an antigenes, displayed erythropoietinslike activity.
The kidneys peptide fulfil regulation in the process regeneration and reparation in different types of intoxication. They normaliget coagulative potential of blood. Normalised metabolisms of nucleic acids and processes of lipid peroxidation in the tissues of kidneys.
Fluoride intoxication caused disturlances in the processes lipid peroxidation, antioxidant protection and hemostasis.
Thus, peptides of kidneys have the important significance in supporting of physiological condition of kidneys and the body entierly.
Key words: peptides, kidneys, phisiological activity, free radical oxidation, immunity, hemostasis.
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
